掌叶半夏凝集素基因的克隆及亚细胞定位分析

为了克隆掌叶半夏凝集素基因(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA),并对其进行生物信息学分析和亚细胞定位。采用PCR技术扩增掌叶半夏凝集素基因的ORF序列,构建pCAMBIA1300-35S-PPA-e GFP重组载体,导入农杆菌GV3101并在烟草中进行瞬时表达,采用激光扫描共聚焦显微镜观察其亚细胞定位。克隆获得的PPA基因全长由777个核苷酸组成,编码258个氨基酸,含有3个甘露糖结合位点和2个保守的B-lectin结构域,Gen Bank登录号为KF154981,氨基酸序列登录号为AGV40779。序列比对表明,该序列与天南星、滴水珠、花南星和半夏凝集素的氨基酸序列相似性分别为96%,91%,86%和83%。亚细胞定位的结果表明,pCAMBIA1300-35S-PPA-e GFP融合蛋白在细胞核内无分布,而是点状分布在细胞质膜上。为进一步解析掌叶半夏凝集素基因的结构与功能,开展掌叶半夏凝集素抗病虫害机制的研究奠定基础。     

拟南芥AtTCP4基因克隆及原核表达

为进一步研究转录因子TCP4在植物生长发育过程中的调控作用和下游靶基因。利用生物信息学分析转录因子TCP4家族及其蛋白序列,扩增AtTCP4基因CDS序列、构建原核表达载体并诱导纯化获得蛋白,利用凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证AtTCP4蛋白与拟南芥功能基因LOX2启动子区域的顺式作用元件结合。生物信息学分析表明,拟南芥TCP蛋白含有非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域;系统进化树表明,AtTCP4属于Ⅱ类TCP蛋白;蛋白三级结构预测表明:转录因子TCP4可以形成同源或异源二聚体。特异性引物扩增获得AtTCP4基因的CDS序列,其开放阅读框(ORF)长为1 263 bp。构建原核表达载体pET-28a-AtTCP4并转化到Rosetta(DE3)感受态中,经IPTG诱导、纯化和Western Blot检测证明获得AtTCP4蛋白。EMSA试验验证AtTCP4蛋白能够结合到功能基因LOX2的顺式作用元件。转录因子TCP4结合功能基因LOX2启动子区域,影响植物激素茉莉酸的生物合成,调控植物的生长发育过程。     

盾叶半夏凝集素基因的克隆及功能分析

为克隆盾叶半夏凝集素基因,并对其功能进行分析。采用RACE技术从盾叶半夏中克隆得到盾叶半夏凝集素基因的全长cDNA序列,命名为ppl。同时,构建了ppl基因的原核表达载体,并成功实现了33 k Da重组蛋白在E.coli BL21中的表达。纯化后的重组蛋白PPL用于凝血和体外抗癌试验。该基因的全长cDNA序列为1 504 bp,其中开放性阅读框(ORF)813 bp,编码270个氨基酸,具有3个甘露糖结合识别位点。PPL具有凝血活性,这种凝血活性可受甘露糖抑制。PPL对人鼻咽癌细胞(CNE)、人宫颈癌细胞(Hela)及人乳腺癌细胞(Bcap-37)的生长均具有抑制作用,其中对Hela细胞的抑制效果最好。为进一步研究PPL蛋白的功能奠定了理论基础。     

西和半夏凝集素抗虫基因克隆及对棉花的遗传转化

采用同源序列克隆方法,通过设计特异引物克隆甘肃西和半夏(Pinellia ternata)凝集素基因pta,其序列全长l069bp,编码区804bp,编码268个氨基酸残基,有3个典型的甘露糖结合位点,预测分子量和等电点分别为29.1kD和7.77,GenBank登录号AY725425。构建了35S启动子驱动的植物表达载体pBI-pta。建立了陇棉2号花粉管通道法遗传转化技术,获得5株卡那霉素抗性和PCR检测阳性植株,为建立棉花转基因方法和培育抗虫种质奠定了基础。     

掌叶半夏的光合特性及影响因子分析

探讨掌叶半夏的光合特性及其影响因子,为指导掌叶半夏的人工种植提供依据。本研究选择掌叶半夏成熟的叶片,利用LI-6400型便携式光合仪测定了植株叶片的光合-光响应曲线、光合日变化。结果表明掌叶半夏的光饱和点、光补偿点(LCP)和表观量子效率(AQY)分别为1000 μmol/(m²·s)、 18.44 μmol/(m²·s)和0.0318。较低的LCP表明掌叶半夏为喜阴性植物。掌叶半夏净光合速率的日变化呈双峰曲线,存在明显的“午休”现象。相关性分析表明,蒸腾速率和光合有效辐射是影响掌叶半夏净光合速率的主要因子,相关系数分别为0.721和0.718。掌叶半夏在栽培时,可采取与其他作物,如玉米、小麦、高粱和油菜等间作的方式,对其遮阴;同时,合理灌溉,保持环境相对湿度,使植株的蒸腾速率降低从而缓解“午休”现象。由于掌叶半夏的光饱和点为1000 μmol/(m²·s),因此,遮荫的光照强度不应低于1000 μmol/(m²·s)。     

香蕉果实凝集素基因的克隆及原核表达

【研究目的】植物凝集素具有重要的生理功能,通过原核表达香蕉凝集素基因(BanLec)并探讨其功能具有重要意义。【方法】提取了巴西蕉果肉总RNA,利用RT-PCR方法扩增BanLec cDNA 全长序列,并对该序列进行分析。将BanLec克隆至表达载体pET-30a,并将筛选到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达。【结果】克隆到的BanLec cDNA 序列为460bp,开放读码框为426bp,编码142个氨基酸。与其它已知的香蕉凝集素基因相比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94%和93%以上。SDS-PAGE 分析结果表明,经IPTG诱导,BanLec基因以融合蛋白形式表达,相对分子量约为20kD。【结论】该研究为探讨香蕉凝集素的活性及生化功能等奠定基础。     

药用作物掌叶半夏组织培养及药物成份分析

药用作物掌叶半夏（ＰｉｎｅｌｌｉａｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａＳｃｈｏｔｔ）的种子在附加２，４－Ｄ０．５－６．０ｍｇ／Ｌ＋ＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ的ＭＳ或Ｂ５培养基上均能诱导出大量愈伤组织，但２，４－Ｄ的浓度变化对愈伤组织的形成和生长无明显影响，且无分化现象。愈伤组织生长快，分散性好，适于悬浮培养。种子在附加ＮＡＡ０．１－４．０ｍｇ／Ｌ＋ＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ的ＭＳ培养基上均能形成愈伤组织并分化出根和芽，随ＮＡＡ     

西瓜鸟氨酸氨甲酰转移酶基因克隆及原核表达

从西瓜叶片中克隆瓜氨酸合成途径的关键酶鸟氨酸氨甲酰转移酶(OCT)基因。OCT基因由1 137个碱基组成,编码378个氨基酸,蛋白分子量约为41.8 k D,等电点为8.61。氨基酸序列比对分析表明,西瓜OCT与香瓜和黄瓜等物种的OCT基因同源性较高,分别为93%和92%;进化树分析发现,西瓜与黄瓜亲缘关系最近,而与狭刀豆亲缘关系最远。构建p ET-30a-OCT原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,表达的融合蛋白与预期蛋白大小相符合。本研究为进一步研究其酶学特性和瓜氨酸合成代谢中的作用提供技术支持。     

掌叶半夏细胞悬浮培养及单细胞培养再生植株

掌叶半夏成熟胚在含２，４－Ｄ２．０ｍｇ／Ｌ，ＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ的ＭＳ培养基上可诱导形成颗粒状胚性愈伤组织。用附加２，４－Ｄ ２．０ｍｇ／Ｌ，ＢＡ０．１ ｍｇ／Ｌ，ＣＨ３００ｍｇ／Ｌ的ＭＳ液体培养基对胚性愈伤组织进行悬浮振荡培养，经３￣４次继代培养即可得到悬浮的单细胞，其细胞多为圆形或椭圆形，具有较强的分裂能力。经测定，悬浮培养过程中细胞生长曲线呈“Ｓ”型，培养２０天时细胞数量和鲜重达到最大值；随着     

棉花GhRGL基因克隆及其原核表达研究

GA信号转导途径是通过DELLA蛋白来抑止的。通过对Genbank进行Blast比较,我们首次克隆了棉花DELLA蛋白基因,长度为1644bp,分离的棉花DELLA蛋白进行生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥中的DELLA蛋白一样的保守结构域,我们对克隆的基因进行原核表达研究,将克隆的基因转化原核表达载体pET22b,在E.coli BL21（DE3）菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhRGL蛋白, 大小约为64kDa。首次实现了棉花DELLA蛋白基因在原核系统中的表达, 为棉花DELLA蛋白的抗体制备及其表达定位研究奠定了基础。     

鸡新城疫病毒La Sota株F基因克隆及原核表达

参照NDVLa Sota株核酸序列(AF077761)设计1对引物,利用RT-PCR扩增F基因并得到了长为1 700 bp的片段,将其克隆到pGEM-T easy vector中,经酶切鉴定和测序后克隆进原核表达载体pET-32a,将重组表达质粒转化BL21(DE3),在IPTG诱导下表达约83 kd的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blotting检测证实该基因片段获得高效表达且表达产物具有免疫学活性。     

鸭梨苹果茎痘病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达

为了进一步明确苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)的分子变异及株系分化,制备相应特异性抗血清.本研究以库尔勒地区种植的感染ASPV的鸭梨(Y)枝条韧皮部为试材,采用RT-PCR技术扩增ASPV CP基因,克隆、测序,获得了鸭梨分离物外壳蛋白(ASVP CP-Y)基因,将该CP基因连...     

李矮缩病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达研究

为制备李矮缩病毒(Prunus dwarf virus, PDV)抗血清,克隆PDV外壳蛋白(CP)基因,构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。以阳性感病甜樱桃叶片为试验材料,提取总RNA,根据PDV CP基因(L28145.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-PDVCP,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达。PDV CP基因（Genbank登录号：JF333587.1）全长657 bp,编码217个氨基酸,与GenBank其他PDV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89.2%~93.9%,推导的氨基酸序列同源性为97%~99%。根据完整CP基因核苷酸序列构建系统进化树显示：12个PDV分离物可分为3组,泰安分离物与巴西、土耳其等分离物属于Ⅰ组。成功构建原核表达载体pET30a-PDVCP,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。转pET30a-PDVCP载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白。该重组蛋白在30℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导4 h表达量最大。     

樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达

为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。     

番茄褪绿病毒CP基因克隆、序列分析及原核表达

为制备番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)抗血清,以番茄病叶为试验材料,提取总RNA,根据To CV CP基因设计特异性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,构建原核表达载体p ET32a-To CVCP,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达CP蛋白。结果表明:To CV CP基因(Gen Bank登录号:KT809400)全长774 bp,编码257个氨基酸,与Gen Bank中其他地区分离物核苷酸序列同源性为97.2%~99.6%,推导的氨基酸序列同源性为97.3%~100.0%。核苷酸序列保守位点占全部位点的91.3%,氨基酸序列保守位点占全部位点的88.3%,表明不同地理来源的番茄褪绿病毒的CP基因保守性较高。将To CV CP基因克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,转p ET32a-To CVCP载体的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达了分子量约33 k Da的重组蛋白。该重组蛋白在37℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导6 h,表达量最大。     

猪Fc受体γ亚单位基因克隆与原核表达

应用RT-PCR技术从90日龄健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪Fcγ亚单位的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-FcRγ,成功表达了分子量约为29 kDa的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白FcRγ-His免疫小鼠,制备获得鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接ELISA和Western-blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的效价为1∶8 000。Western-blotting结果表明,制备的鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体可以与重组γ亚单位蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。成功克隆出猪Fc受体γ亚单位基因并表达,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。     

肥城桃果实2-Cys Prx基因克隆、生物信息学分析及原核表达

为了深入研究2-Cys Prx基因调控桃果实氧化还原信号分子作用机制,结合了PCR技术和RT-PCR技术通过体外克隆的方法得到桃果实2-Cys Prx基因,通过对序列分析表明,2-Cys Prx基因全长1 424 bp,其中,编码区813 bp,共编码270个氨基酸。对其分子结构进行分析,2-Cys Prx蛋白分子量为29.7 ku,为疏水型蛋白,且是膜外蛋白。在线软件预测2-Cys Prx蛋白分子式为C1342H2110N348O403S4,分子量29.696 ku,由4 207个原子组成,理论等电点为6.23。使用Prot Scale分析该蛋白疏水性平均值为-0.126,说明2-Cys Prx为亲水性蛋白。TMHMM对跨膜结构进行预测,发现,2-Cys Prx氨基酸序列中不存在跨膜结构域,为膜外蛋白。此外,对该蛋白二级结构进行预测,发现2-Cys Prx有4个α螺旋结构、9个β折叠结构及无规则卷曲构成。系统进化树分析表明,肥城桃果实2-Cys Prx与其他植物氨基酸序列有较高同源性,其中与樱桃的亲缘关系最近,相似度达到了98.15%,表明植物体内2-Cys Prx具有较高的保守性。体外构建重组蛋白p ET-30a-2-Cys Prx成功在大肠杆菌BL21中表达,为下一步研究其功能与结构,从而探讨2-Cys Prx基因调控桃果实氧化还原信号作用机理奠定了基础。     

掌叶半夏悬浮培养下的体细胞胚胎发生的研究

掌叶半夏种子在附加２，４－Ｄ２．０，ＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ的ＭＳ培养基上形成浅黄色或白色颗粒状胚性愈伤组织。胚性愈伤组织在附加２，４－Ｄ１．０，ＢＡ０．５，ＣＨ３００ｍｇ／Ｌ的ＭＳ液体培养其中振荡培养，可产生大量的体细胞胚。２，４－Ｄ对体胚诱导效果显著并促进其早期发育，但抑制其进一步发育成熟。ＮＡＡ对体胚诱导效果不如２，４－Ｄ，但可使体胚正常发育。水解酷蛋白明显提高体胚诱导频率。显微观察表明：体胚起源     

彩叶桂OfMYB3基因克隆与表达分析

彩叶桂(Osmanthus fragrans colour group)叶片发育不同时期色泽变化具有显著差异,为探究彩叶桂MYB转录因子在叶色转变过程中的调控功能,本研究以其品种‘虔南桂妃’红色叶片为材料,采用反转录PCR的方法克隆到1个MYB转录因子家族成员,命名为OfMYB3 (GenBank登录号:MT481996),该基因完整的开放阅读框序列长度为225 bp,编码74个氨基酸,预测的蛋白分子质量为8.30 kD,理论等电点为7.88。蛋白结构分析显示,OfMYB3属于R3-MYB转录因子成员,具有MYB与bHLH转录因子相结合所必须的保守序列以及多个磷酸化位点,预测为不稳定的亲水蛋白。系统进化分析发现,OfMYB3氨基酸序列与茶、橡胶、蓖麻、胡杨、番木瓜、烟草、拟南芥中的R3-MYB成员ETC1基因具有较高相似性。亚细胞定位结果显示,Of MYB3蛋白定位于细胞核。RT-qPCR分析发现,随着‘虔南桂妃’叶片颜色由红转绿,OfMYB3基因的表达水平呈现出显著下降的趋势,推测下调表达的OfMYB3基因可能促进了叶片红色的消退。本研究结果为深入探究Of MYB3转录因子在彩叶桂叶...     

肥城桃果实己糖激酶Ⅱ基因克隆、生物信息学分析及原核表达

为了深入研究己糖激酶(HK)的同工酶HKⅡ调控线粒体通透性转换孔(MPTP)的开放机理,通过RT-PCR技术和RACE技术,以克隆得到的肥城桃果实c DNA为模板,成功克隆得到HKⅡ基因全长,经原核表达和SDS-PAGE检测,体外构建原核表达载体pET-30a-HKⅡ,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达;使用镍柱纯化法,得到纯化的重组蛋白。克隆得到HKⅡ基因共1 835 bp,其中编码区1 496 bp,共编码497个氨基酸。HKⅡ蛋白预测分子式为C2379H3846N652O717S17,原子总数为7 611个,分子量为53.6 kDa,理论等电点为6.17,总平均疏水指数为0.023,表明HKⅡ蛋白为疏水性蛋白。TMHMM跨膜结构预测HKⅡ为跨膜蛋白,有1次跨膜,绝大部分在膜外。从二级结构预测结果来看,HKⅡ蛋白由15段α螺旋和11段β折叠和无规则卷曲构成。肥城桃HKⅡ蛋白预测的三级结构呈V字型,折叠结构较多。系统进化树和氨基酸相似性分析发现,桃果实HKⅡ与枇杷的相似度最高,达到了96.98%,桃果实HKⅡ与其他植物HK的氨基酸的同源性较高,说明HKⅡ具有较高的保守性。为进一步解析HKⅡ蛋白的结构和功能从而探讨HKⅡ调控线粒体MPTP的机理奠定了基础。