重组伪狂犬病病毒SA215(C)株的构建及其对小鼠的免疫原性

为了研制猪2型圆环病毒（PCV2）基因工程疫苗,以伪狂犬病病毒（PRV）基因缺失疫苗株SA215为病毒载体,通过同源重组,构建了共表达PCV2ORF2基因和绿色荧光蛋白基因重组伪狂犬病病毒SA215（C）株。经PCR、Southern blotting、Western blotting等证实SA215（C）构建正确,并能表达具有活性的ORF2基因蛋白和荧光蛋白。SA215（C）在IBRS-2、ST细胞中的增殖滴度与亲本株SA215相比无显著差异,表明外源基因的插入不影响病毒增殖。用SA215（C）免疫BALB/c小鼠10周后检测免疫小鼠PCV2抗体和PRV中和抗体及细胞免疫反应。结果显示,SA215（C）诱导小鼠产生了PCV2和PRV抗体并出现PCV2的细胞免疫反应。另外,以105TCID50的SA215（C）株接种BALB/c小鼠,接种后28d再接种1次,2次接种后2周,用107TCID50PRVFa和PCV2强毒联合进行攻击,结果免疫小鼠抵抗住强毒的攻击,获得了保护;表明该毒株具有很强的免疫原性,为研制安全、有效的PCV2-PRV二价基因工程疫苗奠定了基础。     

表达日本乙型脑炎病毒E蛋白重组伪狂犬病病毒SA215（E）的构建

将日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)CQRC-1株的E基因通过RT-PCR产生,克隆到pMD18-T simple载体中,再亚克隆到转移载体pPI-2,EGFP中,命名为PPE.PPE质粒和伪狂犬病毒(PRV)SA215株DNA通过磷酸钙共转染方法转染到Vero细胞上.通过有限稀释法、噬斑纯化、PCR检测、Southern杂交、West杂交,获得了表达JEV E蛋白的重组伪狂犬病病毒,命名为SA215(E).结果表明,SA215(E)在生长曲线、噬斑形态及大小、在Vero细胞上的病变与PRV SA215一致.安全性试验表明,SA215(E)对小鼠和兔具有较高的安全性,SA215(E)具有很强的免疫原性.接种兔能预防致死剂量的PRV Fa肌肉内攻毒;接种小鼠能预防致死剂量的JEV cQRC-1株腹膜内攻毒.表明该重组病毒是养猪业控制伪狂犬病和乙脑最适合的候选疫苗株之一.     

伪狂犬病基因缺失疫苗株(SA215)生物学特性研究

测定了伪狂犬病gE^-／gI^-／TK^-／LacZ^ 基因缺失疫苗株(SA215)的致细胞病变效应、安全性、免疫原性和接种动物抗体消长规律等生物学特性。试验结果显示，该疫苗株能在Vero细胞上适应生长，并形成典型的蚀斑。其对1日龄仔猪、妊娠母猪、牛、羊以及家兔安全，无不良接种反应，接种动物不向外散毒。SA215疫苗接种猪能抵御高剂量(10’PFU)Fa株强毒感染，攻毒后试验猪的发热期、增重受阻天数、散毒滴度略低于Bartha株疫苗接种猪，低于对照组猪。SA215接种猪能维持长时间的高水平中和抗体滴度。试验结果表明，SA215株是一株安全、免疫原性好的疫苗株。     

猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒在伪狂犬病病毒表达系统中的表达

利用PCR技术从猪细小病毒（PPV）SC1株基因组中扩增VP2全基因,并将其插入真核表达载体pPI-2.EG-FP中,构建转移载体pPI-2.EGFP.VP2。采用脂质体介导法将猪伪狂犬病病毒（PRV）SA215株DNA与pPI-2.EGFP.VP2DNA共转染Vero细胞,待出现细胞病变后收集病毒液。经空斑纯化,并同时采用检测PPV VP2基因的PCR方法筛选获得重组病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗体建立的免疫荧光技术可检测到Vero细胞发出的特异性荧光,表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因组中,并获得表达。进一步电镜观察表明,感染PRV SA215/VP2的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV 2种类病毒样颗粒。结果表明,成功实现了利用PRV载体表达PPV VP2蛋白病毒样颗粒,为进一步研制PPV病毒样颗粒疫苗奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒双基因缺失突变株(HB-98株)安全性、稳定性和免疫原性测定

对以伪狂犬病病毒鄂A株为亲本毒株构建的TK和gG双基因缺失突变株（PrV HB-98株）的增殖能力、安全性、毒力稳定性和免疫原性进行了测定。结果表明，PrV HB-98株在BHK-21细胞上的增殖滴度为10^7.0 TCID50／0．1mL以上，与亲本毒株相当，但高于Bartha株；与PrV鄂A株相比，病毒量为10^7.0TCID50的PrV HB-98株不引起BALB／c小鼠的死亡，毒力也低于Bartha株；将PrV HB-98株在PK-15细胞连续培养25代和在猪体内上连续继代5次，各代次突变株TK基因和LacZ基因能被稳定扩增，未出现毒力回复现象．表明该毒株具有良好的遗传稳定性；以10^5.0、10^6.0、10^7.0TCID50等3个不同剂量的PrV HB-98株接种于妊娠50～60d母猪和1日龄仔猪，母猪均能正常产仔．仔猪也未出现任何临床症状，证明该毒株有较好的安全性。另外，以10^5.0TCID50的PrV HB-98株接种于妊娠50～60d母猪和1日龄仔猪，分别于接种后28d和20d，用10^7.0TCID50 PrV鄂A强毒进行攻击．结果免疫猪都能抵抗强毒的攻击．获得保护，表明该毒株具有很强的免疫原性。综合上述结果表明，PrV HB-98株可以作为候选毒株．用于伪狂犬病基因工程疫苗的研制。     

表达传染性支气管炎S1基因和IFN-γ基因重组鸡痘病毒安全性与最适免疫剂量分析

对共表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因和II型干扰素基因的重组鸡痘病毒（rFPV-IFNγS1）冻干疫苗进行安全性和最适免疫剂量的研究。取冻干疫苗,加生理盐水恢复至冻干前体积,分别取0.1 mL经翅内侧无血管处皮下接种1周龄SPF鸡,接种剂量为1.0×10^5PFU,接种后3 d出现局部反应,5 d局部肿胀达到最大,接种鸡无其它全身反应,精神、食欲以及发育等均不受影响,说明重组病毒对实验鸡是安全的。将重组疫苗用生理盐水作倍比稀释后翅内侧无血管处皮下接种4周龄SPF鸡,接种剂量为1.0×10^1-1.0×10^4PFU,免疫后3周攻击传染性支气管炎病毒LX4株。结果表明,在接种剂量为1.0×10^2-1.0×10^4PFU的剂量范围内均可以使全部实验鸡产生局部反应,并对IBV的攻击形成保护,降低免疫鸡的发病率和死亡率,发病保护率达到73%以上;1.0×10^1PFU接种实验鸡后,仅有5/11的鸡出现局部反应,对IBV攻击的发病保护率为64%,与对照组差异不显著（P〉0.05）。以上结果说明,疫苗接种后的局部反应与重组疫苗的免疫效力之间具有相关性,根据疫苗生产使用实际情况确定传染性支气管炎重组鸡痘病毒疫苗的最适免疫剂量为10^3PFU。     

表达乙脑病毒PrM基因重组伪狂犬病病毒的构建

本研究以乙型脑炎病毒SA14—14—2疫苗株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA（558 bp），用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物，回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中，获得了转移载体pPgG-PrM，并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明：与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较，PrM基因的同源性为100％。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^＋突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／PrM^＋，为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

传染性喉气管炎新城疫鸡痘重组病毒免疫效力的研究

在表达鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白gB基因和新城疫病毒(NDV)F基因的重组鸡痘病毒(rF-PV-gB-F)安全性检验合格后,以5.0×101~5.0×104PFU不同含量按0.1mL/鸡的剂量免疫100只30日龄SPF鸡,30d后分组分别用ILTVWG株和NDVF48E9株强毒进行攻击。免疫鸡抗鸡痘病毒抗体都转为阳性,痘反应和接种剂量有关,重组疫苗的最小反应剂量为50PFU。重组疫苗可以诱发对新城疫和传染性喉气管炎的保护,0.1mL/鸡的接种量在500~5000PFU浓度范围内的免疫效果最好,对于ILTV攻击的发病保护率在70%以上,对NDV强毒攻击的抗死亡保护率可以达到80%,这为进一步考察疫苗的免疫效力试验以及进行田间试验奠定了基础。     

表达多个外源基因的重组伪狂犬病病毒的构建及其细胞培养特性研究

将SV40启动子控制下的LacZ报告基因表达盒与分别在CMV启动子控制下的含有猪瘟病毒（CS-FV）E2基因及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因的表达盒插入到伪狂犬病病毒（PRV）Bartha-K61株TK基因中，通过蓝斑筛选获得了一株插入CSFVE2、PRRSVGP5与LacZ基因的重组伪狂犬病病毒，命名为rPRV-E2-GP5。经Western blot、间接免疫荧光试验证实E2、GP5基因在重组病毒感染细胞中获得了表达。重组病毒感染Vero、PK-15、IBRS2和CEF细胞后的增殖滴度和致细胞病变特征与亲本病毒比较，无显著差异。本试验结果表明在PRV基因组中可以插入多个外源基因，为进一步研究多价基因工程载体疫苗奠定了基础。     

乙脑病毒prM/E基因重组伪狂犬病病毒的构建

以乙型脑炎病毒SA14-14-2株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增prM／E基因的全长cDNA(约2kb)，将其克隆至pMDl8一T栽体，获得了克隆质粒pTprM／E，并对其进行了测序。序列分析结果表明，与已报道的SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸比较，prM基因的序列同源性为100％，E发生了4个点突变，其中1个为回复突变，并导致了3个氨基酸的改变。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^ 突变株为栽体，构建了1株乙脑病毒prM／E基因的重组伪狂犬病病毒TK／gG^-／ΓrM／E^ 。乙脑病毒prM／E基因的克隆及重组伪狂犬病病毒的成功构建，为开展乙脑病毒分子生物学及猪伪狂犬病-乙脑二价基因工程疫苗的研究打下了坚实基础。     

绵羊痘病毒、山羊痘病毒及羊口疮病毒多重PCR检测方法的建立和应用

为了建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和羊口疮病毒(ORFV)的多重PCR检测方法,针对GenBank中3种病毒的基因组序列,合成了3对引物,通过优化多重PCR反应条件,建立了鉴别检测3种病毒的多重PCR方法。特异性试验表明,应用该方法可分别扩增出3种病毒对应的目的片段,对大肠埃希菌、沙门菌、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、Vero细胞、正常羊组织的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验表明,该方法最低检测量分别为30.46pg/μL的绵羊痘病毒、28.9pg/μL的山羊痘病毒和26.94pg/μL的羊口疮病毒基因组DNA;应用本方法对85份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单项PCR检测方法结果一致,说明该方法可以用于临床上SPPV、GTPV和ORFV的鉴别诊断。     

禽流感、新城疫、传染性支气管炎三联没乳剂灭活疫苗的研制

以禽流感病毒（AIV）H5N4株，新城疫病毒（NDV）LaSota株与传染性支气管炎病毒（IBV）M41株为抗原研制了AI－ND－IB三联油乳剂灭活疫苗，并对疫苗的物理性状，安全性，免疫效力，保存期及抗体消长规律进行了检测，结果表明，疫苗在免疫后3周后6个月内，对AIV－H5N4，NDV－北京株的攻击均获全部保护，在免疫后52周内，免疫鸡箅清中AIV－N5N4，MDV，IBV的HI抗体也保持较高的水平，疫苗在4℃保存15个月，其免疫力没有下降。     

施马伦贝格病毒

施马伦贝格病毒病(Schmallenberg virus,SBV)是一种新发现的动物传染病,因于2011年底在德国施马伦贝格镇首次发现而临时得名,随后蔓延于西欧(包括比利时、法国、德国、荷兰、意大利、卢森堡、西班牙、英国和丹麦),并分别在奥地利、波兰、瑞典和芬兰等国的牛、山羊、绵羊中检测到抗体。遗传分析显示该病毒与布尼亚病毒科(Bunyaviridae)正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)西姆布血清群病毒(Simbu serogroup viruses)的亲缘关系最密切,西姆布血清群病毒是已知的反刍动物病原,可通过节肢动物媒介(蚊、蠓)传播。施马伦贝格病毒病有2种不同的临床症状:成年牛出现短暂轻微/温和的病症(产奶量减少、发热、腹泻)和新生哺乳动物(牛、羊)死产和先天缺陷。因为同群类似的病毒不是人畜共患病病原,也无该病毒致人发病的证据,但现阶段尚不能完全排除。尽管目前没有特效的药物和疫苗,但因已有类似病毒(赤羽病)的疫苗,疫苗接种应是控制该病的可能选项。因施马伦贝格病毒是一种新发现的病毒,许多方面尚不清楚,还有待于进一步研究。     

病毒的锌指蛋白在病毒感染中的作用

锌指（zinc fingers,ZF）结构是一种广泛存在于动植物、微生物包括许多病毒中的蛋白结构,肽链中氨基酸残基的特征基团与Zn²⁺结合从而稳定形成一种很短的、可自我折叠成“手指”形状的多肽空间构型。具有ZF结构的蛋白被称为锌指蛋白（zinc-finger protein,ZNF）,研究发现,部分病毒可以编码具有ZF结构的蛋白且该蛋白会影响到病毒的复制、成熟病毒粒子的包装释放、调节激活病毒转录和裂解性感染及协助病毒的先天免疫逃逸等。本文就目前病毒的ZNF在病毒感染过程中发挥作用的研究进展作一综述,为ZNF的深入研究及以ZNF为靶位点的抗病毒药物研制提供参考。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组鸡痘病毒的构建和鉴定

将 RVG基因插入到鸡痘病毒表达载体 p UTA- 2 Sm a 位点获得重组转移载体 p U TA- RVG,利用脂质体转染已感染中国鸡痘病毒疫苗株 2 82 E4株 2～ 3h的鸡胚成纤维 (CEF)细胞 ,收获病毒后 ,用 Brd U法进行加压筛选重组病毒 ,PCR检测到重组病毒 RVG基因 ,Western blot检测出 RVG,从而证实已成功构建了表达 RVG的重组鸡痘病毒     

应用多重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡新需疫病毒,鸡传染性支气管炎病毒,鸡

本文建立了一种同时检测ＤＮＶ、ＩＢＶ、和ＭＧ４种病原体的多重ＰＣＲ技术。根据ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ和ＭＧ的基因文库,设计了４对分别与ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ和ＭＧ某段基因序列互补的引物,用这４对引物对同一样品中的ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ、ＭＧＲＶＡ和ＤＮＡ模板进行多重ＰＣＲ扩增,结果均同时得到了４条特异性大小与实验设计相符的３１０ｂｐ（ＮＤＶ）、１７２０ｂｐ（ＩＢＶ）、６４７ｂｐ（ＩＬＴＶ）和７３２ｂｐ（ＭＧ）多重ＰＣＲ扩增带,而对其他６种禽病病原的ＰＣＲ扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重ＰＣＲ技术难检出１０ｐｇ的ＩＢＶ、１ｂｇ的ＮＤＶ ＲＮＡ模板和ＩＬＴＶ、１ｐｇ的ＭＧ ＤＮＡ模板。