拟南芥AtTCP4基因克隆及原核表达

为进一步研究转录因子TCP4在植物生长发育过程中的调控作用和下游靶基因。利用生物信息学分析转录因子TCP4家族及其蛋白序列,扩增AtTCP4基因CDS序列、构建原核表达载体并诱导纯化获得蛋白,利用凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证AtTCP4蛋白与拟南芥功能基因LOX2启动子区域的顺式作用元件结合。生物信息学分析表明,拟南芥TCP蛋白含有非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域;系统进化树表明,AtTCP4属于Ⅱ类TCP蛋白;蛋白三级结构预测表明:转录因子TCP4可以形成同源或异源二聚体。特异性引物扩增获得AtTCP4基因的CDS序列,其开放阅读框(ORF)长为1 263 bp。构建原核表达载体pET-28a-AtTCP4并转化到Rosetta(DE3)感受态中,经IPTG诱导、纯化和Western Blot检测证明获得AtTCP4蛋白。EMSA试验验证AtTCP4蛋白能够结合到功能基因LOX2的顺式作用元件。转录因子TCP4结合功能基因LOX2启动子区域,影响植物激素茉莉酸的生物合成,调控植物的生长发育过程。     

毛竹PeGRF1基因克隆及初步功能分析

为了探究生长调控因子(GRF)转录因子在竹笋-茎秆生长中的作用,本研究以毛竹(Phyllostachys edulis)为材料,通过RT-PCR方法进行GRF基因的克隆,应用生物信息学方法对其序列进行分析,利用RT-qPCR对其在毛竹竹笋-幼竹的生长过程中的表达模式进行分析,并通过在拟南芥中异位表达初步分析其功能.结果 表明,从毛竹中克隆获得1个1164bp的GRF基因,命名PeGRF1,其编码387个氨基酸;蛋白序列分析表明PeGRF1具有完整的GRF特征结构域WRC和QLQ.进化分析显示,PeGRF1与水稻等单子叶植物的GRFs聚类在较近的分支,亲缘关系较近.在毛竹竹笋生长过程中,PeGRF1主要在幼嫩竹笋中表达,在快速生长阶段的表达量明显高于生长缓慢时期,在竹笋顶端及中部的表达量明显高于基部.过量表达PeGRF1能增加转基因拟南芥的株高.本研究结果可为阐明GRF基因在竹子的生物学功能提供了参考.     

拟南芥核酸酶基因AtCaN2克隆及功能分析

为了研究拟南芥核酸酶AtCaN2基因在植物生长发育过程中的作用与功能,从拟南芥中克隆了核酸酶AtCaN2基因,并对该基因进行生物信息学分析,亚细胞定位分析,蛋白质诱导、表达、纯化及功能研究。结果表明,AtCaN2蛋白等电点为8.45,化学式为C₁₁₁₆H₁₇₈₈N₃₁₀O₃₃₅S₃,共含有3 552个原子数,为亲水性蛋白;AtCaN2与十字花科亚麻荠的同源性较高,同源性为87.89%,与谷子、高粱和玉米的同源性较低,同源性分别是56.42%,57.35%,56.47%,且在氨基酸序列中间具有高度保守的D-X-D序列;同时进化树分析显示AtCaN2与十字花科亚麻荠的亲缘性最近,与谷子、玉米等禾本科植物的亲缘性比较远,这些结果同氨基酸序列比对的结果一致;亚细胞定位结果显示其定位于细胞质,与预测结果相符;蛋白质诱导和纯化得到大小约为35 ku的His-AtCaN2融合蛋白;Western Blot分析显示,诱导表达的融合蛋白正确翻译表达,且没有出现结构上的断裂或者降解的情况;小量诱导...     

杜鹃RhFLS基因克隆及其功能分析

黄酮醇合成酶(flavonol synthase, FLS)是花色苷代谢类黄酮合成途径中重要的调控酶,该酶通过降解二氢黄酮醇生成黄酮醇。本研究通过RT-PCR和RACE方法首次克隆出‘比利时’杜鹃(Rhododendron hybrida)黄酮醇合成酶基因全长(GenBank:MW029478),命名为RhFLS。结果显示,RhFLS基因全长1 284 bp,编码428个氨基酸,蛋白质等电点为8.76,分子量大小为46 134.07 kD;RhFLS与山茶花(Camellia japonica L.)相应同源蛋白亲缘关系最近,为亲水性蛋白;二级结构中α-螺旋占29.26%、延伸链占22.27%、β转角占6.55%、无规则卷曲占41.92%。RT-qPCR分析表明,RhFLS在‘比利时’杜鹃雄蕊、雌蕊、花瓣和叶组织中均有表达,且具有组织表达特异性,在叶中表达量最高。测量了不同花期的总黄酮含量以及花色苷组分,红花总黄酮量在各个时期显著高于白花。红白花都含有矢车菊素、天竺葵素以及飞燕草素,而芍药素仅仅只有红花的第1阶段存在。该研究为杜鹃花花色调控分子机制提供了基础。     

棉花GhIQM1基因克隆及抗黄萎病功能分析

棉花是我国重要的经济作物,而黄萎病(Verticillium wilt)是棉花生产上的主要病害,严重危害棉花产量和纤维品质。本研究通过转录组数据分析筛选出1个与棉花抗病相关、不依赖Ca²⁺的钙调素结合蛋白基因GhIQM1。该基因受黄萎病菌和水杨酸(SA)诱导表达。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术研究其在棉花抗黄萎病中的功能发现,抑制GhIQM1基因表达增强了植株对黄萎病的抗性, TRV:GhIQM1植株病情指数、维管束褐化程度、体内病原菌积累量都显著低于TRV:00。qRT-PCR分析表明,抑制GhIQM1表达的植株接种黄萎病后,作为参与水杨酸途径中的3个重要基因NPR1、NPR3和PR5的表达量显著高于对照。以上结果初步表明,GhIQM1基因可能通过抑制SA途径负调控了棉花的黄萎病抗性。     

胡杨F-box基因克隆和功能分析

F-box蛋白在泛素-蛋白酶体途径中能够特异识别底物蛋白,调节多种激素的信号转导途径,并响应多种非生物胁迫,参与植物抗逆途径。胡杨(Populus euphratica)是中国西北沙漠唯一能成林的高大乔木树种,对盐碱、干旱、极端温度等抵抗能力较强,是研究林木抗逆机理的候选模式树种。本研究对胡杨耐盐性状关联分析获得的F-box基因进行克隆、表达特性分析、亚细胞定位和转化胡杨原生质体的耐盐性测定,旨在研究胡杨F-box基因的功能特性。胡杨F-box基因全长1 086 bp,编码361个氨基酸,含有一个F-box domain和一个F-box associated domain。q RT-PCR表明胡杨F-box基因在各组织中均有表达,无组织特异性,其表达受盐、高温、低温、干旱和ABA胁迫诱导。PEG介导的胡杨原生质体瞬时表达发现F-box蛋白定位于细胞核上,流式细胞术证实过表达F-box基因能够提高胡杨原生质体的耐盐性。研究初步揭示了胡杨F-box基因的表达特性和耐盐性,为进一步解析胡杨F-box基因的功能及胡杨抗逆分子机理提供帮助。     

拟南芥CAX 1基因克隆及表达载体的构建

传递逆境胁迫如盐胁迫、干旱胁迫和病菌感染响应的重要第二信使是钙离子,而且在拟南芥植物细胞内,钙离子浓度受到严格的控制。CAX 1定位于液泡膜,是将钙离子存储于液泡的钙离子通道。利用PCR技术从拟南芥植物中的cDNA扩增出基因CAX 1。在此基础上将扩增出来的含有CAX 1基因片段与pMD 18-T载体连接得到重组质粒,再连接在pBI 121质粒的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,转化在感受态的大肠杆菌后经过培养,并进行菌落PCR验证和酶切鉴定,以期为研究转运蛋白CAX 1过量表达株系是否影响植物抗病提供参考。     

水稻株高基因克隆及功能分析的研究进展

株高是水稻的重要农艺性状。近年来,随着分子生物学技术的不断改进和提高,许多以往报道的和新发现的水稻株高基因得到了克隆,并进行了深入的功能研究。研究结果表明,激素在水稻株高发育中起主要调控作用,尤其以赤霉素、油菜素内酯和独脚金内酯三类激素的作用最大。调控过程涉及到激素的合成与信号途径,以及激素之间的互作。同时也存在其他调控途径,表明水稻株高形态建成是一个复杂的生理过程。以水稻株高基因功能的介绍为要点,回顾了近年来国内外在该领域的研究进展。     

木薯MeSWEET3b的基因克隆及功能分析

SWEET基因家族是近年新发现的一类糖转运蛋白家族,对植物的生长发育、激素平衡及植物与微生物互作等方面有着重要的调控作用。为了探索木薯SWEET基因的功能,本研究通过RT-PCR的方法从木薯主栽品种‘华南9号’(SC9)的叶片中克隆得到了木薯MeSWEET3b基因,并对其进行了生物信息学分析和功能的初步探究。结果表明,木薯MeSWEET3b蛋白具有典型的SWEET蛋白结构域的特征,含有2个Mt N3＿slv结构域和7个跨膜螺旋;MeSWEET3b与拟南芥AtSWEET3基因、水稻OsSWEET3a、OsSWEET3b基因高度同源,都属于CladeⅠ的第一分支;木薯MeSWEET蛋白定位在细胞膜上,且行使转运半乳糖的功能。此外,木薯MeSWEET3b基因还受到木薯黄单胞菌Xam的诱导而高表达。本研究明确了木薯SWEET家族成员MeSWEET3b转运半乳糖这一重要功能,且受到病原菌Xam的诱导表达。本实验结果为进一步揭示木薯体内光合产物从源到库的运输分配以及木薯与微生物互作机理提供了理论依据。     

辣椒CaBRI1基因克隆与功能分析

为了解辣椒CaBRI1基因结构特征及功能,本研究以辣椒自交系6421为实验材料,克隆CaBRI1基因,对其进行生物信息学分析、亚细胞定位、表达模式分析,并采用病毒沉默(VIGS)初步验证该基因在辣椒中的功能。结果表明,CaBRI1编码区序列长3 642 bp,编码1 213个氨基酸;CaBRI1蛋白包含6个亮氨酸重复与1个磷酸激酶结构域,具有2个跨膜区域,N端跨膜螺旋可能为信号肽。洋葱表皮细胞GFP瞬时表达结果显示CaBRI1定位于细胞膜。RT-qPCR分析表明,6421同一发育时期不同组织中CaBRI1表达量存在显著差异,且都为茎尖中表达量最高。VIGS沉默6421中CaBRI1后,沉默植株发育迟缓、株高变矮,CaBRI1表达量显著下降。本研究结果可为进一步阐明CaBRI1在辣椒中的生物学功能提供参考。     

拟南芥swn突变体耐盐性的初步分析

SWN (Swinger)蛋白是多梳抑制复合体2(polycomb repressive complex2,PRC2)结构的核心成分之一,为了研究SWN在拟南芥中耐盐胁迫方面的作用,我们分析了拟南芥突变体swn与野生型之间转录组水平的基因表达差异,高盐胁迫下的萌发实验,以及与盐胁迫响应基因RD20 (Responsiv...     

澳洲坚果MiMYB3基因克隆及结构与功能分析

为研究R2R3-MYB转录因子家族成员在澳洲坚果生长发育、生物胁迫和非生物胁迫等的调控机制,利用PCR技术从澳洲坚果品种‘桂热1号’叶片中克隆MiMYB3基因。采用生物信息学和荧光定量PCR(RT-qPCR)对其结构及功能进行分析预测。本研究克隆获得MiMYB3基因cDNA序列全长1 110 bp (NCBI登录号:MN254977.1),开放阅读框(ORF)长度为951 bp,共编码316个氨基酸。MiMYB3属于R2R3-MYB家族,其不存在跨膜结构、无信号肽且定位于细胞核的不稳定亲水蛋白。系统进化分析将MiMYB3与AtMYB94、AtMYB96、AtMYB30、At MYB31和AtMYB60聚类为S1亚族。RT-qPCR分析发现MiMYB3基因主要受水杨酸处理诱导显著上调表达,表明MiMYB3响应水杨酸处理。推测MiMYB3调控澳洲坚果水杨酸生物合成途径相关基因的表达进而参与植物抗病过程,为深入研究其结构和功能打下基础。     

黄金茶CsDAM2基因克隆及其功能分析

休眠是通过植物体内相应基因的表达调控机制,使植物芽停止生长,以适应外界低温、短日照等不良环境条件的结果。茶芽打破休眠的早晚,密切关系到茶树经济生产的效益。为进一步掌握茶树芽休眠与解除的分子机理>本研究克隆了可能与黄金茶发芽早相关的转录因子(dormancy associated MADS-box CsDAM2),并在烟草中过表达CsDAM2,对CsDAM2转基因烟草和野生型烟草进行低温处理。结果表明,在相同处理条件下,随着温度的降低,同野生型烟草比较,转基因烟草电导率增加幅度小,并且叶绿素荧光值降低率低,说明在抗寒性能上,转基因烟草具有显著优势,进而一定程度上证实了 CsDAM2具有提髙茶树抗寒性的作用。本研究结果为进一步揭示茶树芽休眠与解除的分子机理提供了科学依据。     

拟南芥突变体L1.3的表型分析及遗传定位

本研究在转橡胶树Hb CBF1基因的拟南芥后代中,发现了一株矮小突变体。对其进行表型观察,发现突变体叶片颜色为深绿色、叶片椭圆、根系不发达、植株极度矮化、营养生长和生殖生长周期延长。通过基因组重测序技术对该突变体的遗传位点进行了定位,发现Hb CBF1基因的插入破坏了BRI1基因的编码,进而引起突变。通过实时荧光定量PCR对突变体中细胞周期相关基因CDKA、CDKB、CYCB1-1、CYCD3-1的表达量进行分析,发现这些基因的表达量显著低于野生型,推测BRI1基因的突变阻碍了细胞有丝分裂,从而造成矮化等表型。     

PH-START1调控拟南芥发育的功能分析

为明确PH-START1(At2g28320)调控拟南芥生长发育的功能,利用Real-time PCR技术对PH-START1在不同生长时期拟南芥的不同器官中的表达情况进行了分析,明确了PH-START1的时空表达特性;通过创制PH-START1功能获得和缺失的转基因拟南芥并分析其表型,明确了PH-START1在调控拟南芥生长发育过程中的生物学功能。Real-time PCR结果表明:PH-START1在拟南芥的根、叶、花、角果中都有表达。在幼苗期的根中表达量最多,在成苗期根中表达量逐渐减少;莲座叶中第6片莲座叶表达量最多,然后随着发育时间的延长逐渐减少;在花的发育过程中,随着花发育时间延长,PH-START1的表达量逐渐增多;授粉后3～5 d的角果中PH-START1的表达量最高,然后表达量逐渐降低,到授粉后9 d角果中PH-START1的表达量又略有增加。花中PH-START1在雄蕊中的表达量最高,其次是花瓣、萼片,在雌蕊中表达量最少。对PH-START1功能获得(过表达,OE)和缺失(T-DNA插入,ph-start1)的转基因拟南芥表型进行观察,分析PH-START1在调控拟南芥生长发育中的功能,发现过表达PH-START1拟南芥营养生长受到明显的抑制,地上部株型矮小、茎细弱、叶片明显变小,地下部根系发育也受到明显的抑制。这说明PH-STARTI在拟南芥生长发育中起负调控作用,为阐明和促控植物生长发育提供了理论依据。     

拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因AtCYS6克隆及功能分析

为了研究拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂AtCYS6基因在植物生长发育过程中的作用与功能,从拟南芥中克隆了半胱氨酸蛋白酶抑制剂AtCYS6基因,并对该基因进行生物信息学分析,亚细胞定位分析,蛋白质诱导、表达、纯化及功能研究。结果表明,AtCYS6蛋白等电点为5.85,化学式为C₁₁₇₉H₁₈₄₈N₃₂₂O₃₄₈S₆,共含有3 703个原子数,为亲水性蛋白;AtCYS6与十字花科的荠菜、荠蓝的同源性较高,同源性分别为81.1%,80.3%,同水稻、玉米和大豆的同源性较低,同源性分别为55.5%,54.3%,56.6%,且在氨基酸序列中间具有高度保守的Q-V-G(Gln-Val-Gly)序列;同时进化树分析显示AtCYS6与同属于十字花科的荠菜、荠蓝的亲缘性较近,同水稻、玉米、高粱、谷子等禾本科植物的亲缘性较远;亚细胞定位结果显示其定位于细胞质,与预测结果相符合;蛋白质诱导、表达和纯化得到大小约为52 ku的融合蛋白,其中AtCYS6蛋白质的分子量约为26 ku,与预测值相符合;West...     

龙眼DlWRKY25基因克隆及在成花进程中的功能分析

WRKY是植物中一类至关重要的转录因子,其与植物的生长发育过程以及胁迫响应有着密切的关系。从目前研究结果中得到,在龙眼成花诱导进程中部分WRKY基因也参与了其中,比如DlWRKY25。为了对龙眼WRKY基因的功能有更深入的了解,本研究以‘四季蜜’龙眼cDNA为模板克隆了龙眼DlWRKY25基因,同时对该基因的序列特征、成花发育过程与组织表达模式,亚细胞定位及过表达转DlWRKY25基因拟南芥进行研究。结果表明,龙眼DlWRKY25基因的开放阅读框(open reading frame, ORF)全长为1 056 bp,编码355个氨基酸。氨基酸序列显示DlWRKY25含有典型的WRKY结构域与锌指结构,属于Ⅲ型WRKY蛋白。亚细胞定位的结果显示,细胞核处有明显而又集中的荧光信号,表明DlWRKY25定位于细胞核。RT-qPCR结果显示,该基因在茎中有较高的相对表达量,并在‘四季蜜’龙眼的成花诱导阶段,显示特异下调表达。过表达转基因拟南芥植株结果显示,DlWRKY25在拟南芥中的过量表达能够加快植株的成花过程。     

蓖麻 PIP5K1 基因克隆、生物信息学及功能分析

蓖麻 PIP5K1 基因在植物生长发育和抗逆过程中起重要作用。为探究蓖麻 PIP5K1 基因在蓖麻物种中的生物学功能和不同时期雌性植株中的表达情况,以 aLmAB2 品系的蓖麻花序为试验材料,克隆 PIP5K1 基因,对该基因编码的蛋白质进行生物信息学分析,并对 PIP5K1 基因在不同时期雌性系植株的表达模式进行分析。结果表明：从蓖麻花序轴顶端将总 RNA提取出来,并将其反转录成 cDNA,克隆后得到一个全长为 2325bp 的 PIP5K1 基因片段,经测序后比对这一基因序列和 NCBI参考基因序列相同。对该基因所编码蛋白展开生物信息学分析,确定 PIP5K1 基因所编码蛋白质的氨基酸等电点为 8.85,氨基酸数目为 774,分子量大小为 87967.37Da,是一种亲水性稳定蛋白;无跨膜螺旋区,属于非跨膜蛋白;蛋白质二级结构由 α 螺旋、β 转角、伸展链及无规卷曲构成;三级结构与二级结构预测结果一致;与同属于大戟科的木薯亲缘关系较近,与其他科亲缘关系较远。qRT-PCR 分析表明,PIP5K1 在标雌系、单雌系、两性系花序中均有不同程度的上调和下调,推测 PIP5K1 基因参与蓖麻花序发育的调控。本研究为探究 PIP5K1 基因促进蓖麻植株的生长发育机制奠定了理论基础。