绒山羊羔羊和成年羊前体脂肪细胞的原代培养及传代方法

本试验主要探索绒山羊羔羊和成年羊前体脂肪细胞的培养及传代方法,为研究绒山羊的脂肪代谢机理提供细胞模型。以3月龄阿尔巴斯白绒山羊羔羊肾周脂肪组织为试验材料,采用胶原酶法直接得到羔羊前体脂肪细胞,结合其细胞形态观察、生长曲线和油红O染色进行鉴定;以绒山羊成年羊肾周脂肪组织为试验材料,采用胶原酶法和"天花板"法得到成熟脂肪细胞后,通过去分化得到前体脂肪细胞,诱导分化后利用油红O染色鉴定其向成熟脂肪细胞分化的情况。绒山羊羔羊肾周脂肪组织中前体脂肪细胞的适宜分离条件为0.1%Ⅰ型胶原酶、37℃消化1 h,250×g离心10 min;传代时分离细胞采用0.25%胰蛋白酶消化60 s。细胞形态为梭形,生长曲线呈"S"型,油红O染色结果呈阳性。成年羊采用和羔羊相同的胶原酶法获得成熟脂肪细胞后,通过改进的"天花板"法获得前体脂肪细胞,经诱导分化后,油红O染色结果呈阳性。综上,采用Ⅰ型胶原酶消化法可直接分离培养3月龄绒山羊羔羊的前体脂肪细胞;采用胶原酶法和改进后的"天花板"法分离培养成年绒山羊的前体脂肪细胞是可行的。     

小鼠脾细胞的原代培养方法改良

为了确定较好的小鼠脾细胞分离培养方法,在不同培养时间(培养当天、第3天、第6天、第9天)条件下,分别采用改良胰酶消化法、组织块直接培养法和机械分离培养法培养小鼠脾细胞,试验进行细胞形态学、增殖生长曲线和细胞活力曲线对比研究。结果表明:不同培养方法对小鼠脾细胞的细胞学形态和细胞活力均有影响。改良胰酶消化法培养的细胞其细胞活力比组织块直接培养法和机械分离培养法培养的细胞活力好,而在细胞形态学的比较中,改良胰酶消化法培养的原代小鼠脾细胞与其他两组相比,培养情况最好,数量较多,形态完整,贴壁较好。证明改良胰酶消化培养法能够较好地培养小鼠脾细胞,进一步完善了小鼠脾细胞原代培养的方法。     

绵羊前体脂肪细胞的原代培养及分化

本试验旨在建立绵羊前体脂肪细胞的原代培养方法,探讨反刍动物脂肪沉积机理.以1日龄羔羊的肾周脂肪组织为试验材料,采用组织块法和酶消化法分离培养前体脂肪细胞,观察形态学变化,测定生长曲线,油红O染色检测细胞内脂肪含量,并用实时定量PCR法检测脂蛋白脂酶、过氧化物体增殖剂活化受体γ、脂肪酸合酶的表达量.结果表明:原代培养的细胞成分均一、增殖旺盛、分化率高,具有前体脂肪细胞的形态特征和基因表达特性,为绵羊前体脂肪细胞.本试验成功建立了绵羊前体脂肪细胞原代培养方法,并在体外重现了增殖和分化的过程.     

大鼠前体脂肪细胞分离培养方法的改进

前体脂肪细胞分离与培养是体外研究脂肪形成及其代谢机制的基础。本研究对目前采用的大鼠前体脂肪细胞分离培养方法进行了改进。前体脂肪细胞消化分离过程中,在Ⅰ型胶原酶消化后,取消尼龙筛过滤和离心操作,简化操作流程,减小污染几率,降低对前体脂肪细胞的损伤;加入研磨珠震摇,以充分分离前体脂肪细胞,提高细胞的获取率。改进后的前体脂肪细胞分离培养方法所培养的细胞生长曲线呈S型,符合细胞体外生长规律。本研究通过对操作过程的改良,建立了一种快速、方便、可靠的大鼠前体脂肪细胞分离培养体系。     

共轭亚油酸对艾维茵肉鸡前体脂肪细胞增殖与分化的影响

试验采用酶消化原代培养脂肪细胞的方法培养艾维茵肉鸡前体脂肪细胞.通过细胞形态学观察、细胞计数、油红O染色等方法,观察共轭亚油酸(CLA)对肉鸡前体脂肪细胞增殖与分化的影响.结果表明:CLA对艾维茵肉鸡前体脂肪细胞增殖有显著抑制作用,而对其分化没有显著影响.     

Perilipin在牛脂肪细胞分化过程中的表达模式

本实验旨在对牛Perilipin家族蛋白进行生物信息学分析,预测各成员蛋白之间的互作关系并探究Perilipin基因在牛脂肪细胞分化过程中的表达模式.采用I型胶原酶消化法分离培养牛前体脂肪细胞,并对脂肪细胞进行油红O染色;qPCR检测Perilipin在牛脂肪细胞分化(0、2、4、6、10 d)过程中的相对表达量;并利...     

乳牛前脂肪细胞原代培养过程中ADPN基因和HSL基因表达水平的检测

选取犊牛大网膜脂肪组织，进行牛前脂肪细胞的单层贴壁培养，在细胞接种后第4、6、8、10、12、14、16d分别提取细胞总RNA，采用实时荧光定量RT—PCR方法，检测了体外培养的犊牛前脂肪细胞不同时期ADPN基因mRNA和HSL基因mRNA的表达情况。结果表明，单层培养的脂肪细胞在第4、6、8、10、12、14、16d，ADPN基因mRNA的表达水平呈先下降后升高的趋势，而HSL基因mRNA的表达水平则呈下降趋势。     

绵羊前体脂肪细胞的分离培养及诱导分化

本试验旨在建立绵羊前体脂肪细胞体外培养方法,为从细胞生物学层面研究绵羊脂肪代谢提供基础。选取1只3月龄杜泊羔羊,颈部处死后取腹股沟脂肪组织,利用Ⅰ型胶原酶消化法分离获得前体脂肪细胞,在完全培养液中培养。当细胞汇合成单层后,用MDI诱导剂(1μmol/L地塞米松,10 mg/L胰岛素,0.5 mmol/L IBMX)诱导2 d,再用胰岛素分化剂(10 mg/L胰岛素)分化2 d之后,细胞分化成脂肪细胞,细胞内出现脂滴,随着时间的延长脂滴汇合,最终脂滴充斥整个细胞。通过细胞形态学动态观察、生长曲线绘制、油红O染色以及诱导分化测定等试验证明,这些细胞是功能活跃的前体脂肪细胞,并在体外重现了其增殖分化的全过程。结果提示,绵羊羔羊腹股沟脂肪组织中存在前体脂肪细胞,且可用以建立绵羊前体脂肪细胞的细胞系,这为从细胞生物学层面研究绵羊脂肪代谢提供了重要基础。     

全反式视黄酸在牛前脂肪细胞增殖及分化中的作用

奶牛前脂肪细胞的增殖与分化对于正常脂肪组织发育至关重要。本研究旨在细胞水平探讨全反式视黄酸(ATRA)对牛前脂肪细胞的增殖与分化。试验分为2组,分别是试验组(牛前脂肪细胞用20 nmol/L ATRA处理48 h)及对照组。用MTS及EdU及Ki67法检测ATRA对牛前脂肪细胞增殖的影响,免疫蛋白印记(Western blot)检测ATRA对牛前脂肪细胞中几种增殖相关蛋白表达的影响,包括细胞周期蛋白D1(CCND1)、2、3和CCNE1及细胞周期蛋白激酶(CDK2、4、6);使用流式细胞术检测细胞周期进程,并检测分化相关指标PPARγ和C/EBPα蛋白表达情况。结果显示,与对照组相比,20 nmol/L ATRA可抑制牛前脂肪细胞增殖,同时降低S期细胞比例并降低细胞周期蛋白(CCND1、CCND2、CCND3和CCNE1)和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK2、CDK4和CDK6)的蛋白丰度。此外,与对照组相比,ATRA的添加还通过下调PPARγ和C/EBPα的蛋白质表达来抑制牛前脂肪细胞的分化。结果表明,20 nmol/L ATRA处理48 h会抑制牛前脂肪细胞的增殖与分化,对正常脂肪组...     

新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞原代培养与诱导分化的研究

为建立新西兰兔前体脂肪细胞的体外培养模型,比较新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞分化过程中相关基因的差异表达,实验采集 1 日龄新西兰兔背最长肌和皮下脂肪组织,采用胶原酶消化方法,分别从 2 种组织中分离前体脂肪细胞,进行细胞原代培养,绘制细胞生长曲线,并对肌内和皮下前体脂肪细胞诱导分化,利用 RT-PCR 检测相关基因的表达变化。结果表明:细胞在分离后 2 h 已经贴壁,24 h 时呈现出短梭形的细胞形态,第 2 天细胞变成长梭形,第 3 天进入对数生长期。肌内和皮下前体脂肪细胞在诱导分化后均被油红O 染色,皮下前体脂肪细胞的脂质积累在诱导分化的第 2 天显著高于肌内前体脂肪细胞(P<0.05);荧光定量结果表明,肌内和皮下前体脂肪细胞 CCAAT 增强子结合蛋白(C/EBPα)基因的表达趋势在诱导分化过程中相同,肌内前体脂肪细胞过氧化物酶体增殖激活受体(PPARγ)第 4 天的表达量显著高于第 6 天,而皮下前体脂肪细胞 PPARγ表达量差异不显著;肌内前体脂肪细胞脂蛋白脂肪酶(LPL)表达量在第 0天和第 2天差异不显著,而皮下前体脂肪细胞第 2 天显著高于第 0 天(P<0.05);肌内前体脂肪细胞脂肪酸合酶(FAS)基因第 0、2、4 天的表达量差异不显著,而皮下前体脂肪细胞第 2、4 天显著高于第 0 天(P<0.05)。本研究成功构建了新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞的体外培养和诱导分化模型,并发现皮下前体脂肪细胞分化早于肌内前体脂肪细胞,为进一步研究新西兰兔前体脂肪细胞的分化机制和脂肪沉积奠定基础。     

柠檬苦素对牛前体脂肪细胞分化过程中核纤层蛋白基因表达的影响

核纤层位于核膜内侧,主要由核纤层蛋白构成,对细胞核起重要的机械支持作用。编码核纤层蛋白的基因突变能导致人类肌肉、脂肪等组织病变,统称为核纤层病。为了研究柠檬苦素对牛前体脂肪细胞分化过程中核纤层蛋白基因表达的影响,试验利用qRT-PCR技术分析了编码核纤层蛋白的LMNA、LMNB1和LMNB2基因在牛前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达变化,同时在细胞培养基中添加柠檬苦素,以分析柠檬苦素对细胞分化和核纤层蛋白编码基因表达的影响。结果表明:在培养基中添加柠檬苦素能够有效抑制牛前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化,试验组细胞中脂质沉积量极显著低于对照组(P0.01)。LMNA基因在牛前体脂肪细胞中具有较高的表达水平,添加柠檬苦素的试验组LMNA基因表达水平有降低的趋势。试验组LMNB1和LMNB2基因表达量在诱导分化的第0.5天极显著低于对照组(P0.01),在诱导分化的10~12 d试验组LMNB1基因表达量显著高于对照组(P0.05)。LMNA、LMNB1和LMNB2基因在牛前体脂肪细胞诱导分化过程中具有相似的表达变化趋势,均在诱导分化开始的0.5~1 d表达量升高。说明柠檬苦素在牛前体脂肪细胞早期分化时具有抑制核纤层蛋白基因表达的作用,而在分化后期则能够促进核纤层蛋白基因表达。     

共轭亚油酸对大鼠前体脂肪细胞增殖与分化的影响

实验采用酶消化原代培养脂肪细胞的方法培养大鼠前体脂肪细胞。通过细胞形态学观察、细胞生长曲线的绘制、计算细胞倍增时间、油红O染色、ELISA等一系列方法,观察共轭亚油酸(CLA)对大鼠前体脂肪细胞增殖与分化,以及瘦素、脂联素分泌功能的影响。结果表明:CLA对大鼠前体脂肪细胞增殖与分化有显著抑制作用,而对其瘦素、脂联素的分泌没有显著影响。     

从江香猪PDK4基因干扰载体的构建与检测

为了进一步揭示PDK4基因在猪肌内前体脂肪细胞中的调控作用,本试验采集5日龄从江香猪背最长肌,采用Ⅱ型胶原酶进行消化,分离肌内前体脂肪细胞,进行原代和传代培养及形态学观察;根据克隆得到的PDK4基因序列,利用在线软件设计合成3对特异性单链siRNA序列和1对阴性对照序列,经退火后形成双链,连接pLVX-shRNA2-Puro载体,重组质粒采用双酶切及测序进行验证。针对干扰载体转染培养的从江香猪肌内前体脂肪细胞,采用实时荧光定量PCR方法筛选出最有效的干扰序列。结果显示,原代从江香猪肌内前体脂肪细胞约4 h开始贴壁,24 h后细胞形态均一,贴壁牢固,第5天汇合呈单层细胞,基本铺满培养板;重组质粒经双酶切及测序鉴定结果显示,设计合成的4对siRNA干扰序列与载体质粒均连接正确,表明成功构建了PDK4基因的干扰载体,并可成功转染猪肌内前体脂肪细胞;实时荧光定量PCR方法检测发现,干扰载体可有效减少从江香猪肌内脂肪前体脂肪细胞中PDK4基因mRNA的表达,最佳干扰效率可达81.90%。本试验成功培养了从江香猪肌内前体脂肪细胞,构建并得到了PDK4基因的最佳干扰载体,为进一步研究PDK4基因对脂肪代谢的调控机制奠定基础。     

共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响

本试验旨在研究共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响。试验分离培养了猪骨骼肌卫星细胞和肌内前体脂肪细胞,2种细胞分离培养鉴定后,接种于Transwell细胞小室共培养板进行共培养,待细胞密度达到90%以上分别进行诱导分化。骨骼肌卫星细胞诱导分化8 d后,检测肌内前体脂肪细胞分化水平、分化标志基因的表达以及脂质代谢关键酶的表达。结果显示:与肌内前体脂肪细胞单独培养相比,共培养体系内肌内前体脂肪细胞的脂滴数量和脂滴面积极显著减少(P0.01),肌内前体脂肪细胞增殖分化转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ和CCAAT增强子结合蛋白的基因和蛋白表达水平极显著下降(P0.01),肌内前体脂肪细胞的乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶的基因和蛋白表达水平极显著下降(P0.01)。由此可见,共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积具有抑制作用。     

莱芜猪前体脂肪细胞的原代培养及诱导分化研究

为了建立莱芜猪前体脂肪细胞的体外培养体系,探索猪脂肪组织增生的生物学特征。本研究采集1日龄莱芜猪仔猪颈、背部皮下脂肪组织,采用胶原酶与胰蛋白酶相结合的方法,分离原代前体脂肪细胞,进行前体脂肪细胞的原代和传代培养,以及前体脂肪细胞诱导分化的研究,并采用Real-time PCR方法检测前体脂肪细胞分化过程中关键基因PPARγ的表达。结果表明,分离的猪原代前体脂肪细胞约8h后开始贴壁,贴壁的细胞呈短梭形或不规则的三角形,第3天多数细胞进入指数生长期,呈成纤维细胞样形态,细胞生长曲线近似S形;诱导培养结果显示,少量细胞在第2天开始出现脂滴,大多数细胞在第3天出现脂滴,第7～8天小脂滴逐渐融合成大脂滴,在第12天左右融合成大脂滴,油红O染色呈橘红色。在前体脂肪细胞分化过程中PPARγ基因mRNA的表达量逐渐增加,在诱导后的48h表达量最高,随后其表达丰度逐渐下降。本试验成功建立了莱芜猪前体脂肪细胞培养体系和体外诱导分化模型,为进一步研究莱芜猪前体脂肪细胞增殖与分化机制和猪体脂肪的沉积奠定基础。     

从江香猪PDK4基因干扰载体的构建与检测

为了进一步揭示PDK4基因在猪肌内前体脂肪细胞中的调控作用,本试验采集5日龄从江香猪背最长肌,采用Ⅱ型胶原酶进行消化,分离肌内前体脂肪细胞,进行原代和传代培养及形态学观察;根据克隆得到的PDK4基因序列,利用在线软件设计合成3对特异性单链siRNA序列和1对阴性对照序列,经退火后形成双链,连接pLVX-shRNA2-Puro载体,重组质粒采用双酶切及测序进行验证。针对干扰载体转染培养的从江香猪肌内前体脂肪细胞,采用实时荧光定量PCR方法筛选出最有效的干扰序列。结果显示,原代从江香猪肌内前体脂肪细胞约4h开始贴壁,24h后细胞形态均一,贴壁牢固,第5天汇合呈单层细胞,基本铺满培养板;重组质粒经双酶切及测序鉴定结果显示,设计合成的4对siRNA干扰序列与载体质粒均连接正确,表明成功构建了PDK4基因的干扰载体,并可成功转染猪肌内前体脂肪细胞;实时荧光定量PCR方法检测发现,干扰载体可有效减少从江香猪肌内脂肪前体脂肪细胞中PDK4基因mRNA的表达,最佳干扰效率可达81.90%。本试验成功培养了从江香猪肌内前体脂肪细胞,构建并得到了PDK4基因的最佳干扰载体,为进一步研究PDK4基因对脂肪代谢的调控机制奠定基础。     

猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究

为了研究猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞的分离培养体系,根据取样组织的不同,筛选出最佳的培养方法,试验以猪胎儿和耳皮肤为试验材料,用4种不同的培养分离方法,即胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法,分离培养猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞,对比培养效果,筛选出最佳的培养方法。结果表明:胰酶室温消化法分离的猪胎儿成纤维细胞存活率显著高于胰酶热消化法和胰酶冷热结合消化法(P<0.05),细胞贴壁效果好,且操作简单;猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中,胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少,组织块培养法所需的组织量少,且较胰酶冷热结合消化法操作简单。试验中培养的细胞呈典型的成纤维细胞形态,生长曲线呈"S"型,经冻存复苏后生长状态良好,说明胰酶室温消化法是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法,胰酶热消化法和胰酶室温消化法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。     

奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养及鉴定

试验采用酶消化及机械法相结合的方法培养奶牛子宫内膜上皮原代细胞及传代细胞。酶消化法采用0.1%链蛋白酶于4 ℃消化16~20 h,机械法采用手术刀刮取子宫角内膜。获得原代分离的细胞后,采用胰蛋白酶消化法进行细胞的传代培养。试验应用角蛋白抗体对细胞进行免疫细胞化学鉴定,并对第3代奶牛子宫内膜上皮细胞用MTT法绘制增殖曲线。结果显示,细胞在相差显微镜下呈明显的上皮样细胞形态,细胞传代到第8代时,仍能保持与原代细胞相似的细胞形态特征及生长状态。同时细胞角蛋白染色阳性细胞占80％以上。试验结果表明,应用酶消化和机械法可成功分离并培养数量、活力和纯度均较高的子宫内膜细胞,可操作性强,可在具备基本细胞培养条件的实验室应用推广。     

北京油鸡羊膜上皮细胞的分离、培养及分化潜能的研究

旨在研究禽类胚胎羊膜上皮细胞的分离、培养、鉴定及向不同胚层细胞诱导分化等的生物学特性.本研究使用酶消化法从北京油鸡胎膜中分离羊膜上皮细胞,通过免疫荧光和RT-PCR方法鉴定羊膜上皮细胞标志物(Nanog、Oct-4、Sox-2、CK19和Vimentin),并诱导其向成骨细胞、脂肪细胞和胰岛样细胞诱导分化,检测其多向分化潜能.结果表明,酶消化法获得的鸡羊膜上皮细胞不仅表达干细胞特有的标志,而且成功诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和胰岛样细胞.综上所述,北京油鸡羊膜上皮细胞在体外具有较强的自我更新能力及可塑性,可作为种子细胞进行濒危物种的保存,并为日后利用羊膜上皮细胞进行临床治疗提供一定的理论依据,同时也可为油鸡基因的改良提供模型.     

梅山猪前体脂肪细胞的分离培养及分化相关基因的表达规律研究

本试验旨在建立梅山猪前体脂肪细胞的体外培养体系,从细胞和分子水平探索梅山猪脂肪组织增生的生物学特征。采集3日龄梅山猪仔猪颈、背部皮下脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶分离前体脂肪细胞,进行前体脂肪细胞的原代和传代培养,并对其进行形态学观察、生长曲线测定、油红O染色鉴定及脂肪含量的测定,且采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测脂肪细胞分化关键基因PPARγ、CEBPα、LPL、DLK1、FABP4及ADIPOQ mRNA在梅山猪前体脂肪细胞分化过程中的表达。结果表明:分离的梅山猪原代前体脂肪细胞约6 h开始贴壁,贴壁的细胞呈小梭形或不规则的三角形,经传代后成分均一,贴壁良好,呈成纤维细胞样形态,第1~9天细胞进入指数生长期,细胞生长曲线近似S形;诱导培养第11天细胞充脂率高,油红O染色呈红色,细胞内脂肪含量显著高于未诱导组,具有前体脂肪细胞的典型特征;PPARγ在猪前体脂肪细胞分化早期就有表达,分化第3天高度表达,CEBPα和LPL随着分化过程表达量逐渐增加,而DLK1表达量逐渐下降,FABP4和ADIPOQ在第6天高度表达。综上,本研究成功建立了梅山猪前脂肪细胞的培养方法和诱导分化方法,为进一步研究梅山猪体脂沉积和改善肉品质奠定基础。