山羊PHKG1基因克隆及其表达特性分析

为获得山羊PHKG1基因序列,明确其生物学特征,阐明其在山羊各组织及诱导分化不同阶段皮下和肌内脂肪细胞中的表达特性,以简州大耳羊为试验动物,屠宰后采集心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、背最长肌、皮下脂肪等组织样品,提取组织中总RNA,利用RT-PCR方法克隆山羊PHKG1基因序列,利用各种在线工具分析其生物学特性,利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)技术检测其在各个组织及不同分化阶段的前体脂肪细胞中的表达水平。结果显示,克隆得到的山羊PHKG1基因序列1 233 bp,其中CDS区1 164 bp,共编码387个氨基酸,形成无信号肽的不稳定亲水酸性非跨膜蛋白,亚细胞定位显示其主要存在细胞质中;山羊PHKG1氨基酸序列与绵羊、牛、猪、马、人的相似性均在90%以上,说明该基因在不同物种中具有较高保守性;构建进化树显示,山羊和绵羊在同一分支,符合物种进化规律;组织表达谱显示,PHKG1基因在山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、背最长肌、皮下脂肪中广泛表达,且在背最长肌中表达水平最高(P0.01),时序表达谱显示,PHKG1基因在成脂诱导分化60 h的肌内脂肪细胞和96 h的皮下脂肪细胞中的表达水平分别显著(P0.05)和极显著(P0.01)高于前体脂肪细胞中的表达水平。结果可为进一步研究PHKG1在山羊脂肪细胞分化过程中的作用奠定基础。     

过表达山羊APOC3基因促进肌内脂肪细胞分化

为了明确APOC3基因在山羊肌内脂肪细胞分化中的作用，采用RT-PCR技术克隆山羊APOC3基因序列，并通过在线软件进行生物信息学分析；利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测山羊APOC3基因在各组织和不同分化阶段的肌内脂肪细胞中的表达规律；在利用双酶切法构建山羊APOC3过表达载体的基础上，利用油红O染色确定山羊APOC3基因过表达对肌内脂肪细胞脂滴聚集的影响，同时利用qPCR方法检测成脂分化标志基因mRNA的相对表达水平，进而明确其可能发挥作用的途径。结果表明，获得山羊APOC3的ORF区长294 bp,编码97个氨基酸，功能结构域区在第23—88个氨基酸处。山羊APOC3在心脏、肝脏、脾脏等14个组织中均有表达，且在肝脏中的表达量最高；山羊APOC3在诱导分化48 h表达量最高，极显著高于分化前；过表达山羊APOC3后肌内脂肪细胞中脂滴积聚增多，成脂分化标志基因SREBP1和CEBPβ的相对表达水平极显著上调，PPARγ的相对表达水平显著上调，而Pref-1相对表达水平显著下调。结果表明，山羊APOC3可能通过上调SREBP1、CEBPβ、PPARγ及下调Pref-1来发挥作...     

棉花GhMYB0基因的克隆、表达分析及功能鉴定

MYB类转录因子是植物转录因子最大的家族之一, 参与控制植物腺毛细胞的模式和形态建成。本研究利用雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii) D₅基因组数据库以AtMYB0 (GL1, NM_113708)蛋白为参比序列获得同源基因GrMYB0, 从徐州142中克隆了陆地棉的GhMYB0, 其开放阅读框长度为843 bp, 编码280个氨基酸。经过保守结构域分析和亚细胞定位确定GhMYB0为R2R3-MYB转录因子。qRT-PCR的结果表明, GhMYB0在徐州142开花当天开始高调表达, 开花后20 d表达量达高峰; 在所有的组织器官中, 花中表达量最高, 其次为胚珠。转基因功能分析结果表明, 在野生型拟南芥(Columbia)中过表达GhMYB0, 使其叶片表皮毛与野生型相比明显减少; 该基因在拟南芥突变体gl-1中过表达, 能恢复表皮毛缺失型突变体的表型, 说明该基因可能对拟南芥表皮毛的形态建成发挥一定作用, 本试验为研究R2R3-MYB转录因子在棉纤维起始和伸长过程中的调控作用提供有力证据。     

山羊APOE基因克隆及组织细胞表达模式分析

旨在克隆山羊载脂蛋白E(Apolipoprotein E,APOE)基因序列并进行生物信息学分析,明确APOE基因在山羊各组织及分化前后脂肪细胞中的表达模式,利用RT-PCR及3′RACE方法克隆山羊APOE基因序列,利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)方法检测该基因在山羊心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪等13个组织中的表达水平以及在皮下前体脂肪细胞成脂分化过程中的表达变化情况。结果表明,RT-PCR方法获得山羊APOE基因序列970 bp,其中ORF 951 bp,5′UTR 7 bp,3′UTR 12 bp(GenBank登录号:MN049956);3′RACE法获得3′UTR 152 bp(登录号:MN049957);Targetscan和Mirbase预测得知miR-22-3p可能靶标山羊APOE基因;蛋白预测显示山羊APOE编码316个氨基酸,是一个具有信号肽、无跨膜结构域的不稳定酸性蛋白;亚细胞定位结果发现APOE在细胞外、细胞质、液泡、细胞核以及内质网中均发挥生物学作用;进化树显示该基因在各物种的同源性较高,与绵羊、藏羚羊和牛的亲缘关系最近;基因组织表达谱显示山羊APOE在皮下脂肪中的表达量最高,极显著高于其他组织(P0.01);时序表达结果显示随着皮下前体脂肪细胞分化的进行,APOE基因表达呈上升趋势且在诱导分化60 h时表达量最高。结果为最终进一步揭示APOE基因在脂肪细胞分化、脂肪沉积及脂质代谢中的作用提供了基础理论数据。     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白N基因的真核表达及鉴定

根据GenBank发表的犬瘟热病毒N基因全序列,设计合成了1对特异扩增CDV N基因的引物。以山东泰安分离的CDV-FOX-TA株细胞毒中提取病毒RNA来制模板,利用RT-PCR扩增出了1.6kb的N基因,将其克隆到pIREShyg载体上,构建了pIRES-N真核表达载体。然后通过磷酸钙共沉淀法转染CHO-K1细胞,通过潮霉素筛选得到阳性克隆,间接免疫荧光实验（IFA）鉴定N基因在CHO细胞中的表达,并用RT-PCR方法从转录水平证实N基因在CHO-K1细胞中的表达,最终建立了CHO/ CDV-N细胞株,为犬瘟热病毒的血清学检测和基因疫苗的研制奠定了基础。     

棉花GhRDL1基因启动子分析

通过PCR法扩增出陆地棉GhRDL1基因ATG上游1.2 kb的片段,将该片段融合GUS报告基因进行棉花、拟南芥及烟草转化。分析显示,GhRDL1基因启动子是一个棉纤维或表皮毛特异的启动子,能够驱动靶基因在单细胞的表皮毛(如棉纤维和拟南芥表皮毛)表达;在烟草表皮毛中,GUS基因在多细胞的腺毛(包括顶端的腺体细胞和柄细胞)和非腺毛中皆有表达。表明GhRDL1基因启动子是一个多功能的表皮毛特异启动子,可以用于棉花基因工程改良和植物次生代谢工程的研究。     

口蹄疫病毒3D基因真核表达载体pEGFP-3D的构建及其融合蛋白分子在BHK细胞中的定位

为研究口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因的分子生物学特性及定位,构建了3D基因真核表达载体pEGFP-3D,观察了3D在BHK-21细胞中的瞬时表达情况.从重组质粒pMDl8.T-3D扩增到3D基因,与pGEM-T easy载体连接,将鉴定为阳性的重组质粒pGEM-3D与表达载体pEGFP-N1分别经Barn H Ⅰ/Hind Ⅲ酶切,进行定向亚克隆;重组表达质粒pEGFP-3D经PCR、酶切鉴定.阳性质粒进行测序.利用脂质体介导阳性pEGFP-3D质粒转染BHK-21细胞.免疫组化检测转染细胞中3D基凶表达情况和3D基因在细胞中的定位,Western blotting验证pEGFP-3D融合基因的表达.结果表明,成功构建了重组表达质粒pEGFP-3D,并在BHK-21细胞中进行了表达.免疫组化分析表明,3D蛋白主要定位于细胞核;Western blotting证实pEGFP-3D融合蛋白在80 kDa处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性.pEGFP-3D表达载体转染细胞后很快就能通过观察荧光蛋白而检测出基因的瞬时表达情况,为基因转染研究中确定转染效率、3D的表达情况及蛋白定位等提供了直观的靶标,有望应用于FMDV聚合酶分子的生物学特性研究.     

黄芪多糖(APS)拮抗铅镉联合致鸡脾脏细胞凋亡作用的研究

为了探讨黄芪多糖注射液对铅镉联合致鸡脾脏细胞凋亡的拮抗作用。采用TUNEL法、RT-PCR和DNA ladder方法检测分别对对照组、铅镉组和黄芪多糖-铅镉组的鸡脾细胞凋亡率和脾淋巴细胞凋亡基因Bcl-2 mRNA转录水平。结果表明：与对照组比较,试验组的细胞凋亡率明显升高,Bcl-2mRNA表达水平降低;试验组和对照组差异显著或差异极显著,并且黄芪多糖-铅镉组数据介于对照组和铅镉组之间。试验结果显示：黄芪多糖注射液对铅镉联合致鸡脏脾细胞凋亡具有明显的拮抗作用。     

山羊KLF5基因生物学特征与时空表达分析

为阐明KLF5在山羊不同组织和不同诱导分化阶段的肌内脂肪细胞中的表达特性,利用降落PCR克隆山羊KLF5基因cDNA序列,通过各种在线工具分析山羊KLF5基因的生物学特征,利用实时荧光定量PCR技术分析KLF5基因在山羊不同组织和不同诱导分化阶段的肌内脂肪细胞中的表达水平。结果表明,克隆获得山羊KLF5基因序列1 735 bp,其中包括1 365 bp完整的开放阅读框(ORF)、8 bp的5′非翻译区(UTR)和362 bp的3′UTR。蛋白预测显示,山羊KLF5编码454个氨基酸,合成不具有跨膜结构和信号肽的不稳定的亲水性蛋白。组织表达谱显示KLF5基因在山羊心、肝、脾、肺、肾、背最长肌、皮下脂肪和腹间脂肪等组织中均有表达,但在肺组织中的表达量较高,显著高于除腹间脂肪外的其他组织中的表达(P0.05)。同时,细胞时序表达谱表明KLF5在分化的山羊肌内脂肪细胞中的表达水平均高于肌内前体脂肪细胞中的表达水平,且在诱导分化第5天时的表达量最高,显著高于第0天的表达量(P0.05)。研究结果发现,具有3个锌指结构域等复杂结构的KLF5蛋白可能在山羊肌内脂肪细胞分化后期发挥正向的调控作用,并促进山羊肌内脂肪沉积。     

山羊KLF9基因克隆及在组织细胞中的表达

旨在克隆山羊Kruppel样转录因子9(Kruppel-like factor 9,KLF9),阐明其在山羊各组织及其脂肪细胞中的表达模式,为深入探究KLF9基因对山羊肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)沉积的调控作用奠定理论基础。利用胶原酶消化法获得7日龄简州大耳羊羔羊肌内前体脂肪细胞。选成年简州大耳羊与藏山羊各4只,用RT-PCR法克隆山羊KLF9基因,用实时荧光定量PCR方法检测KLF9基因在山羊背最长肌、股二头肌、臂三头肌、皮下脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织中的相对表达水平及KLF9基因在成脂诱导分化0,2,4,6 d的前脂肪细胞中的表达水平。结果显示,获得山羊KLF9基因全长891 bp,其中包括CDS区735 bp,5'UTR序列86 bp,3'UTR序列70 bp,编码244个氨基酸。山羊KLF9氨基酸序列与藏山羊相似性为99.73%,与牛、猪、人、鼠的相似性高达99.18%~97.54%。组织表达结果显示,简州大耳羊肝脏和皮下脂肪的KLF9基因相对表达量极显著高于其他各个组织(P0.01);藏山羊肺脏的KLF9基因表达水平极显著高于其他各个组织(P0.01)。细胞表达检测发现,成脂诱导2 d的KLF9基因前脂肪细胞表达水平极显著高于诱导分化前(P0.01)。在获得山羊KLF9基因序列基础上,发现了其组织表达模式具有品种特异性,推测其可能在山羊前体脂肪细胞分化早期发挥调控作用。     

山羊FGF9基因克隆及其在成肌细胞分化中的表达模式研究

旨在克隆山羊FGF9基因序列并对其进行生物信息学分析,阐明FGF9基因组织表达特性及其在成肌细胞分化过程中的表达差异。试验动物为简州大耳羊,利用RT-PCR技术克隆FGF9基因序列,再用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测FGF9在山羊各组织中的表达特性及其在成肌细胞不同分化阶段的表达情况。结果显示,克隆得到山羊FGF9基因序列818 bp,其中ORF区627 bp,编码208个氨基酸,其CDS区核苷酸序列与牛和绵羊有99%的同源性。FGF9蛋白具有1个跨膜结构域和1个FGF家族同源性结构域,为不稳定亲水蛋白。FGF9基因在山羊各组织中均有表达,在肾脏中表达水平最高,极显著高于其他组织(P0.01)。FGF9基因在诱导分化第2天表达水平显著高于分化前(P0.05),且在第4天达到极显著水平(P0.01)。推测其可作为调控山羊成肌细胞分化的候选基因。为进一步探究FGF9基因在山羊肌肉生长中的作用提供理论依据。     

中国红豆杉中WRKY转录因子基因克隆及其对紫杉烷合成的调控

WRKY是一类专一结合W-box序列的转录因子,它对植物抗病、损伤、衰老等生物学过程起到调控作用,尤其是在植物次级代谢物质合成中起到了重要调控作用。本研究采用中国红豆杉细胞转录组数据库序列设计引物,从中国红豆杉基因组中克隆转录因子基因TcWRKY26,该基因大小为2 202 bp;构建pBI121超表达载体,转化农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导转化红豆杉细胞,继而基于RT-qPCR技术对表达体系进行基因表达量的检测分析,发现转录因子基因明显超表达,相对表达量提高了2.92～3.49倍,紫杉烷合成相关酶dbat基因也有明显的超表达,相对表达量提高了1.78～2.03倍,说明TcWRKY26基因对dbat基因有明显的上调作用,继而为构建高产、稳定的红豆杉基因改良细胞株提供参考依据。     

水稻转录因子基因SUSIRI的过表达及RNA干扰对水稻分子及表型效应的分析

在克隆到水稻转录因子基因SUSIRI的基础上,构建其过表达及RNA干扰载体进行水稻的遗传转化。由潮霉素筛选及分子检测得到的T0代植株经大田栽植,共有34株过表达及46株RNA干扰植株获得T1代转基因种子。继续种植T1植株收获T2代种子,同时用半定量RT-PCR分析苗期及穗期野生型水稻中SUSIRI基因的时空表达谱并比较过表达及RNA干扰植株的SUSIRI基因在叶片及幼穗中的表达状况,发现过表达植株与野生型对照的基因表达基本相同,但RNA干扰植株的表达受到明显抑制。对过表达及RNA干扰植株稻穗性状考察表明:与野生型对照相比,无论是过表达还是RNA干扰,转基因植株的穗粒数、结实率降低,RNA干扰植株表现得尤为严重(P<0.05),但对水稻谷粒粒重的影响并不显著(P>0.05)。SUSIRI基因的过表达未出现使稻穗性状明显改良的株系,而RNA干扰会导致水稻的结实能力严重降低。     

小麦糖基转移酶基因TaUGT73D1的克隆及表达分析

为探讨TaUGT73D1基因在小麦花发育过程中雄蕊和雌蕊形成的作用,本研究利用小麦三雌蕊突变体TP和雄蕊同源转化型不育突变体HTS-1两个品种,从中克隆得到了TaUGT73D1(UDP-glycosyltransferase73D1)的3个同源基因TaUGT73D1-2A、TaUGT73D1-2B、TaUGT73D1-2D,通过基因碱基序列分析表明TaUGT73D1-2A、TaUGT73D1-2B、TaUGT73D1-2D基因序列全长分别为1 907 bp、1 912 bp、1 905 bp,开放阅读框分别为1 365 bp、1 467 bp、1 461 bp,分别编码454、488、486个氨基酸残基,通过与小麦基因组比对,发现这3个同源基因分别位于染色体2AL、2BL、2DL上。TaUGT73D1-2A、TaUGT73D1-2B、TaUGT73D1-2D与乌拉尔图小麦Tu UGT73D1的编码区相似度分别为97.68%、96.52%、99.05%,蛋白序列相似度分别为73.57%、95.08%、95.70%。系统进化分析表明,该类基因与单子叶植物的UGT基因聚在一起,表明其亲缘关系较近,而与双子叶植物相隔较远,表明其亲缘关系较远。利用Real-time PCR分析TTaUGT73D1-2A、TaUGT73D1-2B、TaUGT73D1-2D基因在不同花器官雌蕊(P)、雄蕊(S)及雌蕊化雄蕊(PS)中表达模式。结果表明,该类基因在雄蕊中表达量最高,在雌蕊及雌蕊化中几乎不表达。因此推测TaUGT73D1基因可能与小麦雄蕊同源转化为雌蕊性状有关。本研究为进一步探讨小麦TaUGT73D1基因的功能提供了理论依据。     

山羊FGF5基因单核苷酸多态性群体遗传学分析

为了研究成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因在山羊被毛生长中的的作用,进一步寻找与山羊被毛生长相关的遗传标记,为山羊绒毛性状的标记辅助选择和育种提供一定的理论依据,根据人和小鼠成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因的同源序列设计引物对山羊基因组进行PCR扩增,将扩增片段进行克隆和测序,并与人和小鼠的成纤维细胞生长因子5基因序列进行同源性比较,确定扩增的片断为山羊的FGF5基因片断。采用PCR-SSCP技术分析了FGF5基因外显子在内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊和文登奶山羊品种的多态性,结果表明:FGF5基因在P1和P2引物扩增片段中存在PCR-SSCP多态性,而在P3和P4中没有发现多态。经克隆测序分析,位于外显子1的引物1内存在A→G突变;引物2中发生了碱基序列C→T的突变,这2个突变位点均没有引起编码氨基酸的改变,属于同义突变。对不同山羊品种的基因型和基因频率统计结果表明,引物1中内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊、文登奶山羊均以等位基因B为主,且不同群体均处于Hardy-Weinberg平衡;引物2中内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊均以等位基因E为主,而文登奶山羊的基因型频率与其他品种有显著差异;内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊在引物2位点的基因频率处于Hardy-Weinberg不平衡状态,而文登奶山羊的基因频率处于Hardy-Weinberg平衡状态。     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的克隆表达

为了研究不同时间段细胞MHC分子表达的变化情况,从分子水平上说明E2基因与NHC之间的关系,本研究克隆了中国猪瘟病毒强毒石门毒株E2基因,构建了pcDNA3.0真核表达质粒P-E2基因。限制性内切酶进行双酶切和序列分析鉴定E2基因插入位置、方向和读码框架的正确性。构建成功的真核表达质粒P-E2,用脂质体转染方法瞬时转染进行体外细胞表达,转染后24,48 h后用Western-blot和间接免疫荧光技术检测P-E2基因质粒在PK-15细胞内的表达情况。结果表明：用His抗体进行间接免疫荧光检测发现E2基因得到表达,并定位于细胞浆,同时Western-blot检测后发现重组质粒P-E2转染后也在PK-15细胞中得到了表达。为进一步研究猪瘟病毒与宿主细胞之间的关系,病毒的致病机理提供了基础材料。     

过表达NtHD20降低烟草腺毛密度

为解析NtHD20 (LOC107765920)基因对烟草腺毛发育的功能,将NtHD20在烟草(Nicotiana tabacum cv. Xanthin)中过表达,观察腺毛形态及数量变化,检测腺毛密度调控基因表达水平,测定内源激素含量。结果表明,NtHD20在烟草花中表达量最高,根中最低,表达具有组织特异性;过表达植株中烟草腺毛密度显著降低,腺毛密度正调控基因NtMYB123-like (LOC107773379)、NtWo-like (LOC107766155)与NtabSPL6-1 (LOC1-07789814)表达量分别为野生型植株的0.14、0.48与0.49倍,负调控基因NtCycB2 (Nitab4.5-0014697g0010.1)为野生型植株1.77倍,同时烟草ABA与JA含量显著降低,分别为野生型植株的0.56与0.16倍。表明NtHD20是烟草腺毛发育的负调控因子,可能通过ABA与JA两种激素协同介导下调腺毛发育重要基因(abSPL6-1,MYB123, Wo),同时上调细胞周期蛋白基因NtCycB2,从而降低烟草腺毛密度。     

陆地棉GhCRE1影响种子萌发初探

为明确陆地棉细胞分裂素受体基因(GhCRE1)在调控植物生长发育中的功能,为研究陆地棉GhCRE1基因调控种子萌发的分子机理提供材料,进一步从分子水平上提高种子萌发率,通过克隆陆地棉GhCRE1基因,利用基因过表达技术将该克隆片段连接至含Ubiquitin启动子的pCUbi1390载体上构建该基因的过表达载体,同时利用CRISPR/Cas9基因编辑技术设计拟南芥CRE1基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列,从而构建拟南芥CRE1基因靶向敲除载体。将以上2种载体转化农杆菌,使用花序浸染法,以拟南芥为受体材料创建GhCRE1过表达株系及基因编辑功能缺失突变体。接着利用PCR技术和qPCR技术筛选鉴定获得过量表达的GhCRE1拟南芥株系及CRE1功能缺失的拟南芥株系并收获种子,经过对比统计收获的种子与野生型种子在1/2MS培养基上的萌发势进行表型分析,进一步明确陆地棉GhCRE1基因影响种子萌发的功能。结果显示,本研究成功获得了拟南芥GhCRE1过表达株系及CRISPR基因编辑功能缺失突变体株系,且通过数据整理后发现,在种子萌发第2天时,相比野生型,2个过表达转基因株系萌发势分别提...     

NDPK1在细胞分裂中的功能分析

为明确NDPK1在细胞分裂过程中的作用及作用机制,本研究利用过表达技术,分析过表达NDPK1转基因拟南芥的株高和茎粗;用扫描显微镜观察比较过表达NDPK1转基因拟南芥细胞大小和形态、统计单位面积中细胞数目;利用RT-PCR技术,检测过表达NDPK1转基因拟南芥中细胞分裂相关基因的表达情况,初步分析NDPK1对细胞周期的调控机理。结果表明:过表达NDPK1转基因拟南芥下胚轴长度高于Col-0野生型拟南芥;过表达NDPK1转基因拟南芥的下胚轴细胞数目多于Col-0野生型拟南芥;过表达NDPK1中细胞分裂的促进因子CDC2和CycD2的表达量明显高于Col-0野生型拟南芥。以上结果表明,NDPK1可通过调控CDC2和CycD2的表达进而促进细胞分裂。