烟草NtCYP734A1基因的克隆及表达分析

油菜素内酯是一种参与胁迫响应的甾醇类植物激素,CYP734A1基因是油菜素内酯代谢通路上的关键基因。为探索CYP734A1基因在烟草响应非生物胁迫时发挥的功能,本研究以普通烟草品种K326为材料,克隆CYP734A1基因,通过生物信息学技术分析NtCYP734A1蛋白的理化性质及进化关系,运用实时荧光定量法分析CYP734A1基因在不同组织、不同非生物胁迫处理下的基因表达模式。结果表明,CYP734A1基因全长1 638 bp,编码545个氨基酸;亚细胞定位预测NtCYP734A1蛋白存在于内质网。qRT-PCR分析表明,烟草CYP734A1基因在不同组织均有表达,叶中表达量最高,茎中的表达量最低。非生物胁迫处理下,CYP734A1基因在各组织的表达量显著改变,在干旱、盐和低温胁迫下根的CYP734A1基因表达上调;在干旱、盐、高温和低温共4种胁迫下,叶中CYP734A1基因表达下调。     

盐生植物小花碱茅外整流K~+通道PtSKOR基因的克隆及RNAi载体构建

为研究盐生植物小花碱茅(Puccinellia tenuiflora)耐盐的分子机制,本研究根据已克隆到的Pt SKOR基因片段,利用RACE技术得到小花碱茅Pt SKOR的3'和5'c DNA序列,拼接后的基因全长为2 353 bp,编码715个氨基酸,系统进化分析显示Pt SKOR编码外整流K+通道。在此基础上,采用酶切连接的方法,构建了Ca MV 35S启动子驱动的含Pt SKOR基因片段反向重复序列的Pt SKOR-RNAi植物表达载体。     

烟草SKP1基因cDNA的克隆分析及原核表达

应用DDRT-PCR法获得可被壳寡糖诱导的枯斑三生烟SKP1基因cDNA的3’端序列,通过5’ RACE扩增该基因cDNA的5’ 端,进而扩增此基因cDNA的全长,通过同源性比较分析,与本塞姆氏烟草的SKP1基因同源性达81%,其cDNA全长653 bp(GenBank登录号：AY702087),其中编码区位于73~540 bp,编码一条155个氨基酸的多肽。经预测该多肽的分子量为17 527.78 Da,等电点为4.57,定位于细胞质,功能结构域分析结果显示在4~105位氨基酸有一明显的Skp1结构域,其E值为1.25e-52,因此推断该基因为枯斑三生烟的SKP1基因。将该基因编码区亚克隆到原核表达载体pET23b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达出与预测分子量一致的蛋白。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

烟草NtGAI基因的克隆及生物信息学分析

赤霉素是重要的植物内源激素,参与植物生长发育中的多个环节。赤霉素可影响烟草中烟碱生物合成,DELLA蛋白为赤霉素信号路径中的一个重要的负调控因子。本研究从烟草(Nicotiana tabacum)基因组中鉴定并克隆到一个烟草DELLA基因NtGAI,该基因CDS长为1 767 bp,编码587个氨基酸。生物信息学分析表明,NtGAI基因没有内含子,其编码的蛋白具有典型的DELLA蛋白结构域,是一个没有跨膜结构的疏水蛋白。聚类分析显示烟草NtGAI与林烟草(Nicotiana sylvestris)及辣椒具有较近的亲缘关系。本研究将为研究烟草中赤霉素调控路径提供有价值的参考数据。     

陆地棉水通道蛋白GhNIP6.1基因的克隆及表达分析

根据EST拼接的序列设计引物,利用RT-PCR技术,从陆地棉品种苏棉18中克隆获得了一个水通道蛋白基因GhNIP6.1。该基因开放阅读框包含903个核苷酸,编码300个氨基酸,分子量为30.97kD,理论等电点为8.99。GhNIP6.1蛋白的生物信息学分析表明:GhNIP6.1含有6个跨膜区,由5个环相连,其中环A、C和E在细胞膜外,环B、D和蛋白的N、C末端都位于细胞膜内,N末端79个氨基酸,C末端18个氨基酸,具有MIP家族典型的保守氨基酸序列;该蛋白的三级结构同拟南芥的AtNIP6.1非常相似,亚细胞定位也同AtNIP6.1一致,可能位于质膜中。进化分析发现,GhNIP6.1蛋白同拟南芥的AtNIP6.1蛋白相似性最高。进一步扩增棉花核基因组获得了2021bp的DNA序列,它包含5个外显子和4个内含子,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则。半定量分析表明,该基因在根、茎和叶中都有表达,其中真叶含量较高,子叶中没有表达。     

烟草IspH基因的克隆与原核表达

IspH基因作为MEP途径中的关键酶具有促进下游萜类化合物产量的积累和提高植物对外界的抵御能力的特定作用,本研究旨在通过对烟草中IspH基因进行克隆与原核表达分析,从野生型烟草中提取总RNA,通过RT-PCR克隆获得IspH基因的cDNA序列(NCBI登录号:KC480443),序列分析表明,IspH基因的开放阅读框(...     

烟草过氧化物酶基因NtPOD1的克隆及表达模式分析

为烟草过氧化物酶基因的功能及结构研究奠定理论基础,采用同源克隆的方法,从烤烟品种K326中克隆出了过氧化物酶基因Nt POD1的c DNA全长,并进行了生物信息学分析;同时,运用q RT-PCR的方法,分析了该基因的组织器官及逆境胁迫表达模式。结果显示,该基因c DNA全长981 bp,编码326个氨基酸残基,预测分子量为37.19 ku,等电点为8.89。生物信息学分析表明,该蛋白是一个亲水性蛋白,结构域中含有4个保守的二硫键和2个保守的钙结合位点,可能定位在细胞外(包括细胞壁),属于植物血红素依赖性过氧化物酶超家族的Ⅲ类分泌氧化酶,与渐窄叶烟草POD42、美花烟草POD42、马铃薯POD42等具有很高的同源性。该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中叶中表达量最高,花中表达量最低。同时,Nt POD1的表达受高盐、干旱、低钾、ABA和H2O2诱导。结果表明,Nt POD1基因属于烟草的过氧化物酶,并可能在烟草非生物逆境胁迫响应中发挥作用。     

烟草SnRK2基因家族的克隆及表达分析

农作物生产过程中会面临多种非生物胁迫的影响,会极大地影响作物的产量以及品质。非生物胁迫形式多种多样,干旱胁迫是其中一种主要形式。烟草是重要的经济作物,主要在中国西南地区种植,但经常会遭受极端干旱胁迫。Sn RK2基因家族参与植物抗旱过程,能够受逆境胁迫诱导表达,这种表达是SnRK2基因家族功能的重要体现。为了进一步研究烟草SnRK2家族基因的功能,本研究克隆了烟草SnRK2基因家族GroupⅠ的基因,并检测了烟草SnRK2基因家族的组织表达特异性及诱导表达特异性。结果表明,烟草SnRK2基因中Ntab0922420基因的表达量最高,同时烟草SnRK2基因家族成员更容易在茎与叶中表达。烟草经过低温、盐、干旱胁迫以及ABA处理后,部分SnRK2基因成员表现出受胁迫诱导,其中ID为Ntab0894060的基因受干旱显著诱导。这些工作将为研究烟草SnRK2基因家族功能鉴定基础,并为培育抗逆烟草品种提供遗传资源。     

烟草磷酸酶基因NtPP2C16的克隆、表达载体构建及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C-type protein phosphatases,PP2C)是ABA信号转导途径中的关键组分,在植物生长发育、细胞周期调节及应对逆境胁迫的过程中发挥重要的作用。为探究PP2C基因在烟草适应非生物胁迫中的功能,从烟草栽培品种K326中克隆到了一个PP2C同源基因,该基因开放阅读框为1 617 bp,编码538个氨基酸残基。同源性分析结果显示,该基因所编码的蛋白与绒毛状烟草PP2C16的亲缘关系最近,故命名为NtPP2C16。生物信息学分析表明,NtPP2C16催化区域上具有PP2C家族进化中相对保守的11个结构亚区。qRT-PCR研究分析结果表明:该基因的表达显著受ABA和H_2O_2 2种信号分子诱导,并且响应干旱、高盐、低温和低钾胁迫。成功构建NtPP2C16-pBI121过表达载体,为解析NtPP2C16参与烟草非生物逆境胁迫响应提供一定的理论依据。     

林烟草钾离子通道基因NKT6的克隆与表达定位分析

Shaker家族钾离子通道在植物钾的吸收转运及其他生命过程中发挥重要作用。本研究利用同源克隆的策略从林烟草中获得一个Shaker家族钾离子通道基因,命名为NKT6 (GenBank登录号为KC310448)。该基因cDNA序列全长2 317 bp,编码由681个氨基酸组成的蛋白,该蛋白与Shaker家族其他成员具有较高同源性。NKT6基因组CDS序列共含有11个外显子、10个内含子。系统进化树分析表明,NKT6蛋白是Shaker家族Group II的成员之一。荧光定量PCR分析发现,NKT6的表达量在林烟草的茎和腋芽中最高,在萼片、叶、花中其次,在根中最低。亚细胞定位结果表明,NKT6主要定位于细胞膜和核膜附近的内质网上。干旱与外源ABA胁迫处理下,NKT6的表达量均呈下降趋势。推测NKT6可能在林烟草气孔开放中发挥作用。     

烟草Myb转录因子NtBL1基因的克隆及其表达分析

为揭示Blind基因在普通烟草中的功能,通过同源克隆的方法从普通烟草K326的基因组中克隆得到1个Blind-like基因,即NtBL1,用PROSITE(ExPASy)、Sopma和Swissmodel等软件对NtBL1进行蛋白质结构域分析和高级结构预测,用Mega 7.0和MEME软件对NtBL1及其同源蛋白进行了进化树构建和结构分析,用半定量PCR分析了NtBL1基因在花、叶、根、茎、苗中的表达模式,用qRT-PCR技术分析了ABA、NaCl和PEG处理下NtBL1基因的表达模式。结果表明,NtBL1的开放阅读框长度为1 014 bp,编码337个氨基酸。半定量PCR结果表明,NtBL1在烟草的大部分组织和各时期普遍表达,但是根中的表达量最高。蛋白质结构域分析显示NtBL1是典型的R2R3 Myb家族蛋白,含有2个Myb-type HTH类型的DNA结构域。蛋白质高级结构预测表明,NtBL1蛋白高级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋组成。进化和结构分析结果表明,NtBL1基因与番茄Blind等基因的进化距离较近,且具有相似的模体结构。qRT-PCR的结果显示NtBL1基因的表达受ABA的诱导,在处理24 h达到最高表达量;NtBL1基因的表达受NaCl处理的抑制,在24 h出现最低表达量。因此,NtBL1基因可能参与激素和盐胁迫调控下的侧生分生组织的发育。     

两个烟草YUCCA6基因的克隆及分析

为了研究烟草生长素合成关键基因NtYUCCA6,本研究通过同源克隆从烟草品种云烟87中克隆了2个YUCCA6基因:NtYUCCA6-1和NtYUCCA6-2。分析了NtYUCCA6-1和NtYUCCA6-2基因编码的蛋白质基本理化性质、二级结构等。保守基元分析表明烟草NtYUCCA6-1和NtYUCCA6-2蛋白含有FAD结合位点和还原型辅酶Ⅱ结合位点,可能烟草的两个YUCCA6基因都具有生物学功能。进化分析表明烟草YUCCA6蛋白与番茄YUCCA6蛋白亲缘关系最近。另外,本研究对克隆基因在烟草根、茎、叶及腋芽中的表达模式进行了q PCR检测,结果显示:两个基因主要都在根中表达,但NtYUCCA6-2在所检测的组织中都有表达,而NtYUCCA6-1在茎中基本不表达。试验结果将有助于研究烟草YUCCA6基因在烟草生长发育中的具体功能。     

香椿TsCCR基因的克隆及表达分析

肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是木质素合成的关键酶,本研究根据香椿转录组数据从太和‘红油椿’中克隆得到1个肉桂酰辅酶A还原酶基因,命名为TsCCR,对其进行了生物信息学分析,并通过荧光定量PCR技术分析了TsCCR基因在香椿幼苗根、茎、叶及低温、高温、干旱、盐4种非生物胁迫条件下的表达特性。结果表明:香椿TsCCR基因含有975 bp的开放阅读框,共编码324个氨基酸,含有FR-SDR-e保守结构域,与柑橘的亲缘关系最近;TsCCR基因在茎中的表达量最高;4℃低温胁迫期间,TsCCR表达量短暂升高后逐渐降低;38℃高温胁迫期间,短暂降低后逐渐升高;200 mmol/L NaCl盐胁迫处理期间,TsCCR表达量在4 h时急剧降低,随后又急剧增加;200 g/L PEG6000干旱胁迫处理期间,TsCCR表达量呈现先下降后升高又下降的趋势。以上结果表明香椿TsCCR基因在香椿抵抗非生物胁迫方面可能发挥调控作用,本试验结果为通过基因工程改良香椿的栽培抗性提供了参考。     

石蒜LrCMO基因的克隆及表达分析

以石蒜(Lycoris radiata)为试材,采用同源克隆和RACE的试验方法,克隆得到LrCMO基因全长cDNA,并对其进行了基因表达分析。结果表明:LrCMO基因全长1 472 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 281 bp,编码427个氨基酸残基,预测编码蛋白质的分子量为47.92 kD,理论等电点为5.72;LrCMO是一个稳定的疏水蛋白,不具有跨膜结构,含有叶绿体导肽;LrCMO基因编码的氨基酸与植物其他CMO蛋白具有较高的一致性,且与海枣PdCMO、香蕉MaCMO及油棕EgCMO亲缘关系最高,聚为一类。实时荧光定量PCR分析表明,LrCMO在根、鳞茎和叶片中有表达,且在鳞茎中的表达量最高;LrCMO受聚乙二醇(PEG)处理的诱导表达,其基因相对表达量在处理后12 h达到最高。随着处理时间的延长,LrCMO基因相对表达量逐渐下调至对照水平。     

烟草钾转运体NtKT12的克隆及表达分析

克隆烟草钾转运体基因,预测其结构,并分析其进化关系和功能,为研究烟草钾吸收机制奠定基础。采用RT-PCR方法从烟草品种K326中克隆到了一个钾转运体的同源基因,该序列全长为2 532 bp,蛋白编码844个氨基酸,预测分子量为93.1 k Da,等电点为7.2。同源性分析结果显示,该基因与绒毛烟草钾转运体12、林烟草钾转运体12等具有较高的同源性,故命名为NtKT12。生物信息学分析表明,NtKT12具有12个跨膜区。组织表达分析发现该基因在根中的表达量最高。低钾胁迫试验表明,该基因在处理6,24 h后表达量明显高于对照。研究结果为解析NtKT12在烟草钾营养中的功能奠定一定的理论基础。     

羊踯躅psy基因的克隆及表达分析

[目的]为了研究羊踯躅psy基因的功能及其在花瓣着色中的分子机理,[方法]以羊踯躅花瓣的cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE方法克隆得到1 638 bp的psy基因全长cDNA序列,命名为RmPSY (GenKank登录号为KX230461)。[结果]序列分析表明,RmPSY开放阅读框为1 296bp,编码432个氨基酸。羊踯躅PSY为亲水性的不稳定蛋白,无信号肽,属于非分泌蛋白;预测的蛋白质分子量48.91 kD,等电点为8.78。RmPSY与GenBank中收录的其它植物PSY蛋白氨基酸的相似性达到81%。构建系统进化树,结果显示羊踯躅PSY与葡萄PSY蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在羊踯躅花发育的不同阶段均有表达,在花蕾期表达量较低,在初开期表达量最高,盛开期表达量有所下降。[结论]试验结果为进一步揭示RmPSY基因参与调控羊踯躅花色形成的分子机制奠定基础。     

小麦TaSPP基因的克隆及表达分析

为明确磷酸蔗糖磷酸酶基因(SPP)的表达特征和生物学功能,进一步了解SPP参与蔗糖生物合成的调控机制。以小麦抗旱品种晋麦47的cDNA为模板克隆出3个位于第5同源群上的TaSPP同源基因,分别命名为TaSPP-5A、TaSPP-5B和TaSPP-5D。并利用生物信息学对小麦TaSPP的理化性质、基因结构、顺式作用元件、系统进化树和蛋白保守结构域等进行分析,通过qRT-PCR分析基因TaSPP的表达模式。结果表明,TaSPP-5A、TaSPP-5B、TaSPP-5D都包含8个外显子和7个内含子,TaSPP-5A和TaSPP-5D编码422个氨基酸,TaSPP-5B编码413个氨基酸。系统进化分析显示,小麦TaSPP基因与小麦的近缘物种在进化上处于同一分支,相似度较高。qRT-PCR表达分析结果显示,TaSPP基因在根、茎秆、旗叶、叶鞘、颖花、种子中均表达,其中在旗叶和茎秆中表达量较高;ABA、PEG-6000、NaCl和IAA胁迫均能诱导TaSPP基因的表达,表明小麦TaSPP基因可能在逆境胁迫过程中发挥重要作用。