新疆红肉苹果转录因子MsMYBIO基因的克隆、序列分析及原核表达

目的：克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f．neiclzwet-zkyana（Dieck）Langenf]MYB10转录因子基因,进行序列分析和原核表达研究,为进一步探索红色发育机理及选育新的栽培红肉苹果奠定理论基础。     

翠冠梨PG基因家族两成员的克隆及其表达与货架期果实软化的关系

以早熟砂梨翠冠果实为材料,克隆了多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因家族中的两成员功PGj和PpPG2。PpPGI cDNA序列全长1793bp,开放阅读框为287-1666bp,DNA序列长2757bp,包括8个外显子和7个内含子,编码一个含有459个氨基酸残基的蛋白,预测的等电点（pI）为8．47,估计的相对分子质量为49...     

苹果MxIrt1基因的克隆与原核表达

根据植物IRT(Iron Regulated Transporter)家族的功能保守区设计引物,通过RACE法从缺铁胁迫处理的小金海棠根系cDNA文库中克隆得到了Fe²⁺转运蛋白基因cDNA全长,将其命名为MxIrt1(Malus xiaojinensis Iron regulated transporter 1)。将MxIrt1 cDNA片段与pET30a构建原核表达载体pEIrt,转化大肠杆菌BL21。SDS-PAGE电泳检测结果表明,以30℃、0.5mmol·L^-1 IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个40kD的蛋白。为进一步纯化和鉴定目的蛋白提供了试验基础。     

番木瓜诱导型基因CpPGIP2启动子的克隆与分析

【目的】获得诱导型基因Cp PGIP2启动子,并分析该启动子的功能。【方法】以番木瓜Cp PGIP2基因c DNA序列(HQ660394)搜索番木瓜基因组DNA序列,获得一段约2 000 bp的5’端上游DNA序列(ABIM01005077),参照该序列设计PCR特异引物,以番木瓜叶片DNA为模板克隆该启动子,并进行生物信息学分析。将3个启动子片段替换p CAMBIA1301载体中的Ca MV 35S启动子,构建缺失启动子表达载体,以GUS瞬时表达检测缺失启动子表达活性。【结果】获得了Cp PGIP2起始密码子上游长为1 981 bp的调控序列,经分析该序列含有真菌、脱落酸、赤霉素、光照等多种响应元件,为诱导型启动子。构建了1个启动子全长表达载体和2个5’端缺失启动子表达载体,分别命名为p D0-1981、p D1-1204和p D2-261。启动子在番木瓜果肉中的瞬时表达显示,长度为1 204 bp的启动子表达活性最强。并且,该启动子在根、茎、叶、果肉和愈伤组织中均有不同程度的表达,在近外果皮的果肉处和根部表达最明显。【结论】本研究获得了Cp PGIP2启动子序列,确定了表达活性最强的启动子长度,初步分析了启动子的表达模式和顺式作用元件,为进一步深入研究Cp PGIP2基因功能以及将该启动子应用于植物基因工程育种奠定了基础。     

红肉苹果(Malus pumila var.niedzwetzkyana)MpMYB30基因的克隆及表达载体的构建

MYB转录因子是植物转录因子中最大的家族之一,在转录调节中起着多方面的重要作用。实验利用RACE技术从野生红肉苹果(Malus pumila var.niedzwetzkyana Schneid.)中获得了MpMYB30的全长序列,利用生物信息学的方法对其蛋白进行了分析和预测并将其连接到pCAMBIA-S1300+植物表达载体中。结果表明,该基因全长为1661bp,推导的氨基酸序列经系统发育分析与葡萄MYB30及蓖麻MYB基因相似性最高,命名为MpMYB30,其N端含有2个约55个氨基酸组成的MYB特征结构域。该基因推导的MpMYB30蛋白的分子式为C1790H2794N538O584S12,相对分子质量为41579.8ku,等电点为6.30,不存在信号肽和跨膜区域,蛋白质结构以α螺旋为主。利用XbalⅠ和SacⅠ对重组质粒进行酶切,并将其连接到pCAMBIA-S1300+载体上,通过抗性筛选和PCR酶切检测,证实了MpMYB30基因已经构建到植物表达载体pCAMBIA-S1300+上。     

红肉苹果的研究进展

红肉苹果因具有迷人的色泽,且富含花青苷等多种酚类物质,受到了国内外人们的一致青睐,其基因来源主要是新疆野苹果的红肉型变种。近年来,在其特征特性、资源开发、遗传机制、调控网络等方面取得了较大发展。该研究对12个国家的相关研究进行梳理分析,以期为红肉苹果进一步研究和利用提供参考依据。     

苹果AFS基因的克隆与原核表达

 通过RT-PCR扩增到苹果α - 法尼烯合成酶(α-Farnesene Synthase, AFS) 基因的编码区全长,将其克隆到pET-30a ( + ) 上, 构建了该基因的原核表达载体pET-AFS, 转化大肠杆菌BL21。SDS2PAGE检测结果表明, 此基因表达了1个约66 kD的蛋白, 1 mmol/L异丙基-β - D - 硫代半乳糖苷( IPTG) 诱导该基因高效表达, 6 h表达量最高, 诱导产物以包涵体形式存在。     

白菜花茎发育相关基因BcPG17的表达特征分析

在从白菜‘矮脚黄’自交系Bcajh97-01中克隆获得多聚半乳糖醛酸酶基因BcPG17及其启动子序列的基础上,采用qRT-PCR、原位杂交和启动子融合表达载体瞬时转化技术,分析了该基因的表达特征。BcPG17的DNA全长为2 105 bp,包含9个外显子和8个内含子。ORF序列长度为1 344 bp,编码447个氨基酸残基。预测的编码蛋白的相对分子量为48.61kD,理论等电点为8.39,含有1个跨膜结构域,N末端具有信号肽序列,具有被分泌到细胞膜外起作用的特征;其氨基酸序列具有PG蛋白的4个典型结构域,与十字花科芸薹属的其他物种亲缘关系较近。通过qRT-PCR分析发现,BcPG17在开花期花茎中的表达水平最高,且在花粉发育的四分体时期和单核小孢子时期有表达。原位杂交试验结果也显示,BcPG17在开花期花茎的所有组织中均存在强烈的表达信号。通过对克隆获得的1 442 bp的BcPG17启动子序列分析,发现该序列含有与分生组织表达有关的顺式作用元件1个、与植物激素响应相关的作用基序和元件多个,以及花药特异基序4个和绒毡层降解延迟蛋白(TDR)结合位点2个;能够启动GUS信号在开花期花茎的...     

苹果铁结合蛋白基因的克隆及表达特性

 根据已报道的植物铁结合蛋白基因( ferritin) 的保守区域设计引物, 用RT2PCR 的方法从‘嘎拉’苹果叶片中获得铁结合蛋白基因的全长序列。该基因cDNA共有1 043个碱基, 其中编码区834bp, 编码277个氨基酸残基的蛋白质, 终止密码子后有209 bp左右的3’端尾随序列区。Southern杂交结果显示ferritin基因在‘嘎拉’苹果基因组中至少有7个拷贝存在。0.5 mmol·L ^{- 1}的柠檬酸铁处理‘嘎拉’苹果试管苗不同时间后的定量RT-PCR分析表明, ‘嘎拉’苹果的铁结合蛋白基因随着诱导时间的延长表达量增加, 说明该基因可能在转录水平上受铁诱导表达。     

新疆红肉苹果杂种一代的遗传变异

据《中国农业科学》2014年第11期《新疆红肉苹果杂种一代的遗传变异及功能型苹果优株评价》（作者陈学森等）报道，以新疆红肉苹果与“寒富”等苹果品种6个杂交组合的杂种一代868株实生苗及从中选育出的4个优株为试材，以国外引进的红肉苹果“德红脆”及苹果栽培品种“金冠”为对照。     

新疆野苹果研究进展

 新疆野苹果[Malus sieversii (Lebed.) Roem.]可能是栽培苹果（Malus domestica Borkh.）的祖先,主要分布在中亚地区的天山山脉,包括中国新疆伊犁的巩留、新源、霍城及裕民等,遗传多样性极为丰富。本文对新疆野苹果的发生、分类学地位、群体遗传结构、遗传多样性、生存现状及核心种质构建与新疆野苹果的保护保存等作一综述,旨在为新疆野苹果这一珍贵资源的科学保护与有效利用提供参考。     

新疆野苹果与栽培苹果香气成分的比较

 以中国新疆伊犁地区巩留县莫合镇的新疆野苹果4个实生株系及国光、红星、富士、金冠等苹果品种的成熟果实为试材, 采用顶空固相微萃取和气相色谱—质谱联用技术, 分析果实香气成分, 旨在为新疆野苹果资源保护与利用提供基本资料。结果表明, ①新疆野苹果含醇类等10类89种香气成分, 这些化合物单株间在种类和含量上均存在显著差异; 新疆野苹果与栽培苹果品种主要香气的种类和成分基本一致; ②但乙醛等12种香气成分在新疆野苹果中没有检测到, 其中7种为栽培苹果特有的特征香气成分;③缩醛类和内酯类化合物在栽培苹果品种中没有检测到, 同时检测到1 - 丁醇、丁酸乙酯、辛酸乙酯和大马酮等4种化合物为新疆野苹果特有的特征香气成分。     

新疆野苹果分离群体的构建和评价

【目的】为了建立合适的用于构建新疆野苹果遗传连锁图镨的分离群体,【方法】以新疆红肉苹果和‘红富士’为材料,利用人工授粉方法构建了分离群体,采用SSR分子标记技术对作图亲本多态性、杂种纯度和群体内部的遗传结构进行了检测。【结果】结果表明,新疆红肉苹果和‘红富士’的遗传差异较大;排除了15株不确定的个体,确定110株作为新疆野苹果遗传图谱构建的作图群体;株系间无重复现象;64对SSR引物组合在作图亲本间共检测到232个多态性位点,其中有191个位点在P<0.01水平上符合孟德尔期望分离比,占多态性位点总数的82.30%。【结论】选取该群体作为构建新疆野苹果遗传连锁图镨的分离群体是合适的。     

新疆野苹果矿质元素与糖酸组分的遗传多样性

 对新疆野苹果巩留和新源两个种下居群的88个实生株系果实的矿质元素、糖酸组分及其遗传多样性进行了研究,并与富士、金帅和红星品种进行了比较。结果表明,新疆野苹果的6种矿质元素（Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn）、3种糖（果糖、葡萄糖、蔗糖）组分及苹果酸含量的变异系数均在23%以上,表现出丰富的遗传多样性。其中钙平均含量是栽培苹果品种的3.1倍,而且可溶性糖的组成与栽培苹果品种表现出明显的差异。     

新疆野苹果性状的遗传变异及相关性分析

【目的】为了深入了解新疆野苹果种质遗传选择潜力和探讨性状遗传相关关系,【方法】以300个新疆野苹果株系为试材,调查花、叶片和果实的13个性状,系统进行了性状相关、主成分和通径分析。【结果】结果表明,新疆野苹果13个性状均存在较大遗传变异,且在单果质量和果实Ca含量方面变异突出,具有良好的选择潜力;果实单果质量与果实纵径、果实横径、叶片长度、叶片宽度、叶柄长度呈极显著正相关,果实横径对单果质量直接促进作用最大,可溶性固形物含量、果实纵径、果形指数和叶片长度可作辅助选择性状。【结论】新疆野苹果各性状存在较大变异,性状间存在显著或极显著相关,具有良好的选择潜力。     

红肉苹果组织培养及转基因体系的建立与优化

于早春取红肉苹果植株上当年生茎段,建立其组织培养体系,并对其组织培养体系进行优化.结果表明:在添加0.2 mg/L IBA+-1.0 mg/L TDZ的MS培养基上红肉苹果叶盘不定芽诱导率最高,再生率为100％,平均每个叶盘再生9.57个不定芽;1 mg/L IBA+I mg/L BAP组合有利于植株扩繁,其扩繁率为8.27;添加0.6mg/L IBA的培养基上的生根率最高,为93.3％.转基因测试结果表明,农杆菌菌株EHA105适于红肉苹果的基因转化;农杆菌浸染后进行3d的共培养有利于转化效率的提高.     

杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白PbCBL10基因的克隆和表达特性研究

【目的】为了探明杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein,CBL)基因的序列特征和表达特点,【方法】以杜梨幼苗为试材,运用同源克隆和半定量RT-PCR对PbCBL10基因进行克隆和表达分析。【结果】结果表明,PbCBL10基因编码区cDNA长度为801 bp,编码的多肽由266个氨基酸组成。该多肽预测的等电点为4.56,估计的相对分子质量为30.45 ku。其对应基因组DNA序列长1 983 bp,包括9个外显子和8个内含子。通过PSORT进行亚细胞定位分析发现PbCBL10蛋白位于质膜上的几率最大。PbCBL10基因编码的多肽具有4个钙离子结合域EF手形结构和1个钙调磷酸酶A亚基结合位点。PbCBL10与番茄SlCBL10(NP_001239045)和拟南芥AtCBL10(NP_195026)蛋白间的同源性较高,分别为82%和77%,并与AtCBL10亲缘关系最近。PbCBL10基因在杜梨幼苗根、茎和叶片中均为诱导型表达,50~200 mmol.L-1CaCl2、20μmol.L-1ABA、100 mmol.L-1NaCl、10%(w/v)PEG6000或180 mmol.L-1甘露醇处理后其表达量明显上调。【结论】PbCBL10基因具备植物CBL基因家族的固有特征,能够响应胞内钙浓度变化,对ABA、盐碱、干旱和渗透胁迫均存在转录响应。     

中矮1号梨砧木(S_2)PGIP基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,根据GenBank中梨属PGIP基因序列设计1对特异引物,以梨矮化砧木S2叶片总RNA为模板,克隆到1条约1100bp的cDNA片段,将其与pMD18-Tvector连接后转化Escherichia coli JM109,对筛选到的阳性克隆进行序列测定并使用生物信息学方法对所得结果进行综合分析。结果表明,克隆片段为梨PGIP基因,该cDNA编码330个氨基酸,预测分子量为36388ku,第1～24个氨基酸残基是信号肽。与梨属其它种中已获得的PGIP核苷酸序列开放阅读框(Open reading frame,ORF)的同源性为97.5%～99.6%,氨基酸序列的同源性为97.6%～99.1%。     

新疆野苹果居群年龄结构及郁闭度研究

对新疆巩留与新源2地的新疆野苹果居群年龄结构及郁闭度进行测定和分析,旨在为新疆野苹果资源的保护保存提供依据。结果表明,在随机选取的200个单株中,巩留居群Ⅰ级幼树为0,而且Ⅱ级小树数量也极少,仅2株,只占1%,年龄级构成有下降性特征,存活曲线呈断点凸型,故年龄结构应属老衰类型,郁闭度为0.47;新源居群有Ⅰ级幼树,10株占5%,Ⅱ级小树达26株占13%,年龄级构成有稳定中略有上升的特征,存活曲线呈弧形凸型,故年龄结构应属稳定类型,郁闭度为0.80。上述结果显示,巩留新疆野苹果居群破坏严重,亟待加强保护,而新源新疆野苹果居群保存较完好。     

湖北海棠植物络合素合酶MhPCS基因克隆及表达分析

【目的】为了探明植物络合素酶参与植物解毒重金属的作用,【方法】以湖北海棠(Malus hupehensis)为试材,克隆其植物络合素合酶基因(MhPCS)编码区序列,并研究该基因的表达特点。【结果】结果表明MhPCS基因编码区全长为1 494 bp,编码497个氨基酸。序列分析表明,MhPCS编码的氨基酸序列由2个典型的植物络合素合酶亚家族结构域组成,具有3个相邻的Cys-Cys元件(331-332、351-352和369-370位氨基酸)和植物络合素合酶蛋白的特征位点(Cys-56、Cys-90/91和Cys-109)。【结论】湖北海棠MhPCS与杜梨PbPCS蛋白同源性最高(94%),属于系统发生树的同一分支。MhPCS基因为组成型表达,各器官表达水平存在差异,其中根的表达量最高;100μmol.L-1CdSO4处理48 h内,MhPCS基因的表达量迅速上升;不同金属离子对其上调表达的诱导能力为:Cd2+>Cu2+>Pb2+。这为揭示重金属胁迫下湖北海棠环境适应的分子机制奠定了基础。