蛹虫草CmKexin基因克隆和菌丝体中表达检测

为了探讨蛹虫草类枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin-like protease)的表达特性,以真菌蛹虫草菌丝体为研究对象,通过RT-PCR获得蛹虫草CmKexin基因的ORF序列,并进行序列分析。应用Northern杂交和Real-time PCR方法,检测蓝光照射后蛹虫草菌丝体中CmKexin基因的转录情况。结果获得蛹虫草CmKexin基因的ORF序列。对翻译蛋白质产物CmKexin进行生物信息学分析,表明该蛋白质含1个属蛋白转化酶的肽酶S8家族功能域(143~429)和1个前体蛋白转化酶P功能域(514~600),符合真菌类枯草杆菌蛋白酶的特征。蛹虫草菌丝体在黑暗预培养4 d后再蓝光照射,Northern Blotting和Real-time PCR检测均可得到相同的结果,即在持续的蓝光照射48~50 h时,出现CmKexin基因的瞬时大量转录。而其他时间内均未检测到该基因的大量转录。试验结果将为蛹虫草类枯草杆菌蛋白酶的利用提供理论依据。     

性别决定基因Sry原核表达载体的构建和蛋白检测

动物的性别在畜牧业是一项很重要的经济性状,而哺乳动物的性别决定受睾丸决定基因Sry的启动,获得SRY蛋白并探索它与其他相关因子之间的相互关系对于深入了解该因子的作用机理和寻求高效经济的性别控制方法尤为重要。本研究以小鼠为实验材料,通过PCR、质粒重组、酶切和测序等方法构建小鼠Sry的原核表达载体,使用IPTG诱导蛋白表达、SDS-PAGE电泳和western blotting等方法检测重组表达载体的原核表达。PCR、酶切和测序结果一致显示成功地构建了原核表达载体pET-21b-Sry;使用anti-Sry和anti-His特异性抗体进行的western blotting实验结果验证了蛋白表达的正确性。本实验不仅实现了哺乳动物性别决定因子的Sry原核表达,而其还获得了具有生物活性的SRY蛋白,对于深入研究Sry及其他相关基因的相互作用奠定了实验基础。     

杜仲Dirigent1基因的原核表达及蛋白纯化

植物Dirigent蛋白认为指导木脂素和木质素的生物合成,同时在生物防御应答,次生代谢调控和病原体抗性的过程中起到了重要的作用。本研究以实验室前期克隆得到杜仲Dirigent1基因(EuDIR1)为基础,利用基因重组技术构建pET-30a-EuDIR1原核表达载体。重组载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)中,在15℃下0.1 mmol/L异丙基硫代β-D-半乳糖苷诱导6 h后,蛋白的沉积量达到最高值,表达模式主要为包涵体。对包涵体进行溶解,使用镍-亚氨基二乙酸亲和层析柱进行纯化。收集纯度较高的洗脱组分进行透析复性,并用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot鉴定重组蛋白。结果表明,成功构建了pET-30a-EuDIR1原核表达载体,表达菌株诱导后在相对分子质量约18 kD处有1条特异性蛋白条带,包涵体纯化、复性后,经Western Blot鉴定,获得可溶性且纯度较高的重组蛋白。实验中得到的EuDIR1蛋白为体外生化实验提供了科学依据。     

杜仲EuGT2基因的原核表达及蛋白纯化

本研究以克隆所得杜仲(Eucommia ulmoides)EuGT2基因为基础,利用基因重组技术构建原核表达载体pMCSG19-EuGT2。重组载体转化到E.coli Rosetta(DE3)中,用0.05 mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导6 h。使用镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱进行纯化,并用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳进行检测。研究结果表明,杜仲EuGT2基因在E.coli Rosetta(DE3)中得到成功表达,重组蛋白表达形式为部分包涵体、部分可溶性蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳检测,在相对分子质量约56 kD处有1条特异性蛋白条带,经质谱鉴定该特异性蛋白条带确为杜仲EuGT2蛋白。以上研究结果为后续研究杜仲糖基转移酶的功能提供了科学依据。     

SikCDPK1基因EF-hand的定点突变、原核表达及蛋白纯化

钙依赖性蛋白激酶(calcium dependent protein kinase, CDPK)通过与Ca²⁺相互作用,在植物响应各种逆境胁迫的过程中发挥重要作用,其C端调控区的EF-hand基序是使CDPK的激活依赖于Ca²⁺的关键结构。为进一步研究具有极强耐寒性的天山雪莲对逆境的响应机制,本研究采用PCR定点突变技术,将SikCDPK1基因EF-hand基序的第435、第471、第507和第540位氨基酸分别由E(谷氨酸)突变为Q(谷氨酰胺),构建定点突变原核表达载体,转化表达菌株E. coli BL21 (DE3),使用IPTG诱导蛋白表达,利用亲和层析系统对重组蛋白进行纯化。结果显示,重组菌株能够成功表达出目的重组蛋白,重组蛋白可溶性表达量较高的诱导培养条件是18℃1 mmol/L IPTG诱导16 h,最后成功纯化出符合预期大小的可溶性蛋白,为进一步探究SikCDPK1中不同EF-hand基序的生物学功能提供了实验依据。     

稻瘟病菌两个效应蛋白基因原核表达和瞬时表达载体构建

为了研究稻瘟病菌效应蛋白基因功能,本研究构建了稻瘟病菌效应蛋白基因BAS1和BAS4与3×FLAG标签融合的原核表达载体及其与GFP融合的瞬时表达载体。以持有BAS1和BAS4基因的稻瘟病菌株的cDNA为模板,RT-PCR扩增目的基因BAS1和BAS4编码区,选用p3×FLAG-CMV-10为模板扩增3×FLAG基因,分别将BAS1和BAS4与3×FLAG连接到原核表达载体p GEX-4T-1中,获得原核表达载体p GEX-BAS1-3×FLAG和p GEX-BAS4-3×FLAG,测序结果表明克隆到的BAS1、BAS4和3×FLAG序列及连接方向正确。将构建好的原核表达载体转化到表达感受态细胞Transetta(DE3)中得到转化子,利用IPTG诱导表达原核表达产物,SDS-PAGE电泳结果表明,目的蛋白约为40 kD,与理论值相符。为了进一步研究BAS1和BAS4的亚细胞定位,利用同源重组方法构建了pBWA(V)HS-BAS1-GLosgfph和pBWA(V)HS-BAS4-GLosgfp瞬时表达载体。本研究所构建的BAS1和BAS4与3×FLAG融合的原核表达载体及瞬时表达载体将为进一步研究BAS1和BAS4功能及定位提供一定的实验基础。     

小麦甲基结合蛋白基因MBD3重组表达载体的构建和原核表达

本研究构建了小麦甲基结合蛋白基因MBD3的原核表达载体pGEX-4T-MBD3, 转化大肠杆菌BL21 (DE3)工程菌株,在37 ºC,1 mM IPTG浓度条件下,成功诱导表达了的GST-MBD3融合蛋白,大小为49.6 kDа,这为进一步开展MBD3的蛋白纯化和功能分析奠定了基础。     

橡胶树炭疽菌CsPbs2基因的原核表达分析

HOG MAPK途径参与植物病原真菌生长发育、致病和对杀菌剂敏感性等过程,CsPbs2基因是HOG MAPK信号通路的关键成员。为研究CsPbs2蛋白的互作蛋白及其调控机制,本研究克隆了橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense) CsPbs2基因,构建融合蛋白表达载体,利用SDS-PAGE和Western Blot检测蛋白表达。结果显示橡胶树炭疽菌(C. siamense)的CsPbs2基因全长2 051 bp,编码667个氨基酸,包含个1个内含子,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域。CsPbs2基因在进化关系上与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的Pbs2基因有最近的亲缘关系。构建的GST-CsPbs2蛋白融合表达载体在供试条件下(IPTG:0.6 mmol/L, 0.8 mmol/L,1.0 mmol/L温度16℃和25℃)均可较好诱导表达,GST-CsPbs2融合蛋白大小约为96 kD。用GST亲和层析柱纯化获得蛋白,经Western Blot检测显示该蛋白可与GST单克隆抗体特异性结合。本研究成功构建了GSTCsPbs2蛋白融合表达载体,纯化得到GST-CsPbs2融合蛋白,为后续利用Pull-down技术钓取Cs Pbs2的互作蛋白提供基础。     

扁桃CBF2基因的克隆及原核表达

为进一步研究扁桃CBF2 目的蛋白功能,探明CBF2 转录因子在扁桃中的抗寒分子机制,以新疆栽培扁桃(Amygdalus communis L.)‘双软’叶片为材料,通过PCR 技术从基因组DNA 中克隆CBF2 基因,命名为AcCBF2,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组质粒pET-AcCBF2 并转化E. coli Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达;生物信息学推测显示该基因的开放阅读框(ORF)为717 bp,编码238 个氨基酸,其分子量为26.59 kD,等电点为5.29。系统发育树分析结果显示,AcCBF2 基因与扁桃CBF1、光核桃和桃的亲缘关系最近。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,该蛋白分子量约47 kD,与预期蛋白大小基本一致。AcCBF2 基因在E. coli Rosetta 中的最佳诱导条件为IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导4 h。     

花生病程诱导蛋白基因AhPIP1和启动子的克隆、序列分析及原核表达

本文采用RACE法克隆了花生病程诱导基因(pathogenesis-induced protein gene)全长,命名为AhPIP1,并在GenBank登录,登录号为EU860093.序列分析表明该基因的开放读码框579 bp,编码193个氨基酸.以YY20基因组DNA为模板PCR扩增获得AhPIP1基基因组序列长1 883 bp,包含3个外显子和长度分别为602 bp和600 bp的2个内含子.同源性比较发现AhPIP1与辣椒病程诱导蛋白CaPIP1(ABF72432,AAT35532)相似性达82%.采用Genome Walldng方法获得AhPIP1启动子,序列分析表明该启动子序列长513 bp,包含干旱胁迫、病程胁迫应答元件和生长素、赤霉素应答元件.构建pET32a-AhPIP1原核表达载体,转化表达受体菌Ecoli BL21,原核表达获得大小约40 kD AhPIPl融合蛋白,与推测的AhPIP1基因编码产物的大小一致,表明AhPIP1基因在大肠杆菌中能够表达.     

IBDV HI株VP2基因的原核表达

【研究目的】为了研究鸡传染性法式囊病毒的分子生物学特性,【方法】应用反转录（RT—PCR）技术从河南传染性法式囊发病鸡中总RNA克隆出1461bp的VP2基因,并将其克隆于pET-28a载体,筛选并构建了pVP2表达载体。【结果】经IPTG诱导后,在其宿主菌BL21（DE3）中成功表达了53．7ku蛋白。【结论】经SDS—PAGE和Western blotting分析,VP2表达产物以包涵体形式存在,并与鸡IBDV抗血清及1株IBDV单抗发生特异性反应。     

毛竹EMF2类基因原核表达条件优化

在对毛竹EMF2基因功能研究的过程中,需要制备其抗体用于蛋白表达的检测。由于PheEMF2原核表达量低,纯化到的蛋白量不利于抗体制备,所以本研究用正交设计的方法对PheEMF2原核表达诱导条件进行优化,提高其原核蛋白表达量。根据L25(56)正交设计表设计诱导时间、诱导温度、IPTG终浓度、菌液OD值四因素五水平的融合蛋白表达诱导条件。用凝胶图像光密度分析系统分析各诱导条件下融合蛋白的表达量,发现菌液OD值和诱导温度对蛋白表达量有显著影响,而IPTG终浓度和诱导时间对蛋白表达量影响不显著。根据正交设计的效应曲线和方差分析结果,选择在菌株生长值OD600为1.1时,加入IPTG至终浓度1.0mmol/L,放入25℃摇床中振荡8 h诱导融合蛋白表达,融合蛋白的表达量约提升了10倍,占细菌总蛋白量的21.4%。     

拟南芥SAT1蛋白的原核表达及抗体制备

丝氨酸乙酰转移酶(serine acetyltransferase,SAT)是甲硫氨酸和半胱氨酸合成途径的关键酶,利用该基因提高作物中甲硫氨酸水平具有广阔的应用前景。为了研究拟南芥SAT1(Arabidopsis thaliana SAT1)基因的蛋白表达情况及相关功能,构建了带有His标签的AtSAT1基因原核表达载体p ET-30b(+)-SAT1-His(6)。将其导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化获得了抗原蛋白SAT1-His(6)。该抗原蛋白经免疫兔子,成功制备了具有较高特异性和灵敏性的SAT1蛋白多克隆抗体。Western blotting表明,该抗体可用来检测转AtSAT1基因的转基因玉米株系中SAT1蛋白的积累量,为后期对该基因开展进一步深入研究具有重要意义。     

猪α1干扰素基因的克隆与原核表达

根据猪α1干扰素(pocine interferon-alpha1,poIFN-α1)的全基因序列(EU364896)设计合成1对特异引物,通过RT-PCR从三元杂交仔猪外周血淋巴细胞扩增出poIFN-α1全基因,将该基因克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-poIFN-α1,进行测序。以pGEM-T-poIFN-α1为模板,经PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α1基因,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-6P-poIFNα1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定,并确定蛋白最佳表达条件。序列分析表明,克隆的poIFN-α1基因全长546bp,编码181个氨基酸,前23个氨基酸组成信号肽,无糖基化位点。SDS-PAGE和Western blotting证实重组表达菌经IPTG诱导后,可表达相对分子质量约46ku的融合蛋白(GST-poIFN-α1)。当以1.0mmol/L的IPTG于37℃下诱导表达9h时,蛋白表达量最高。poIFN-α1基因的克隆与表达为进一步研究其抗病毒活性,开发病毒治疗和疫苗免疫增强用生物制剂奠定了基础。     

三角褐指藻F-box like蛋白基因的原核表达及蛋白纯化

F-box蛋白是SCF复合体的重要组成元件之一,能通过泛素蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome system,UPS)参与调控胞内蛋白降解、受体识别、信号传导等生物学过程.为了探究一个F-box like蛋白在三角褐指藻细胞周期调控过程中的作用机制,本研究从三角褐指藻中克隆得到一个F-box like...     

花烟草NaD1基因的原核表达及纯化

花烟草的花中特异地存在一种植物防御素Nicotiala alata defensin 1 (NaD1),对多种致病性真菌具有防御活性,在天然免疫系统中起着重要作用。该蛋白还对哺乳动物肿瘤细胞具有杀伤作用。本研究构建了原核表达载体p ET28a-NaD1,将其转化到Rosetta菌株中进行诱导表达并优化了诱导表达条件,发现在25℃下,0.5 mmol/L IPTG诱导表达过夜后,目的蛋白积累量达到最高,并主要以可溶性蛋白形式存在。利用Ni柱对NaD1重组蛋白进行亲和层析纯化,产物经Western Blot鉴定发现在16.8 kD处有特异性条带,与预期的NaD1重组蛋白大小一致。本研究结果为进一步研究NaD1蛋白的作用机制提供实验依据。     

黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的Western-blot分析

为进一步研究黑曲酶中国株3.758葡萄糖氧化酶(GOD)在大肠杆菌中的表达水平和条件,将黑曲霉中国株3.758的葡萄糖氧化酶(GOD)基因定向克隆于原核表达载体pET-11a上,构建了融合表达的重组质粒pET/GO,转化E.coli BL21(DE3)plysS,用IPTG诱导,超声波粉碎细菌细胞,SDS-PAGE电泳检测,GOD基因获得了表达,表达的融合蛋白相对分子质量为66.5 kDa.用市售葡萄糖氧化酶免疫家兔获得抗血清,酶联法(ELISA)测定其效价为106,Western-blot分析证明表达的融合蛋白与兔抗GOD血清有较强的特异性,为黑曲霉3.758葡萄糖氧化酶(GOD)抗体的制备奠定了基础.     

黄瓜CsRAX2的克隆与表达分析及原核表达蛋白诱导

作为最大的转录因子家族,MYB转录因子广泛参与植物的生长发育以及对胁迫的响应与耐受。CsRAX2是黄瓜MYB转录因子家族成员之一,本研究通过同源克隆法克隆了CsRAX2全长,分析了该转录因子基因的生物信息和表达特征,在原核表达系统中诱导并纯化该蛋白。结果表明,CsRAX2全长939 bp,编码321个氨基酸,定位在3号染色体。CsRAX2蛋白定位在细胞核,与其他物种MYB的进化关系很近,是一个典型的R2R3-MYB转录因子。CsRAX2表达具有组织特异性,且低温处理显著诱导采后黄瓜CsRAX2表达,表明其可能在采后黄瓜低温反应调控中发挥作用。启动子元件分析显示,该基因启动子中含有多个环境和激素响应元件,表明非生物胁迫可能通过激素信号调控CsRAX2表达。原核表达研究表明,培养温度影响原核表达蛋白的诱导效果,降低细菌培养温度能提高上清液中融合表达蛋白产量。本研究结果为进一步研究黄瓜CsRAX2基因的生物学功能及黄瓜耐冷性机理提供了帮助。     

水稻金属硫蛋白OsMT-1-2a的原核表达及活性分析

本研究旨在研究水稻金属硫蛋白Os MT-1-2a基因原核表达情况及清除活性氧的能力。从水稻中克隆获得的Os MT-1-2a基因亚克隆至p ET32a原核表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了带有6x His标签的Os MT-1-2a全长重组蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在,分子量大小为32 k D,与预期大小一致。随后,通过镍柱法纯化目的蛋白,利用WST法表明纯化蛋白在体外具有一定的清除超氧化物的能力。