花鲈和西伯利亚鲟生长激素/类胰岛素样生长因子-Ⅰ轴相关基因全长cDNA的克隆和序列分析

本研究采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆花鲈(Lateolabrax japonicus)和西伯利亚鲟(Acipenser baerii Brandt)生长激素(GH)和生长激素受体(GHR)cDNA全长序列。结果显示:花鲈GH(Gen Bank登录号JQ995145)cDNA全长949bp,开放阅读框615 bp,编码204个氨基酸,预测分子质量为23.06 ku,与其他物种的相似性为36.0%~90.2%;花鲈GHRⅠ(Gen Bank登录号JX402001)cDNA全长3 070 bp,开放阅读框1 911 bp,编码637个氨基酸,预测分子质量为70.79 ku,与其他物种的相似性为32.2%~86.2%;花鲈GHRⅡ(Gen Bank登录号JQ995146)cDNA全长2 926 bp,开放阅读框1 749 bp,编码582个氨基酸,预测分子质量为64.42 ku,与其他物种的相似性为30.8%~81.4%。西伯利亚鲟GH(Gen Bank登录号JX003684)cDNA全长999 bp,开放阅读框645 bp,编码214个氨基酸,预测分子质量为24.14 ku,与其他物种的相似性为38.3%~70.1%;西伯利亚鲟GHR(Gen Bank登录号JX003685)cDNA全长2 283 bp,开放阅读框1 716 bp,编码571个氨基酸,预测分子质量为63.41 ku,与其他物种的相似性为39.5%~49.2%。花鲈和西伯利亚鲟GH和GHR cDNA全长序列的获得为进一步研究鱼类GH/类胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)轴对生长发育的调控机制奠定了科学基础。     

西伯利亚鲟肝脏中过氧化物酶体增殖物激活受体α、脂蛋白脂酶、肝脂酶基因全长cDNA克隆与序列分析

本试验通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆西伯利亚鲟(Acipenser baerii)肝脏中过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、脂蛋白脂酶(LPL)、肝脂酶(HL)基因全长cDNA序列。结果显示:西伯利亚鲟肝脏中PPARα基因(GenBank登录号KJ534588)cDNA全长1 736 bp,包括158 bp的5’非翻译区、1 401 bp的开放阅读框及177 bp的3’非翻译区;开放阅读框编码1个由466个氨基酸组成的蛋白质,预测其分子质量为52.3 ku,与其他物种的相似性为75.5%~82.4%。LPL基因(GenBank登录号KJ720972)cDNA全长1 760 bp,包括163 bp的5’非翻译区、1 506 bp的开放阅读框及91 bp的3’非翻译区;开放阅读框编码1个由501个氨基酸组成的蛋白质,预测分子质量为57.1 ku,与其他物种的相似性为48.7%~67.0%。HL基因(GenBank登录号KJ720973)cDNA全长1 740 bp,包括124 bp的5’非翻译区、1 500 bp的开放阅读框及116 bp的3’非翻译区;开放阅读框编码1个由499个氨基酸组成的蛋白质,预测分子质量为56.4 ku,与其他物种的相似性为55.4%~67.1%。通过构建系统发育进化树发现,西伯利亚鲟PPARα与高等脊椎动物的亲缘关系较近,LPL、HL与鱼类亲缘关系较近。本试验通过对西伯利亚鲟PPARα、HL、LPL基因同源性、系统进化地位的分析,为进一步研究西伯利亚鲟脂肪代谢调控机制奠定了分子生物学基础。     

花鲈摄食调控相关因子全长cDNA的克隆和序列分析

本试验采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆花鲈(Lateolabrax japonicus)调控摄食因子雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体蛋白S6激酶beta-1(S6K1)、神经肽Y前体(NPY precursor)和脑肠肽前体(preproghrelin)cDNA全长序列。结果显示:花鲈mTOR(GenBank登录号KJ746670)cDNA全长8 296bp,开放阅读框7 551bp,编码2 516个氨基酸,预测其分子质量为286.14ku,与其他物种的相似性为62.0%~98.0%;S6 K1(GenBank登录号KJ746671)cDNA全长2 232bp,开放阅读框1 539bp,编码512个氨基酸,预测其分子质量为56.87ku,与其他物种的相似性为80.4%~84.9%;NPY precursor(GenBank登录号KJ850326)cDNA全长676bp,开放阅读框300bp,编码99个氨基酸,预测其分子质量为11.26ku,与其他物种的相似性为53.6%~99.0%;preproghrelin(GenBank登录号KJ850327)cDNA全长1 201bp,开放阅读框324bp,编码107个氨基酸,预测其分子质量为12.03ku,与其他物种的相似性为19.6%~85.0%。花鲈摄食调控因子cDNA全长序列地获得将为进一步研究其摄食调控机理奠定基础。     

牦牛Hepcidin 基因的克隆与序列分析

根据GenBank中公布的普通牛Hepcidin基因序列(登录号为XM-589792.3)设计1对特异性引物。采用RT-PCR技术从牦牛肝脏组织总RNA中扩增出Hepcidin基因的编码序列并进行测序分析,同时构建Hepcidin蛋白物种进化树。结果显示,经克隆获得牦牛Hepcidin基因322 bp的cDNA序列（GenBank登录号为EU863791）,含289 bp的开放阅读框,编码82个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽;预测Hepcidin蛋白分子质量和等电点分别为8.88 ku 和 9.24;与已知普通牛Hepcidin序列的同源性达 99%,不同物种Hepcidin蛋白具有高度的保守性,Hepcidin蛋白物种进化树符合物种进化规律。本研究为Hepcidin基因cDNA 全长克隆及基因功能研究奠定了重要基础。     

牦牛Hepcidin基因的克隆与序列分析

根据GenBank中公布的普通牛Hepcidin基因序列(登录号为XM-589792.3)设计1对特异性引物.采用RT-PCR技术从牦牛肝脏组织总RNA中扩增出Hepcidin基因的编码序列并进行测序分析,同时构建Hepcidin蛋白物种进化树.结果显示,经克隆获得牦牛Hepcidin基因322 bp的cDNA序列(GenBank登录号为EU863791),含289 bp的开放阅读框,编码82个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽;预测Hepcidin蛋白分子质量和等电点分别为8.88 ku和9.24;与已知普通牛Hep-cidin序列的同源性达99%,不同物种Hepcidin蛋白具有高度的保守性,Hepcidin蛋白物种进化树符合物种进化规律.本研究为Hepcidin基因cDNA全长克隆及基因功能研究奠定了重要基础.     

小尾寒羊白介素1β全长cDNA序列克隆及生物信息学分析

本研究旨在克隆白介素1β(IL-1β)全长cDNA,为深入研究其生物学功能提供全长cDNA信息和试验材料.本试验利用前人构建的布鲁氏菌强、弱毒株感染小尾寒羊白细胞层抑制性差减杂交(SSH)cDNA文库,获得小尾寒羊IL-1β部分cDNA序列信息,利用cDNA末端快速扩增技术(RACE),克隆小尾寒羊IL-1β全长cDNA,并申请GenBank登录号KC425612.2.该cDNA全长1494 bp,含有801 bp开放阅读框(ORF),可编码266个氨基酸残基,预测其编码蛋白分子质量为30.622 ku,与林麝、牛、海豚、虎鲸的IL-1β一致性较高,亲缘关系较近.     

柞蚕腺苷酸转移酶基因的克隆与序列分析

腺苷酸转移酶(adenine nucleotide translocase,ANT)是线粒体内膜上的转运蛋白家族成员。从柞蚕(An-theraea pernyi)蛹全长cDNA文库中获得了柞蚕腺苷酸转移酶基因(ApANT)的cDNA序列(GenBank登录号FJ788509)。对该基因进行生物信息学分析表明:ApANTcDNA全长1 282 bp,含有1个903 bp的开放阅读框(ORF)序列,编码300个氨基酸;ApANT与烟草天蛾(Manduca sexta)等鳞翅目昆虫的ANT基因在核苷酸和氨基酸序列水平分别具有80%和90%以上的同源性,说明ANT蛋白在这些昆虫中是高度保守的;与其它已知鳞翅目昆虫的ANT蛋白一样,ApANT蛋白含有3个线粒体穿膜结构域,并且这3个保守结构域之间也显示出较高的相似性。     

野桑蚕羧酸酯酶基因(BmmCarE-2)的克隆及表达分析

羧酸酯酶参与昆虫对有机磷和氨基甲酸酯等杀虫剂抗性的产生。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了一个野桑蚕羧酸酯酶全长基因(BmmCarE-2)。序列分析表明该基因包含1个1 623 bp的开放读码框,有57 bp的cDNA5′端非翻译区序列(5′UTR)和79 bp的cDNA3′端非翻译区序列(3′UTR),编码540个氨基酸,GenBank登录号为EU328351。序列比对分析表明BmmCarE-2与家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-2(GenBank登录号:DQ311250)的氨基酸序列相似性最高,达98.9%。利用半定量RT-PCR进行组织表达分析表明,BmmCarE-2在野桑蚕幼虫的头部和脂肪体表达量较高,在丝腺和中肠稍低,而在血液中的表达量最低。     

鲤鱼白细胞介素10基因组DNA克隆及序列分析

为获得鲤鱼白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)全长基因组序列,本研究利用鲤鱼IL-10全长cDNA序列(GenBank登录号:JX524550),通过在两端非编码区设计引物,以提取的鲤鱼脾脏基因组为模板,使用PCR方法成功获得鲤鱼IL-10全长基因组序列。鲤鱼IL-10基因组全长2176 bp,GenBank登录号为JX524551。将所获得的序列与其他物种IL-10基因组序列相比,结果发现都含有5个外显子,4个内含子,外显子在进化上相对保守,剪切位点都符合"gt......ag"规则;序列包含540 bp的开放阅读框,编码179个氨基酸,有2段典型的IL-10氨基酸信号基序。     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列。序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1650bp,含一个462bp的内含子;其cDNA编码区全长1188bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470。该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点。     

山羊MMP-9基因cDNA的克隆及生物信息学分析

为了克隆山羊基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因的cDNA片段,分析其基因序列,试验于无菌条件下采集泌乳期奶山羊乳腺组织并提取总RNA。根据已知其他物种的MMP-9基因保守性区域设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增MMP-9基因的CDS区,测序后对核苷酸和推导的氨基酸序列进行分析,并对8个物种进行聚类分析。结果表明:得到长度为2 245 bp的MMP-9基因cD-NA片段(GenBank登录号为JQ670877),其中包含2 130 bp的CDS全长;核酸序列分析结果显示,该基因编码709个氨基酸,与人、小鼠和牛的核苷酸序列进行比对,相似性分别为84%、80%、96%,氨基酸相似性分别为79%、73%、94%。     

彭泽鲫葡萄糖激酶基因全长cDNA克隆及表达分析

本试验采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆获得了彭泽鲫(Carassius auratus var.Pengze)葡萄糖激酶(GK)基因全长cDNA序列.结果表明,该cDNA全长2 050 bp,含1个1 43l bp的开放阅读框(ORF),编码476个氨基酸,GK蛋白计算分子量为53.78 ku...     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554 bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1 650 bp,含一个462 bp的内含子;其cDNA编码区全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470.该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点.     

结缕草肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及序列分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,提取结缕草叶片的总RNA,进行RT-PCR。并采用RACE技术扩增出1560bp的Actin基因全长cDNA序列。序列分析表明,该基因的开放阅读框(ORF)为1134bp,编码377个氨基酸,5′非编码区117bp,3′非编码区309bp。所得序列与GenBank中收录的其他植物肌动蛋白核苷酸序列的一致性均在85%以上,氨基酸序列的一致性高达97%以上。将其命名为ZjACT,GenBank登录号为GU290545。根据高等植物肌动蛋白相似性构建的系统进化树显示,结缕草肌动蛋白与大麦和圆锥小麦肌动蛋白之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。进一步分离克隆了结缕草Actin基因的基因组DNA序列(登录号GU290546),它由4个外显子和3个内含子组成。本研究有助于揭示植物Actin基因家族的进化历史,为研究植物Actin基因家族功能和进化上的多样性奠定理论基础,同时也为开展草坪草和牧草Actin基因的功能分析和利用研究提供参考。     

东方山羊豆蔗糖转运蛋白基因克隆及表达载体构建

根据已知的EST序列,采用RACE技术克隆了东方山羊豆蔗糖转运蛋白基因全长eDNA,命名为GoSUT(GenBank accession No.HM802255).序列分析结果表明,该cDNA全长1883bp,开放阅读框1545bp,编码514个氨基酸.应用生物信息学软件对编码蛋白的理化性质、结构和功能进行了分析和预测...     

柞蚕蛹全长cDNA文库的构建和随机EST测序

采用RNA转录5′末端转换(SMART)技术构建了柞蚕(Antheraea pernyi)蛹的全长cDNA文库。所构建cDNA文库的容量为5×105个独立克隆,插入片段长800~2500 bp,且90%的插入片段大于1 kb。随机挑取288个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为250条,根据EST测序结果计算文库重组率达95%。经序列拼接得到175个unigenes,通过序列比对发现其中97个unigenes与GenBank中的已知基因高度同源,且有88条全长序列,基因的完整性比率达90%。在随机EST测序中获得了具有5′端和3′端非编码区的延伸因子-1α基因(Gen-Bank登录号:FJ788508),该基因cDNA全长1743 bp,有一个1392 bp的开放阅读框,编码含463个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为50.4 kD,等电点8.96。EST测序分析表明,柞蚕蛹cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,该文库的构建将有助于柞蚕功能基因的克隆和研究。     

东方山羊豆肌醇-1-磷酸合酶基因的克隆与分析

探索新的基因和基因组合在植物耐盐性的研究中是至关重要的.本试验根据在不同植物中功能相同的同源基因保守序列设计引物,以250 mM NaCl胁迫后东方山羊豆(Galega. orientalis L.)幼嫩叶片中所提取的总RNA为模板,采用RT-PCR及RACE方法从东方山羊豆中克隆了一种新的肌醇-1-磷酸合成酶基因GoMIPS,cDNA全长1 858 bp,3'非编码区为256 bp, 5'非编码区为69 bp, 开放阅读框为1 533 bp,编码510个氨基酸.与已报道物种的MIPS基因氨基酸序列比较分析表明,GoMIPS与其他植物MIPS基因氨基酸相似性高达87%～95%,GoMIPS推导的氨基酸序列中含有植物MIPS基因所具有典型的NAD+结合区(GWGGNNG)和底物结合位点(SYNHLGNNDG),且9种植物NAD+结合区位置比较保守,均起始于第68个氨基酸.这一结果暗示功能结构域在进化过程中具有较高的稳定性.     

五指山小型猪DAZAP2 cDNA的克隆及其生物信息学分析

为了克隆五指山小型猪DAZ相关蛋白2(DAZAP2)cDNA全长并进行生物信息学分析,试验以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法克隆得到DAZAP2全长cDNA序列,并运用生物信息学软件对其核苷酸序列进行分析,预测其编码蛋白的理化性质及二级结构等。结果表明:五指山小型猪DAZAP2基因的核苷酸序列及其氨基酸序列与人、苏门达腊猩猩、斑马鱼、非洲爪蟾、牛、褐家鼠等动物具有很高的相似性。DAZAP2 cDNA全长943 bp,5’非翻译区长69 bp,3’非翻译区长367 bp,含有1个完整的开放阅读框,编码168个氨基酸。该蛋白的分子质量为17 311 ku,等电点为7.48。     

内蒙古绒山羊 CDK2 基因的克隆与序列分析

采用同源序列克隆技术结合RT-PCR和RACE技术,首次从内蒙古绒山羊睾丸组织中克隆出羊CDK2基因的全长cDNA序列（GenBank登录号为EF035041）。结果显示：羊CDK2基因的cDNA序列长为1355bp,5′端非翻译区为174bp,3′端非翻译区为266bp,开放阅读框为894bp,编码298个氨基酸。与牛CDK2基因cDNA序列同源性为98％,氨基酸序列完全一致;和其他哺乳动物CDK2基因的cDNA序列同源性也达92％以上;氨基酸序列同源性为93％以上。说明CDK2在结构和功能上有很高的保守性。     

扩展莫尼茨绦虫引发酶蛋白基因的克隆和cDNA序列分析

分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测。获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因——引发酶蛋白,全长1269 bp,编码422个氨基酸,属于AE_Prim_S家族。编码蛋白的理论分子质量为47.1598 ku,等电点为4.83。获得了扩展莫尼茨绦虫反应结合蛋白的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础。