表达猪细小病毒VP2蛋白和猪IL-18重组伪狂犬病毒的构建

为了获得表达猪细小病毒(PPV)VP2蛋白和细胞因子猪白细胞介素-18(IL-18)的重组猪伪狂犬病毒(PRV)。将PPV VP2基因和猪IL-18基因分别插入到PRV转移质粒PG中,得到重组质粒PG18-VP2。利用脂质体转染法将重组转移质粒PG18-VP2与猪PRV弱毒株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,以EGFP荧光标记,通过5轮蚀斑筛选纯化,成功获得表达PPV VP2蛋白和猪IL-18且带EGFP标记的重组伪狂犬病毒IL18-VP2-rPRV。用重组病毒感染ST细胞,12h后在荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光;通过RT-PCR证实感染细胞中含有PPV VP2和猪IL-18mRNA;Western-blot试验结果显示,重组病毒能表达具有生物活性的PPV VP2蛋白和猪IL-18。重组病毒经连续20次传代后感染细胞仍能发出绿色荧光,PCR检测表明VP2及IL-18基因在重组病毒中能稳定遗传。为进一步研究表达PPV VP2蛋白和猪IL-18的重组猪伪狂犬病毒的免疫效力奠定了基础。     

表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病病毒构建及其免疫原性

猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)均可引起母猪的繁殖障碍疾病。本试验以PRV基因工程弱毒株rPRVSMX为载体,构建了表达PPV流行毒株VP2基因的重组PRV(rPRVSMX-VP2)。Western blot和IFA试验均证明了重组病毒在细胞中成功表达了VP2蛋白。动物试验结果证明重组病毒可以诱导猪体产生特异性的PPV抗体,首免后40 d血凝抑制抗体(HI)为1∶192±73.9,虽然低于PPV商品化灭活疫苗免疫后所产生的HI抗体,但此时免疫系统被认为是激活的水平;重组病毒诱导产生的PRV抗体与载体毒株rPRVSMX诱导产生的抗体相当。由此可见该重组毒株经过优化后,可以作为二联疫苗的候选毒株防控猪伪狂犬病和细小病毒病。     

重组猪细小病毒VP2基因的猪伪狂犬病毒rPRV-VP2株的构建及纯化

参考GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)(M38367.1)基因序列,设计1对可以扩增出约1.6kb PPV VP2基因片段的特异性引物,上、下游引物的5′端均引入BamHⅠ酶切位点,PCR扩增得到VP2目的片段后,连接到pMD18-T载体中得到重组质粒pMD-VP2。取本实验室构建的含绿色荧光蛋白标记基因的伪狂犬病毒(PRV)通用转移质粒pG和构建好的pMD-VP2质粒,用BamHⅠ对质粒pG和pMD-VP2进行酶切,然后用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理,纯化回收后将VP2基因插入pG质粒中获得重组伪狂犬病毒转移质粒pGVP2。用脂质体转染法将PRV HB-98株全基因组与质粒pGVP2共转染ST细胞,得到携带有PPV VP2外源抗原基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2株。结合VP2基因PCR扩增和绿色荧光观察,经5轮病毒空斑纯化得到了纯化的重组病毒rPRV-VP2株。     

猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒在伪狂犬病病毒表达系统中的表达

利用PCR技术从猪细小病毒（PPV）SC1株基因组中扩增VP2全基因,并将其插入真核表达载体pPI-2.EG-FP中,构建转移载体pPI-2.EGFP.VP2。采用脂质体介导法将猪伪狂犬病病毒（PRV）SA215株DNA与pPI-2.EGFP.VP2DNA共转染Vero细胞,待出现细胞病变后收集病毒液。经空斑纯化,并同时采用检测PPV VP2基因的PCR方法筛选获得重组病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗体建立的免疫荧光技术可检测到Vero细胞发出的特异性荧光,表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因组中,并获得表达。进一步电镜观察表明,感染PRV SA215/VP2的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV 2种类病毒样颗粒。结果表明,成功实现了利用PRV载体表达PPV VP2蛋白病毒样颗粒,为进一步研制PPV病毒样颗粒疫苗奠定了基础。     

表达猪细小病毒VP2蛋白的猪伪狂犬病病毒rPRV-VP2株的生物学特性

探索重组PPV VP2基因的猪伪狂犬病病毒rPRV-VP2株作为弱毒疫苗候选株的潜在价值,对其在多种细胞上的增殖特性、病毒滴度、最适培养细胞中的遗传稳定性、一步生长曲线、转录和翻译水平等生物学特性进行研究,并初步探索对小鼠安全性。结果显示:重组病毒rPRV-VP2株在VERO、ST、PK-15和IPEC细胞上的TCID50分别为104.375/0.1mL、106.5/0.1mL、103.75/0.1mL、105.625/0.1mL。重组毒与亲本毒PRV HB-98株在ST细胞中的毒力(106.125 TCID50/0.1mL)和细胞病变相当,重组病毒保持了PRV病毒的通性。连续传毒20代后的绿色荧光观察、RTPCR、Western blot试验结果均表明重组病毒中的VP2基因得到了有效表达,且遗传稳定性良好。安全性试验结果显示:重组毒对小鼠安全。本试验为后期对PPV VP2基因重组猪伪狂犬病毒rPRV-VP2株的开发利用奠定了基础。     

从死胎猪分离到猪细小病毒和伪狂犬病毒

<正> 母猪流产死产是世界养猪地区普遍存在的主要疾病之一,造成经济上的重大损失。根据对我省部分猪场的初步调查,发现本病在我省也广泛存在。近年来本病在我国逐渐受到重视,上海潘雪珠等首先从死胎猪分离到猪细小病毒;余永建等从死胎猪分离到伪狂犬病毒,邬捷等从死胎猪分离到乙型脑炎病毒。我们从本省猪场的死胎猪中也分离到了猪细小病毒和伪狂犬病毒,现报道如下。     

猪圆环病毒2型-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建

根据GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到表达PCV2 ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215（C）。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪圆环病毒2型和伪狂犬病毒的候选疫苗毒株。     

猪细小病毒VP2基因及其编码蛋白研究进展

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起猪繁殖障碍的重要病原之一，主要引起初产母猪不孕、流产、木乃伊胎、死产，而母猪本身并不表现临床症状，其他猪感染后也无明显的临床症状。PPV最先由Mary和Mahnet于猪瘟病毒组织培养时发现。从60年代中期，许多国家相继分离到该病毒并逐步明确其致病作用。我国于1982年由中国兽药监察     

猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒混合感染的诊治

2009年9月,贵州省贵阳市某养猪场暴发了以母猪流产和仔猪发热、神经症状为特征的疾病,经过流行病学调查、临床症状观察、病理解剖及实验室诊断,诊断为猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒混合感染。通过采取综合有效的防制措施,使猪场疫情得到及时、有效的控制。     

猪细小病毒BQ-C毒株VP2基因的鉴定及表达

本研究从临床发病猪采集病料,以PK15传代细胞进行病毒分离,通过PCR、血液凝集试验(HA)和电镜鉴定为1株猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV),命名为BQ-C。对分离的毒株进行测序,结果显示该毒株与GenBank登录的PPV BQ株同源性为100%。为获得该毒株结构蛋白VP2基因的表达产物,将VP2基因片段插入到原核表达载体pET-30a(+),得到表达重组质粒。经双酶切和测序鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE结果表明,获得的重组蛋白分子质量约为71.5 ku,与预期大小相符。Western blotting结果显示获得的重组蛋白能与PPV阳性血清特异性结合,表明重组蛋白具有良好的反应原性。结果表明,本研究成功分离了1株PPV BQ-C株,且表达的VP2重组蛋白可用于PPV血清学诊断和疫苗的研发。     

猪细小病毒结构蛋白VP2及其疫苗的研究进展

猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一,该病毒在世界范围内广泛存在并呈地方性流行, 给生猪的繁殖、发展带来了巨大的经济损失,故防制猪细小病毒病非常重要。PPV VP2蛋白是病毒粒子的主要衣壳蛋白,在体外能自我装配成病毒样颗粒,并能刺激机体产生抗PPV中和抗体,且可作为抗原转运载体,所以研究VP2对PPV新型疫苗研制至关重要。文章综述了猪细小病毒结构蛋白VP2及其疫苗的研究进展。     

猪细小病毒VP2的原核表达与多克隆抗体制备

克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。     

共表达与牛疱疹病毒1型VP22融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒E及M蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其免疫原性观察

为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因工程疫苗，以伪狂犬病毒（PRV）gE基因缺失标志疫苗株TK^-／gE^-／LacZ^＋为病毒载体，通过同源重组，构建了共表达与牛疱疹病毒1型VP22（BHV-1 VP22）融合的PRRSV E及M蛋白的重组伪狂犬病毒（rPRV）TK^-／gE^-／VP22E^＋／VP22M^＋。经PCR、Southern blot、Western blot证实rPRV构建正确，并能表达与BHV-1 VP22融合的PRRSV E及M蛋白。rPRV在IBRS-2、PK-15细胞中的增殖滴度与PRV亲本株相比无显著差异，表明外源基因的插入不影响rPRV增殖。用该rPRV免疫BALB／c小鼠,检测免疫小鼠抗PRRSV中和抗体及脾淋巴细胞增殖反应，并与未融合VP22的单表达PRRSV E蛋白及共表达E及M蛋白的rPRV TK^-／gE^-／E^＋与TK^-／gE^-／E^＋／M^＋进行比较。结果显示TK^-／gE^-／VP22E^＋／VP22M^＋可诱导小鼠产生更好的体液与细胞免疫反应，BHV-1 VP22发挥了佐剂效应。本研究为研制安全、有效的猪繁殖与呼吸综合征-伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了基础。     

猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达

利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0kb的基因片段，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列。将所得的核心苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较，同源性均在99%以上，从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性。将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2；将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f。利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况，结果发现pET17bVP2f质粒在45kD处有一特异性表达带，而其它几种质粒均未看到特异性表达带，推测VP2基因3‘端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响。这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义。     

猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用

根据猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的基因序列,分别选取各自的保守区段设计引物,通过反应条件的优化,建立了检测PPV、PRV和PCV-2的多重PCR方法.用建立的方法对采自陕西省部分猪场的286份病料及血样进行检测,从对临床健康猪全血样品中PPV、PRV和PCV-2的检测结果看...     

一株表达EGFP基因的重组伪狂犬病毒的构建及其复制稳定性分析

为探寻伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）基因缺失株rPRV-bc-8基因组UL4-UL3基因间区域是否可作为外源基因的插入位点,在实验室已构建的含有增强型绿色荧光蛋白（Enhance Green fluorescent protein,EGFP）基因的转移质粒pMD-US6+7-EGFP-US2的基础上,通过DNA体外分子克隆技术将UL4序列替换左同源臂US6+7序列,UL3序列替换右同源臂US2序列,并将PolyA引入转移质粒,得到转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3。利用脂质体转染法将转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3与亲本毒rPRV-bc-8共转染PK-15细胞,经蚀斑纯化成功得到一株能够稳定表达EGFP基因的重组伪狂犬病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3。通过倒置荧光显微镜观察以及PCR鉴定确定EGFP基因已成功插入到伪狂犬基因组的UL4-UL3之间,并通过细胞传代试验分析得到重组毒的遗传稳定性良好。通过体外增殖试验分析得到重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在细胞内的增殖速度较快,接种后12 h内滴度始终高于亲本毒rPRV-bc-8,接种后40 h达到最高滴度10^8.3 TCID₅₀/mL,与亲本毒的最高滴度接近,但是最高滴度的出现时间晚于亲本毒,并且在达到平台期后病毒滴度下降的比亲本毒快。通过对病毒培养液中荧光蛋白浓度进行测定,结果显示在接种后56 h时荧光蛋白浓度达到最高值4793.9 ng/mL,之后进入平台期。综上结果表明构建的重组病毒具有良好的遗传稳定性及体外复制能力,并且外源基因EGFP在此位点具有良好的表达效果,为进一步相关重组病毒的构建奠定了基础。     

猪细小病毒SY-99株VP2基因的序列分析

克隆并测定猪细小病毒SY－99株VP2基因，与NADL－2（4973）株、NADL－2（5075）株、Kresse株和US－1株VP2基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行比较与分析，发现PPV SY－99株与Kresse株VP2基因核苷酸和氨基酸同一性最高，推测SY－99株可能为一强毒株。     

分泌型和非分泌型表达猪细小病毒VP2蛋白的重组乳酸菌经口免疫小鼠的效果分析

对比分析在不同细胞部位表达猪细小病毒（PPV）主要免疫保护性抗原VP2蛋白的重组干酪乳杆菌系统作为口服疫苗的免疫效果。将构建的细胞表面表达和分泌表达猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌分别经口免疫BALB／c小鼠，免疫分3次进行，时间间隔为2周，每次连续接种3d，每只小鼠每次接种100μL10^10CFU／mL的菌量，对照组小鼠接种相同剂量的PBS。初免后不同时间收集免疫小鼠粪便及肠黏液样本测定小鼠产生抗PPV的特异性sIgA抗体水平，采集小鼠血液样本测定其血清中抗PPV的特异性IgG抗体水平。间接ELISA检测结果表明，两种表达系统均能诱导小鼠产生黏膜及系统免疫应答，分泌型的重组菌系统免疫小鼠诱导机体产生的抗PPV的特异性sIgA和IgG抗体水平高于细胞表面表达型的重组菌系统的免疫效果，表明分泌型的重组乳酸菌作为活菌疫苗具有更好的免疫性。     

猪细小病毒结构蛋白VP2研究进展

猪细小病毒(PPV)是引起猪繁殖障碍性疾病的重要病原之一,目前该病在世界很多国家均有流行和报道,给养猪业带来巨大损失。传统的灭活苗和弱毒苗又都存在各自的缺陷,新型诊断试剂及疫苗的研究迫在眉睫。VP2蛋白是病毒粒子的主要衣壳蛋白,具有在体外能自我装配成类病毒粒子,并能刺激机体产生抗PPV中和抗体,可作为抗原转运载体等特性,故VP2蛋白在猪细小病毒诊断试剂及新型疫苗研究领域具有很大的潜力。论文就VP2的分子生物学及其在该病诊断与预防等方面的研究进展进行了综述。