水稻WRKY转录因子OsWRKY76 RNA干扰载体的构建及表达分析

为研究水稻WRKY蛋白在应对各种生物以及非生物胁迫中发挥的作用,探明OsWRKY76是否参与调控水稻系统获得抗性,明确OsWRKY在植物抗病及耐逆反应过程中的作用机理,对OsWRKY76进行了氨基酸序列分析,发现OsWRKY76具有典型的WRKY结构域,属于WRKY-GCM1锌指WRKY超家族。克隆了OsWRKY76中300 bp的cDNA片段OsWRKY76-300,并扩增GUS基因中500 bp的片段作为连接物,通过片段末端人为增加的酶切位点将上述片段与Gateway系统的入门载体pENTR L16连接,形成中间由GUS 500连接、两端是OsWRKY76-300反向重复的发夹结构的载体,利用LR反应将dsWRKY76 pENTR L16中发夹结构的插入片段分别重组到诱导型双元载体GVG-TA7002和组成型双元载体Ubi-C1300中,获得RNA干扰载体。利用农杆菌介导的转化方法将诱导型双元表达载体转化水稻,获得7个转化株系。利用实时定量RT-qPCR检测转化株系中OsWRKY76的表达量,获得了2个沉默株系。     

辣椒WRKY转录因子候选基因的瞬间表达分析

从辣椒cDNA文库中克隆获得一个推定的WRKY（CaWRKY）转录因子,为分析其功能,分别构建启动子区含有双倍W（2W）盒的报告载体和WRKY置于2x35S启动子控制下的超表达载体,通过基因枪瞬间转化技术将两种载体共转化洋葱表皮。检测共转化细胞中GUS基因的表达情况来分析转录因子与特定顺式作用元件的结合及对其转录的激活效应。结果表明CaWRKY能与W盒结合,表明该基因是WRKY转录因子的编码基因。     

水稻中一个SUSIBA2相似基因的克隆与表达分析

大麦SUSIBA2是一个WRKY转录因子,它能够识别糖响应元件,激活异淀粉酶基因iso1和淀粉分支酶基因sbeIIb的表达,从而影响胚乳中淀粉的合成。我们根据SUSIBA2的序列,从水稻基因组序列中搜索到一个与其相似的WRKY基因（称为SUSIRI）,含6个外显子。采用RT-PCR技术,我们从水稻的幼穗中克隆到该基因的cDNA,全长为1921bp,其中ORF长1755bp,可编码584个氨基酸,并具有典型的双WRKY结构域,与大麦的SUSIBA2相似度达81%。Northernblot分析结果显示,该基因在水稻抽穗至种子成熟的发育过程中,在稻穗中的表达活性是逐渐减弱的。     

大豆转录因子基因GmMYBJ7的表达及功能分析

MYB转录因子广泛参与植物的生长、发育、生理代谢的调控及胁迫应答,它们均具有保守的MYB结构域。GmMYBJ7是从大豆中分离获得的一个新的MYB基因(GenBank登录号:DQ902864)。亚细胞定位检测结果表明,Gm-MYBJ7蛋白定位于细胞核中;半定量RT-PCR检测结果显示,在紫外辐射、高盐及干旱(PEG)等非生物胁迫处理下,GmMYBJ7在大豆品种吉林3号中的表达量明显降低;构建植物表达载体pCAMBIA2301-GmMYBJ7,利用农杆菌介导法转化烟草NC89,在GmMYBJ7的阳性转化受体中,总黄酮的含量则明显减少。推测GmMYBJ7可能通过对类黄酮生物合成的调控参与植物的基础生理代谢。     

洋甘菊WRKY转录因子的鉴定及表达分析

为了系统分析德国洋甘菊WRKY基因家族,本研究利用生物信息学方法,从德国洋甘菊转录组共鉴定出42个WRKY转录因子,包括12个Ⅰ型基因,1个Ⅱ-a型基因,5个Ⅱ-b型基因,11个Ⅱ-c型基因,5个Ⅱ-d型基因,3个Ⅱ-e型基因和5个Ⅲ型基因。保守基序分析显示,同类型的基因拥有特异性的保守基序。表达谱数据分析表明,德国洋甘菊WRKY基因至少在一个组织中表达,并具有器官特异性。5个MrWRKY基因只在根中表达,1个MrWRKY基因只在茎和根中表达,2个MrWRKY基因只在茎和叶中表达,2个MrWRKY基因只在根和叶中表达。这一研究结果为进一步解析德国洋甘菊WRKY转录因子的功能提供了科学基础。     

番茄WRKY转录因子in silico鉴定及表达分析

WRKY蛋白是植物中最大的转录因子家族之一,对植物的生长发育具有重要调控作用。本研究利用番茄全基因组测序结果鉴定了WRKY基因,分析了其系统发育关系,内含子-外显子结构,染色体上的分布及其表达方式。研究表明:番茄中存在81个WRKY转录因子,分为三类(Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ),第Ⅰ和Ⅱ类分别细分为2和5个亚类,这些基因不均匀分布在番茄的11条染色体上;基因结构分析表明番茄WRKY转录因子进化过程中可能发生内含子的缺失/获得事件;不同芯片表达分析表明WRKY基因不仅参与了番茄根、子叶和真叶等不同组织类型的生长发育,而且还参与了一些生物胁迫(盐)和非生物胁迫(真菌激活子)的反应。     

谷子SiWRKY03基因的分子特征与表达分析

WRKY是参与植物生长发育与抗逆反应的一类转录因子。为了解谷子中SiWRKY03基因的功能,利用生物信息学软件分析了其生物学特征,采用Real-time PCR技术检测了SiWRKY03转录因子在谷子不同组织部位和抗谷锈病过程中的表达丰度变化。结果表明,SiWRKY03基因的开放阅读框全长为1 137 bp,编码378个氨基酸,预测分子质量为39.73 ku,理论等电点(pI)为5.91,含有1个WRKY保守结构域。该蛋白质二级结构的最大元件是无规则卷曲,最小元件为β-转角。进化分析表明,SiWRKY03与糜子(RLM93064.1)和哈氏黍(PAN29607.1)的氨基酸序列同源性最高,为99%。组织表达分析表明,该基因在谷子根、茎、叶和穗中均有表达,其中根中表达量最高,穗中表达量最低,与转录组数据一致。在谷子响应锈菌胁迫反应的120 h内,SiWRKY03基因在抗病反应的12,36 h上调表达,而感病反应过程中无显著性变化,推测SiWRKY03在谷子抗锈病反应中起正调控作用。上述试验结果为进一步研究SiWRKY03基因功能与抗病机制奠定理论基础。     

水稻转录因子bHLH家族基因响应环境胁迫表达谱分析

植物转录因子在植物的生长发育及其对外界环境的反应中起着重要的作用。bHLH转录因子是植物转录因子最大的家族之一。本研究以水稻日本晴为材料,在苗期进行PEG模拟干旱胁迫和ABA（abscisicacid）处理,采用荧光定量PCR方法,比较分析干旱胁迫差异表达的22个候选bHLH家族基因在PEG和ABA处理下的不同时间梯度的表达谱。结果表明大部分候选基因的PEG胁迫表达谱与干旱胁迫表达谱一致,验证了芯片结果的可靠性;而在ABA处理下的大部分bHLH基因表现为抑制表达,部分基因的表达谱与干旱或PEG胁迫表达谱明显不同,推测这些bHLH基因参与PEG和ABA胁迫应答的具有相同或不同的分子路径或模式。研究结果对进一步克隆这些基因及分析其在植物生长发育过程中的分子调控模式打下了基础。     

白芨转录因子基因BsWRKY14的克隆与分子特性分析

WRKY转录因子在调节植物生长发育、抵抗生物和非生物胁迫响应中发挥重要作用,分析WRKY家族成员的基因序列信息,为进一步研究基因功能提供前期研究基础。基于白芨转录组数据,对Bs WRKY14基因进行克隆;利用生物信息学方法对BsWRKY14蛋白的理化特征、保守结构域和亚细胞定位等特性进行分析,用DNAMAN和MEGA 6.0进行氨基酸多序列比对和进化关系分析。结果表明Bs WRKY14基因包含1个1 179 bp的开放阅读框,编码392个氨基酸,预测是定位在细胞核中的不稳定亲水性蛋白,无跨膜结构域,BsWRKY14蛋白包含一个WRKY基因保守结构域和一个C2H2锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员;Bs WRKY14与铁皮石斛WRKY蛋白亲缘关系最近。白芨Bs WRKY14基因的克隆与分子特性分析为深入研究BsWRKY14基因在调节白芨生长发育和逆境胁迫响应中的作用提供数据支持。     

辣椒WRKY转录因子的鉴别及进化分析

为了深入了解WRKY转录因子调节植物生长发育的过程,以辣椒全基因组和辣椒疫病转录组测序数据为材料,利用生物信息学方法分析辣椒WRKY转录因子的数目、种类、系统发生学和保守基序特征。结果表明,辣椒基因组中至少存在40个WRKY基因,包含1~2个WRKY保守结构域,根据WRKY结构域的数量及锌指结构的特征可将其分为Ⅰ、Ⅱ( a)、Ⅱ( b)、Ⅱ( c)、Ⅱ( d)、Ⅱ( e)和Ⅲ类/亚类。辣椒WRKY基因的保守motif共有3个,motif长度最长为50,最短为21,辣椒WRKY编码的蛋白为151~747个氨基酸,平均氨基酸数量为378.1个。该研究对辣椒WRKY基因功能的研究及进化具有重要的意义。     

SUSIRI基因的生物信息学分析及亚细胞定位

转录因子是植物生长发育及其对外界环境的应答反应中起重要作用的蛋白调控因子,一般含有DNA结构域、转录调控域、寡聚化位点和核定位信号。WRKY蛋白是一类具有重要作用的转录调控因子。在水稻的基因组中预测到的WRKY基因多达103个,对这些基因的功能加以注释具有重要的意义。SUSIRI基因是前人从粳稻日本晴中克隆的一个WRKY家族的转录因子。其开放阅读框长度为1755 bp,可编码584个氨基酸,具有典型的双WRKY结构域。为了进一步研究SSUSIRI基因,阐明它在水稻中的生物调控功能。通过应用生物信息学的方法,对该基因的预测蛋白进行了结构与功能的分析。利用EBI的interpro数据库分析SUSIRI基因序列的基序(motif),并结合NCBI的CDD(conserved domains)数据库分析该蛋白的保守结构域,用DNAMAN软件和CBS的TMHMM软件分析蛋白氨基酸残基的亲（疏）水性特点和跨膜结构域,用CBS的Protcomp version9.0软件和Protfun软件分别分析了蛋白的亚细胞定位和功能预测;通过实验设计把SUSIRI基因与GFP基因相融合,构建了由actin启动子驱动的SUSIRI基因的荧光表达载体pNSUGFP。通过采用基因枪法把该载体转入洋葱表皮细胞进行亚细胞定位鉴定。结果表明,生物信息学预测值显示：SUSIRI基因具有转录、转录调控、信号转导类功能的可能性最高,预测值分别为0.973、1.598和0.602;同时,其参与翻译功能、中间代谢功能和脂肪酸代谢功能的可能性也较大,预测值分别为4.800、1.490和1.265;由于SUSIRI蛋白中含有的亲水性氨基酸残基较多,该蛋白不具有跨膜性,是一种非跨膜类蛋白。对其亚细胞定位预测表明：在其氨基酸序列中含有较强的核定位信号,所以定位于细胞核内的可能性很大。进一步用荧光显微镜对基因枪轰击的洋葱表皮细胞的观察发现：对照的GFP蛋白主要沿细胞壁表达,而SUSIRI-GFP融合蛋白在细胞核中有很强的表达。通过试验研究得出：SUSIRI基因可能是一个参与中间代谢调控功能的基因,主要在基因转录环节发挥作用,是一种核定位蛋白。     

普通小麦春化基因VRN1 RNA干扰载体构建及转基因小麦获得

为进一步探究春化基因VRN1在小麦发育进程中的功能,利用荧光定量PCR分析了VRN1基因在不同发育特性小麦品种新春2号、京841中的表达情况。结果表明,随着生育进程的推进,VRN1基因在新春2号叶片和茎尖中表达量均呈上升趋势,VRN1基因在京841叶片中呈波动上升趋势,在茎尖中表达量趋于0;以p FGC5941载体为基础构建含有VRN1反向重复序列的RNA干扰载体,利用农杆菌介导的茎尖转化法转化新春2号获得了再生植株,并通过PCR法检测获得了转基因阳性植株,为从分子水平上实现小麦发育特性遗传改良和创育小麦新种质奠定了基础。     

两个水稻D2基因等位突变体的表型分析及分子鉴定

通过EMS诱变粳稻品种日本晴,筛选到2个矮秆突变体s1-46和s1-96。突变体主要表现为株高降低,分别为野生型的44.7%和55.9%,且叶片直立,穗粒数减少,籽粒变短。暗处理时,野生型的中胚轴伸长,但突变体的不伸长,说明突变性状与油菜素内酯(BR)相关。外源活性BR处理后,突变体与野生型的叶夹角均变大,根长均变短,表明突变基因与BR的生物合成相关。遗传分析表明,该突变性状由1对隐性基因控制。通过与籼稻品种Dular杂交构建F₂群体,将该基因定位在第1染色体40.9 kb范围内。测序表明,该基因与参与BR生物合成的D2基因等位,其中s1-46第305位的氨基酸由脯氨酸突变成亮氨酸,而s1-96第370位的甘氨酸突变成谷氨酸。     

两个新的水稻Dwarf18基因强等位突变体的表型分析及分子鉴定

通过EMS诱变日本晴获得了s2-9和s1-146a两个矮秆突变体,其植株矮小,成熟期株高分别为日本晴的26.3%和19.2%;苗期叶片较宽,叶色深绿;穗型仍为散穗但穗长变短,粒型未发生改变。对水稻胚乳的α-淀粉酶诱导实验表明,这两个矮秆突变体与GA的信号传导途径无关,外源活性GA₃对水稻幼苗株高的促进实验显示它们应与赤霉素的生物合成有关。利用突变体与籼稻品种Dular分别杂交构建了F₂群体,精细定位表明这2个突变体的表型与水稻Dwarf18 (D18)基因紧密连锁。序列分析发现这两个矮秆突变体的D18基因均发生了突变：在s2-9突变体中D18基因的内含子3'' 拼接点发生单碱基突变,s1-146a中D18基因编码区的单碱基突变导致提前终止密码子的出现。RT-PCR结果显示,在s1-146a中D18基因表达明显增强,但在s2-9中未检测到D18基因的表达。     

融合表达乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶转基因马铃薯的表型分析

在叶绿体内创建光呼吸代谢支路降低光呼吸的损耗,必然会对植物的光合作用、氮同化和逆境响应造成影响,并最终导致植物生长发育及形态结构的变化。本研究通过在马铃薯叶绿体中融合表达乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase)和过氧化氢酶(Catalase)来分流光呼吸产生的乙醇酸,以期提高生物量和产量。结果表明,转基因植株的株高、叶面积、有效叶数和单株薯重与野生型相比均有所提高。同时,由于叶片形状、有效光合面积、有效叶数和株高等因子的变化,部分转基因株系出现块茎畸形和薯重降低的现象。     

RNA干扰水稻SBE3基因的表达对籽粒淀粉合成及其关键酶活性的影响

为探讨RNA干扰水稻SBE3基因的表达对籽粒淀粉合成及其关键酶活性的影响,以水稻品种中花11及以其为受体的转基因株系为材料,分别检测水稻SBE3基因的表达、籽粒发育各时期淀粉合成关键酶活性变化及直链、支链淀粉相对含量。结果表明,导入的SBE3基因RNA干扰结构成功地降低了目的基因的表达,并使其酶活性在籽粒发育各时期均显著降低并提前3 d达高峰期,且不同株系间具有差异。同时也使不同发育时期籽粒的ADPG-PPase和SSS及DBE活性均不同程度地显著降低,尤其以SSS和ADPG-PPase活性峰值降幅最大。此外,两个转基因水稻株系各时期籽粒直链淀粉含量均显著高于对照,而其成熟籽粒千粒重却显著降低,直链淀粉含量越高,千粒重越轻。     

以RNA干扰γ-氨基丁酸转氨酶1基因(OsGABA-T1)表达提高稻米γ-氨基丁酸(GABA)含量

γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳非蛋白质氨基酸, 具有降血压等功能。为提高稻米中GABA含量, 利用RNA干扰技术, 构建水稻中GABA代谢关键酶GABA转氨酶1基因(OsGABA-T1)的干扰载体, 通过农杆菌介导法, 将其转化至粳稻品种宁粳1号中。实时荧光定量PCR检测结果表明导入的RNA干扰结构成功地降低了目的基因OsGABA-T1的表达, 且干扰家系中OsGABA-T2基因表达也随之下降。对转基因T₃代稻米GABA含量测定发现, 糙米中GABA含量相对于对照增加了13倍以上, 精米中GABA含量也显著增加, 而其他主要氨基酸含量则没有明显变化。测定储藏4个月的转基因稻米发现, GABA含量仍具有较高水平。所以, 利用RNA干扰技术可有效提高稻米γ-氨基丁酸(GABA)含量, 为培育富含GABA的降血压功能性水稻品种提供基础。     

GFLVCP 基因 RNAi 载体构建及其在转基因烟草中的干涉效果

为探讨RNAi策略在抗GFLV基因工程中的效果,通过RT-PCR克隆获得了310 bp的GFLV外壳蛋白基因保守片段,采用Gateway技术将该基因片段连入目标载体pHELLSGATE12构建了RNAi植物表达载体,并通过农杆菌介导法转入烟草中,RT-PCR检测表明目的基因片段已整合到烟草基因组中并在RNA 水平上得到表达,病毒接种结果显示阳性植株的发病率明显低于对照,说明在转基因植株中dsRNA表达可干涉GFLV侵染过程。     

水稻窄叶突变体nal20的表型分析与基因定位

叶片作为植物光合作用的主要器官, 其面积的大小影响着光能利用率和最终产量。为了研究水稻叶片形态建成的分子机制, 利用 ⁶⁰Co-γ射线诱变粳稻品种春江06, 在M₂代中得到1份窄叶突变体, 命名为narrow leaf20 (nal20)。该突变体叶片变窄、株高降低、分蘖增多、茎节间缩短、抽穗期提前。本研究重点调查了3片功能叶的形态, 发现突变体叶片宽度减少了50%, 叶片长度变化较小。细胞学观察表明, 叶片变窄主要是由于表皮细胞数目的减少, 而细胞大小变化不大。遗传分析表明, 该突变体表型受1对隐性基因控制。利用具有多态性的InDel分子标记及nal20与Dular配制的F₂定位群体, 将该基因定位于第7染色体着丝粒区1.9 Mb范围内。二代测序结果表明, 在该范围内有455 kb的大片段缺失。本研究结果为窄叶基因NAL20的克隆和功能分析奠定了良好基础, 也为水稻株型改良提供了基因资源和育种材料。     

玉米ppc基因过表达对转基因水稻光合速率的影响

通过转基因技术将外源ppc基因导入水稻以期增加产量是国内外的重要研究领域。然而,关于ppc基因过表达能否提高转基因水稻的光合速率至今尚无定论。本研究将玉米ppc基因导入水稻中花8号,获得大量转基因水稻植株。经PCR筛选、PEPC活性测定、Southern和Western杂交分析,表明玉米ppc基因已经整合到受体水稻基因组中,并得到了正确和高效的表达。测定了温室内种植的T₁代6个PEPC活性不同的转基因水稻植株的光合速率,只有活性最高的株系的光合速率显著增加,增加的幅度为27.3%。在旱作栽培条件下测定了T₃代33个转基因株系的光合速率,结果表明在高温、高光强下,绝大多数转基因水稻的光合速率增加,最大提高了68.8%。比较6个转基因株系的T₁和T₃代看到,逆境胁迫条件下转基因水稻光合速率明显提高。以上结果表明水稻中导入ppc基因可以提高其光合速率,特别是逆境条件下的光合速率。