过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株的构建

本研究构建了带G418抗性的载体pFL61-G418,从酿酒酵母WT303菌株中克隆了真菌抗逆境基因tps1（海藻糖-6-磷酸合成酶基因）,再将tps1基因插入到pFL61-G418载体的NotI位点,构建pFL61-G418-tps1表达载体,并将该表达载体转化进入野生型拮抗酵母膜醭毕赤酵母菌株中。构建过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株,增强拮抗酵母菌的抵抗逆境的生存能力,从而提高其生活力及与病原菌的竞争力。结果表明成功地构建了过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株,说明pFL61穿梭质粒可以用来转化野生型拮抗酵母,G418抗性可以作为转化子筛选的阳性标记。该重组表达载体的成功构建,为野生型拮抗酵母的遗传改良提供了重要的理论依据。     

甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因(SPS3-1)的克隆与序列分析

以甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因(SPSⅢ-2,NCB1登录号为EU278617) cDNA序列为探针,对高粱EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,后经基因组PCR、分子克隆、序列分析验证分离了甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因组DNA序列(SPS3-1,GeneBank登录号为FJ750250).该序列全长6 325 by,包含13个...     

海岛棉pepc基因的克隆及序列和表达分析（英文）

 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxylase)对植物生理功能行使重要的调节作用。本研究根据NCBI已公布的EST序列利用RACE和genome walking技术从海岛棉品种7124中克隆了一个新的pepc基因,命名为Gb.pepc3。该序列全长3259 bp,含有一个2910 bp的开放阅读框,编码969个氨基酸,推测分子量为110.7 kd,等电点为6.08 I。对Gb.pepc3蛋白的同源性比对和系统进化树分析显示,Gb.pepc3与已报道的其他植物的pepc相似性很高,属于C₃型pepc。荧光定量PCR结果显示Gb.pepc3在棉花各组织中广泛存在,其中在胚中表达量最高,在纤维中表达量较低。在棉花发育各个阶段Gb.pepc3表达量不同,海岛棉在开花后15天Gb.pepc3表达量达到高峰期,而陆地棉开花后20天Gb.pepc3表达量达到高峰期。海岛棉和陆地棉间表达量差异明显。     

甘蓝型油菜海藻糖磷酸合成酶(TPS)基因家族的生物信息学分析

海藻糖磷酸合成酶(TPS)在植物响应多种非生物胁迫及生物胁迫时起着重要的作用,但目前对甘蓝型油菜中TPS基因的了解甚少.本研究运用生物信息学方法在甘蓝型油菜基因组中筛选甘蓝型油菜TPS家族基因,对鉴定出的31个BnTPSs基因进行分子特征、蛋白特性、蛋白结构域、保守基序、顺式作用元件、KaKs、染色体定位、系统进化树构...     

马蓝色氨酸合成酶基因的克隆、序列及表达分析

通过对马蓝转录组数据分析,从马蓝叶片cDNA中克隆得到了色氨酸合成酶基因完整的编码序列(CDS),长度为807 bp,命名为BcTSA(GenBank登录号:MG857654),可编码269个氨基酸,并对其蛋白质理化性质、结构域、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、编码蛋白的二、三级结构、亚细胞定位进行了分析。蛋白序列多重比对结果显示与其他植物的TSA蛋白序列具有一定的同源性,并通过qRT-PCR法检测BcTSA基因在不同器官的表达与外源激素茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)诱导表达情况。推测其编码的蛋白为亲水蛋白,相对分子质量为28.9 kD,理论等电点(pI)为5.65,无跨膜区;亚细胞定位分析结果显示,BcTSA定位在叶绿体中的可能性大,没有信号肽;有18个磷酸化位点,存在6个潜在的糖基化位点,二级结构主要由α-螺旋构成;BcTSA氨基酸序列与其它15种物种氨基酸序列的保守区域达到81.35%的相似性;BcTSA基因在马蓝不同组织中均有表达,在叶中的表达量最高,根中最低;另外,发现BcTSA基因响应外源诱导子对代谢的调控。BcTSA基因的克隆与序列分析,有助于研究BcTSA基因的功能,对提高马蓝有效成分的含量具有重要意义。     

农杆菌介导法将海藻糖合成酶基因转入芦荟的研究

采用农杆菌介导法将海藻糖合成酶基因otsA导入芦荟,共培养后的芦荟外植体在含10~15 mg L^-1 G418筛选剂的MS培养基上经多次筛选和分化,获得了一定数量的抗性再生芽,对移栽成活的抗性再生植株进行PCR检测,表明otsA基因已经导入芦荟基因组中,转化率约为0.77%。Southern检测表明,目的基因在60%的阳性植株基因组中表现为单拷贝整合,进一步证明otsA基因已经整合到芦荟基因组中。气相色谱法测定转基因植株的海藻糖含量表明,转基因植株中的海藻糖含量为未转化植株的2.934倍,证明otsA基因在转基因芦荟植株中已得到表达。     

微小毛霉（Mucor.pusillus）△6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达

目的：微小毛霉（Mucor.pusillus）△6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达。方法：以一株产γ-亚麻酸的微小毛霉为材料,通过PCR方法克隆得到的△6-脂肪酸脱饱和酶基因,构建重组的酵母表达载体pYMpD6D,将重组载体通过醋酸锂方法导入酿酒酵母中,并利用酵母表达系统证实该基因能导致酵母合成γ-亚麻酸。结果：通过GC分析,γ-亚麻酸占总脂肪酸量的6.53％,微小毛霉△6-脂肪酸脱饱和酶基因在酵母中得到了正确的表达。本实验为进一步研究△6-脂肪酸脱饱和酶基因家族和进一步利用该基因来改良作物奠定了一定的基础。     

SH-110菌海藻糖合成酶基因克隆、表达及酶学性质研究

为找到理想的工业化生产海藻糖合成酶基因工程菌,以长白山温泉SH-110基因组DNA为模板,PCR扩增编码Tres基因片段,克隆至pET-30a(+)原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3),实验中采用IPTG和乳糖同时进行对比诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和酶学性质研究。成功克隆了2912 bp的Tres基因,实验中发现加入IPTG和乳糖后,融合蛋白在胞内都得到了表达,而且添加乳糖诱导的蛋白表达量偏高。表达重组酶Tres相对分子量约为110 kDa,最适作用温度60℃,最适pH7.0。金属离子Ca2+、K+、Zn2+对重组酶有明显激活作用,Ba2+、Cu2+、Mn2+有明显抑制酶活作用。重组酶的动力学常数Km为8.823 mmol/L和Vmax为235.29 mmol/L。已成功在大肠杆菌表达重组Tres,为进一步研究利用基因工程菌生产大量海藻糖合成酶,进行大规模生产海藻糖提供理论依据。     

苦荞中查尔酮合成酶基因（CHS）的克隆

获得完整的苦荞查尔酮合成酶基因（CHS）信息并评价其进化地位,对分子辅助选育高黄酮含量的苦荞品种具有重要的指导意义。用RACE法克隆苦荞CHS基因,用生物信息学手段分析预测苦荞CHS基本理化性质和同源性,用临接法构建了该酶的系统发生树。获得1250 bp的CHS cDNA全长,含241 bp的3’UTR和185 bp的5’UTR;等电点（pI）和分子量（Mr）分别为5.33和35340.75 Da;克隆获得975 bp的开放性阅读框（ORF）。预测该基因编码含325个氨基酸残基的蛋白,氨基酸同源比对结果表明,苦荞CHS与蓼科的虎杖相似性很高;临接法构建的系统发生树结果表明,苦荞CHS与其他双子叶植物有共同的起源,与蓼科的金荞麦、甜荞、虎杖及石竹科的满天星亲缘关系较近。成功获得苦荞CHS基因的cDNA全长,克隆出完整的ORF,并确定了苦荞中该酶的进化地位和方向。     

甘薯肌醇-1-磷酸合酶基因的表达分析

采用RT-PCR技术克隆了甘薯肌醇-1-磷酸合酶基因的cDNA编码区,命名为IbMIPS-1.该基因由1 530个碱基组成,编码510个氨基酸,与蓖麻、烟草、芝麻、大豆肌醇-1-磷酸合酶的氨基酸序列比对表明,其同源性很高.将克隆的IbMIPS-1基因连接到pQE30载体,构建原核表达载体.实时定量RT-PCR分析结果表明,在茎线虫侵染甘薯块根后,IbMIPS-1基因被诱导表达,并且在侵染后的第4天表达量最高.推测该基因可能参与甘薯抗茎线虫病信号传导,以诱发甘薯茎线虫病抗性反应.     

陆地棉蔗糖磷酸合成酶基因家族的鉴定及表达分析

【目的】蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)是调控植物蔗糖代谢合成途径的关键酶,在植物光合产物的积累与分配方面发挥着重要作用,然而棉花中SPS基因的系统研究尚很少开展。本研究旨在对陆地棉SPS基因进行全基因组鉴定,并对它们的表达特性进行系统分析。【方法】基于已公布的陆地棉基因组序列,利用生物信息学和荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)等方法对陆地棉SPS家族基因的蛋白结构、进化关系、基因结构特征、染色体定位、基因复制和表达特性进行分析。【结果】(1)在陆地棉基因组中,共鉴定到10个Gh SPS基因(Gh SPS1-Gh SPS10);(2)Gh SPS蛋白具有植物SPS家族特有的两个保守的蛋白结构域和3个相对保守的蛋白磷酸化位点;(3)进化分析表明,Gh SPS蛋白可聚为A、B和C共3个亚族,其中A亚族成员最多,包含6个GhSPS蛋白;(4)位于同一亚族的GhSPS基因具有相似的外显子-内含子分布模式,但是外显子/内含子数目在不同亚族间差异很大;(5)GhSPS基因均匀地分布在陆地棉A亚组和D亚组的5条染色体上,片段复制可能导致了GhSPS基因在陆地棉基因组中的扩增;(6)转录组分析表明,不同亚族GhSPS基因具有不同的组织表达模式,A亚族Gh SPS基因在被检测的各个组织均有较高的表达,B亚族GhSPS基因主要在叶片中高表达,C亚族Gh SPS基因主要在纤维、叶片和花瓣中高表达;(7)进一步荧光定量PCR分析表明,GhSPS4在叶片中表达量很高,GhSPS1在叶片和花瓣中表达量较高,Gh SPS7和Gh SPS10在被检测的各个组织均有较高的表达,该结果与转录组分析结果相对一致。【结论】陆地棉SPS基因家族包含10个成员,分布在5条染色体上,可分为3个亚族,不同亚族成员呈现出不同的表达模式,为后续深入解析陆地棉SPS家族基因的功能奠定理论基础。     

陆地棉蔗糖磷酸合成酶基因家族的鉴定及表达分析

【目的】蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase, SPS)是调控植物蔗糖代谢合成途径的关键酶,在植物光合产物的积累与分配方面发挥着重要作用,然而棉花中SPS基因的系统研究尚很少开展。本研究旨在对陆地棉SPS基因进行全基因组鉴定,并对它们的表达特性进行系统分析。【方法】基于已公布的陆地棉基因组序列,利用生物信息学和荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)等方法对陆地棉SPS家族基因的蛋白结构、进化关系、基因结构特征、染色体定位、基因复制和表达特性进行分析。【结果】(1)在陆地棉基因组中,共鉴定到10个Gh SPS基因(Gh SPS1-Gh SPS10);(2)Gh SPS蛋白具有植物SPS家族特有的两个保守的蛋白结构域和3个相对保守的蛋白磷酸化位点;(3)进化分析表明,Gh SPS蛋白可聚为A、B和C共3个亚族,其中A亚族成员最多,包含6个GhSPS蛋白;(4)位于同一亚族的GhSPS基因具有相似的外显子-内含子分布模式,但是外显子/内含子数目在不同亚族间差异很大;(5)GhSPS基因均匀地分布在陆地棉A亚组和D亚组的5条染色体上,片段复制可能导致了GhSPS基因在陆地棉基因组中的扩增;(6)转录组分析表明,不同亚族GhSPS基因具有不同的组织表达模式,A亚族Gh SPS基因在被检测的各个组织均有较高的表达,B亚族GhSPS基因主要在叶片中高表达,C亚族Gh SPS基因主要在纤维、叶片和花瓣中高表达;(7)进一步荧光定量PCR分析表明,GhSPS4在叶片中表达量很高,GhSPS1在叶片和花瓣中表达量较高,Gh SPS7和Gh SPS10在被检测的各个组织均有较高的表达,该结果与转录组分析结果相对一致。【结论】陆地棉SPS基因家族包含10个成员,分布在5条染色体上,可分为3个亚族,不同亚族成员呈现出不同的表达模式,为后续深入解析陆地棉SPS家族基因的功能奠定理论基础。     

花生蔗糖合成酶基因的克隆及序列分析

蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶,在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要作用。为揭示蔗糖合成酶基因在花生中的抗逆机理,以花生基因组DNA为模板,利用染色体步移技术(GenomeWalking)中的TAIL-PCR技术扩增花生SuSy基因组序列和启动子区域,得到基因组序列6 189 bp,启动子预测分析表明,该序列包含约800 bp的启动子上游调控序列,13个外显子,12个内含子。启动子元件分析显示,该片段含有典型的TATA-box、CAAT-box,并存在低温响应元件LTR、GA响应元件、干旱响应MYB结合位点、厌氧诱导必要的顺式作用元件ARE等调控元件,及G-box、box4等光响应元件,说明花生SuSy基因的表达可能受低温、干旱、缺氧、光照等环境因素以及激素GA的调控。     

金丝桃素合成酶基因的克隆及其表达

自然条件下金丝桃素在植物中的含量较低且不稳定，提取工艺受其他物质的影响较大，在一定程度上限制了金丝桃紊在医药、食品等领域的应用。为了研究金丝桃紊合成途径并实现其体外转化，以贯叶连翘愈伤组织总RNA为模板，经RT-PCR扩增得到了编码金丝桃素合成酶的全长eDNA，即Hyp基因。将该基因克隆到原核表达载体pET30a中，成功构建金丝桃索合成酶表达载体pET30a-Hyp，并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中。含有重组质粒的克隆在IPTG诱导下，表达出金丝桃素合成酶融合蛋白，利用Ni柱纯化菌体裂解上清中表达的融合蛋白，对纯化产物进行SDS-PAGE分析，结果Hyp基因得到了高效表达，大小约为20kD。     

野芥芥酸合成酶基因fae1的克隆与序列分析

根据GenBank中脂肪酸延长酶基因fae1序列(AY 888037)设计了PCR扩增引物,以野芥总DNA为模板进行扩增得到了特异扩增条带.测序结果表明,该片段长1 651 bp,序列分析表明其氨基酸编码区为55～1 575 bp,不含内含子序列,共编码506个氨基酸.该基因序列已提交GenBank,登录号为FJ870905.BLASTn分析结果表明,野芥中fae1基因与其他芸薹属品系的fae1基因核苷酸同源性为76%～98%;BLASTp分析结果表明,野芥中的FAE1与油菜中FAE1存在32个位点差异,其中部分差异可能导致了芥酸含量的不同.     

小麦作物查尔酮合成酶（CHS）及其基因生物信息学分析

对已在NCBI上注册的普通小麦、蓝粒小麦、天蓝偃麦草查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)核酸和氨基酸序列进行分析。利用生物信息学软件研究3种作物查尔酮合成酶的酶学特性,对其组成成分、理化性质、亚细胞定位、跨膜结构、分子进化、蛋白质二级结构和结构域进行预测和推断。3种作物查尔酮合成酶基因长度均约为1.2 kb,编码394个氨基酸,三者氨基酸同源性很高,在蛋白质的其他预测中,发现三者均为不稳定蛋白,疏水性较强,二级结构以α-螺旋为主,但其他结构中有所差异,在进化树中可以看出蓝粒小麦与长穗偃麦草亲缘关系较近。通过分析发现,小麦类作物查尔酮合成酶有着与其他植物中该酶相同的特性,为进一步研究其他特殊的小麦类作物相关酶及其基因提供理论依据。     

干旱诱导性启动子驱动的海藻糖-6-磷酸合酶基载体的构建及转基因烟草的耐旱性

赵恢武等通过PCR程序克隆拟南芥（Arabidopsis thaliana（L.）Heynh．）的干旱诱导性启动子Prd29A及来自酿酒酵母（Sac—charomyces cerevisiae Hansen）的海藻糖-6-磷酸合酶基因（TPS），并将它们组成可在植物中表达的载体RT。通过根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens （Smithet-Townsend）Conn）LBA4404介导，获得转基因烟草（Nicotiana tabacum L.）。Southern分析表明，TPS基因已经整合到烟草基因组中。Northern分析表明，TPS基因的表达受干旱胁迫的诱导。转基因烟草的形态发生多种改变，包括植株变矮，茎变细，叶子呈柳叶状，腋芽明显，同时耐旱性得到增强。     

马铃薯蔗糖磷酸合成酶StSPS1的原核表达及抗体制备

为了对马铃薯蔗糖磷酸合成酶(SPS)编码蛋白StSPS1进行原核表达及多克隆抗体制备。从四倍体马铃薯品种川芋10号的块茎中克隆出了StSPS1基因,该基因编码区全长为3 165 bp,编码蛋白的长度为1 055 aa。随后基于构建的His标签融合表达载体PET30a-StSPS1,进行了StSPS1蛋白的诱导、变性、纯化、复性及兔免疫试验。结果发现,StSPS1蛋白分子量约为119.62 ku,在可溶性上清中的表达极少,主要在不溶的沉淀中表达,最佳的诱导条件为37℃下用0.5或1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h。由于StSPS1为包涵体蛋白,故对其进行包涵体变性处理,并利用His标签纯化出了与目的条带大小相符的蛋白,同时通过His抗体进行了蛋白质免疫印迹(WB)试验,发现在119.62 ku处检测到目标条带,说明StSPS1包涵体蛋白纯化成功。最后,通过将透析复性后的StSPS1蛋白注射进兔子皮下组织中,成功免疫出2个StSPS1的抗体,经过WB鉴定发现2个抗体均能在抗原和川芋10号叶片的总蛋白中杂出目标条带。综上,对马铃薯StSPS1蛋白进行了诱导及纯化,并成功制备了StSPS...     

小麦果聚糖合成酶基因6-SFT-D多态性及其与6-SFT-A2的累加效应

小麦6-SFT是果聚糖合成的关键酶基因。以23份六倍体普通小麦(AABBDD)、5份D基因组材料(DD)为多样性代表群体材料,通过测序分析小麦6-SFT-D基因的序列多态性,根据多态性开发6-SFT-D基因的功能标记,分析由154份六倍体普通小麦构成的自然群体的6-SFT-D基因单倍型(haplotype)与表型性状的关联特性和基因累加效应。在28份多样性代表群体中,共检测到6-SFT-D基因的4个多态性位点,均为单核苷酸多态性(SNP)位点,构成3种6-SFT-D基因单倍型;而在自然群体中只检测到6-SFT-D的两种单倍型。根据6-SFT-D基因2850 bp位点的T/C变异开发等位变异特异PCR标记。关联分析表明,6-SFT-D单倍型分别与灌溉条件下的千粒重和穗长显著关联,单倍型Hap I是提高千粒重的优异等位变异;在雨养和灌溉条件下,同时具有6-SFT-D与6-SFT-A2优异等位变异小麦材料的千粒重显著高于其他基因型材料,说明6-SFT-D和6-SFT-A2优异等位变异对于提高千粒重表现累加效应。     

枸杞抗坏血酸合成酶基因的表达特征与含量的相关分析

本研究采用紫外分光光度法和实时定量PCR法,分别测定了枸杞各组织中(叶,茎,花,青果,红果)主要抗坏血酸(ascorbic acid,As A)含量以及抗坏血酸合成过程中3个相关酶基因的表达情况,分析了As A含量与各基因表达量之间的相关性。结果表明,枸杞As A在叶和茎中含量最低,青果和红果次之且表达水平较为一致,花中含量最高。As A合成过程中3个关键酶基因协同表达且各酶基因相对表达量变化规律相似。此外,发育过程合成相关酶基因表达量与As A含量相关性分析表明,GLDH、AAO、APX 3个基因共同调控了枸杞各个组织部位中As A的合成与积累,其表达量和As A含量呈现正相关,且有协同增减的表达趋势,导致不同生长时期植物组织中As A含量存在差异。进一步说明,在生态因子调控下,枸杞As A合成关键酶基因的表达影响枸杞As A的合成与积累。