农杆菌介导法将β—1,3—葡聚糖酶基因导入油菜的研究初报

将克阼的烟草β－１,３－葡聚糖酶基因插入双子叶植物高效表达载体ｐＢｉｎ４３８中,构建了植物表达载体ｐＢＬＧ。利用农杆菌介导法,将此抗真菌基因导入甘蓝型双低油菜品种Ｈ１６５中,得到了抗卡那霉素的再生植株,并探讨了影响油菜分化的几个要素。结果表明：乙酰丁香酮及硝酸银等物质对油菜分化及绿苗的形成具有重要作用; 采对卡那霉素十分敏感,提高卡那霉素浓度可可能将一部分转化体淘汰,对８株再生株株进行了ＰＣＲ检测     

转γ-生育酚甲基转移酶基因大豆的获得

以大豆子叶节为外植体,利用γ-生育酚甲基转移酶基因(γ-TMT)的种子特异性表达载体p7S-TMTL,通过农杆菌介导法转化大豆,获得26株抗卡那霉素再生植株.PCR检测结果表明其中4株为阳性,初步证明γ-TMT已整合到这4株大豆的基因组中.     

转γ-育酚甲基转移酶基因大豆的获得

以大豆子叶节为外植体，利用γ-生育酚甲基转移酶基因(γ-TMT)的种子特异性表达载体p7S-TMTL，通过农杆菌介导法转化大豆，获得26株抗卡那霉素再生植株。PCR检测结果表明其中4株为阳性，初步证明γ-TMT已整合到这4株大豆的基因组中。     

β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因双价RNAi表达载体抑制大豆抗原蛋白的表达

为幼龄动物提供优质的大豆饲料,同时有效抑制α'亚基和β亚基基因表达量,根据dsRNAi原理,以α'亚基基因RNAi重组植物表达载体p CAMBIA3301-PFNZ-BADH为基础,构建以BADH安全标记为筛选标记的α'亚基和β亚基基因双价RNAi植物表达载体。用根癌农杆菌介导法转化大豆子叶节,并对再生植株进行分子生物学检测。结果表明:成功构建β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因双价RNAi表达载体,并获得大豆转基因植株。T1转基因大豆植株经PCR检测得到11株阳性转化株,经Southern杂交检测证明构建的双价植物表达载体已经以1~2个拷贝整合到大豆基因组中,实时荧光定量PCR检测表明β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因的表达被明显抑制。     

萝卜抗菌肽基因Rs对菌核病的抗性

为分析萝卜抗菌肽Rs是否对核盘菌具有抗性,人工合成了Rs基因,并利用水稻α-淀粉酶信号肽αAmy3SP引导目的基因在胞间隙和质体表达的作用特点,通过基因重组技术构建植物表达载体p35S-SP-Rs,同时构建了p35S-SP-GFP载体,基因枪轰击洋葱表皮。实验发现荧光信号主要存在于植物细胞的细胞壁和细胞膜之间,说明在35S和信号肽αAmy3SP的引导下GFP在细胞间隙中有效表达。采用浸花法将植物表达载体p35SSP-Rs转入拟南芥中,通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,获得35株Rs转基因阳性植株。qRT-PCR显示Rs基因在转基因拟南芥中的表达水平得到显著提高,而植株的生长发育未受影响。抗病鉴定结果显示,转基因植株对菌核病的抗性显著增强。结果说明通过在细胞间隙中高量表达抗菌肽Rs,在避免对细胞产生毒性的同时,显著抑制了核盘菌菌丝的扩展,从而达到抗病目的。     

大豆Gy1基因种子特异性表达载体的构建及在玉米中的转化

实验构建了2个大豆贮藏蛋白Gy1基因种子特异性表达载体,并将其分别转入玉米愈伤组织中。载体1以潮霉素为筛选标记,将Gy1基因片段插入到含有种子特异启动子的植物表达载体pCAMBIA1301-7αP上,得到种子特异性表达载体pCAMBIA1301-7αP-Gy1;载体2以BADH为筛选标记,将Gy1基因插入到带有耐盐基因BADH的植物表达载体pCAMBIA1301-BADH上,得到安全性无抗生素选择标记的种子特异性表达载体pCAMBI-A1301-sbeⅡb-Gy1。通过农杆菌介导法将其分别导入玉米自交系H99的愈伤组织中,共获得132株再生植株;经过PCR检测,初步证明获得了34株转基因阳性植株。     

烟草Ⅰ类几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶cDNA植物双价表达载体的构建及转化番茄的研究

将烟草中经修饰的Ⅰ类几了质酶和β－1,3-葡聚糖酶cDNA分别加上CaMV35S启动子和NOS终止子,依次插入到同一植物表达载体pBin19上,获得植物双价表达载体pCG－Ⅱ。然后载体pCG－Ⅱ以土壤农杆菌LBA4404介导转化番茄,再生植株的点杂交及PCR扩增证明两种cDNA已随T－DNA同时导入番茄植株中。     

基因枪法将Glu基因导入甘蔗愈伤组织

将含有Glu基因(β-1，3-葡聚糖酶基因)的植物表达载体pBIuG通过基因枪法将Glu基因导入甘蔗叶片愈伤组织，在Km抗性培养基上诱导再生植株，获得的再生植株经PCR检测，证明外源Glu基因已整合到甘蔗基因组中。     

受体细胞倍性对PVY CP基因向马铃薯遗传转化影响的研究

利用整合PVYCP基因的改建质粒PEY3,以农杆菌为载体向四倍体栽培“甘农薯 1号” (2n =4x =4 8)及双单倍体“84 4 7” (2n =2x =2 4 )叶盘、叶柄、茎段导入PVYCP基因并获得再生植株。愈伤组织卡那霉素 (KM )抗性筛选试验表明 ,低倍体受体细胞利于外源基因的整合与表达 ,双单倍体转化率 (2 5 4 % )高于四倍体 (15 8% )。冠瘿碱分析证明再生植株整合了PVYCP基因。染色体倍性鉴定证明转基因再生植株与亲本倍性一致。     

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因高效表达载体构建及其导入小麦的研究

为获得具有C4光合特征的高光效转基因小麦材料,利用从玉米中克隆的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(pepc,GenBank接受号为FJ415327)构建高效双元表达载体,通过基因枪介导法将其导入小麦品种(系)中,利用Real-time PCR方法分析外源基因在转基因植株中的拷贝数.PCR和双酶切鉴定表明,玉米PEPC cDNA序列已插入双元表达载体pCAMBIA3301中,命名为p3301-pepc;对获得的抗性再生植株进行PCR扩增,其中有342株扩增出目的条带;在选取的15株转基因植株中7株拷贝数为1,3株拷贝数为2,2株拷贝数为3,拷贝数为5、8和17的分别为1株.初步证明玉米pepc基因已整合到小麦基因组中,且外源基因在转基因植株中既有单拷贝插入,也有多拷贝插入,这为进一步研究该基因在小麦基因组中的功能表达提供了试验材料.     

基因枪介导甘蔗遗传转化研究初报

将从灰树花（Grifola frondosa）中分离克隆到的海藻糖合酶cDNA以正向插入植物表达载体pBI121/BamHI Sst1位点，获得一植物表达载体pBT；又用Ubi-L启动子插入植物表达载体pBI121/HindⅢ＋Xbal位点，获得重组质粒pUB,再把海藻糖合酶cDNA正向插入pUB/BanHI SstI位点，获得另一植物表达载体pUBT。然后通过基因枪法分别用植物表达载体pBT和pUBT转化甘蔗。再生植株的点杂交和PCR－Southern杂交表明海藻糖合酶基因已整合进甘蔗的基因组中。     

抗虫基因Cry8-like在大豆中的遗传转化及抗虫性初步鉴定

利用无缝克隆技术把抗虫基因Cry8-like重组到pCAMBIA3301载体上,成功构建了含有抗草铵膦筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-RSP-Cry8-like-nos。将该载体通过农杆菌介导法转入两个受体大豆品种吉农28和吉农42中,经PCR检测,吉农28和吉农42分别获得了17株和13株T_1阳性植株,36株和25株T_2阳性植株。T_2转基因植株Southern杂交结果显示,目的基因以单拷贝的形式整合到大豆基因组中。荧光定量PCR检测结果表明,Cry8-like在转基因植株幼根得到了表达,而非转化受体对照未检测到荧光信号。室内抗暗黑鳃金龟幼虫鉴定结果表明,转基因植株提高了抗暗黑鳃金龟幼虫的能力。     

小麦WVp-1基因表达载体的Gateway技术构建及其遗传转化

为了利用中国特有的抗穗发芽小麦遗传资源,并深入分析Viviparous-1(Vp-1)基因在小麦穗发芽抗性中的作用,从抗穗发芽小麦品种西农979的干种子中分离了vp-1基因的同源基因,命名为wvp-1.利用Gate-way技术,以植物表达载体pLeela为基础,成功构建了舍有双35S启动子的高效表达载体,并转化拟南芥突变体abi3-4,获得了8株阳性植株.     

农杆菌介导的β-1, 3-葡聚糖酶基因转化花生的研究

以花育22号成熟胚萌发5-7 d的幼叶为外植体,以农杆菌为介导将含有β-1,3-葡聚糖酶基因的表达载体pATC940转入花生,获得转基因植株。结果表明,外植体经预培养1-2 d,于OD600为0.5-1.0之间的农杆菌菌液中浸泡10-15 min,再共培养3 d,有利于提高转化率。并对再生的抗性植株进行了PCR检测。     

CbDREB1A基因表达载体构建及转化水稻光温敏核不育系的研究

为了增强荠菜DREB1A基因在转基因水稻中的表达,构建了由Ubi启动子驱动的植物表达载体pUΩCbDREB3300.通过基因枪转化法将CbDREB1A基因导入水稻光温敏核不育系4008S,获得5个抗干旱胁迫的再生植株.运用PCR及Southern杂交技术对抗性再生植株进行鉴定,结果显示CbDREB1A基因已整合到水稻基因组中.干旱胁迫后转基因水稻植株脯氨酸含量显著高于对照,显示耐旱性增强.     

木质素合成酶基因反义COMT对亚麻的转化及检测

COMT基因主要参与S木质素的生物合成,转基因植物在COMT活性被抑制时,木质素含量减少,利用杨树皮储藏蛋白(BSP)启动子和该基因构建成反义植物表达载体p BSP-antiCOMT-2301,利用农杆菌介导法将其转入亚麻,经过卡那霉素筛选获得了抗性的愈伤组织,诱导分化后获得了亚麻苗。经特异引物的PCR扩增,证明目的基因已经整合到亚麻基因组中,本研究获得的阳性转基因亚麻植株为亚麻纤维研究及品种选育奠定了坚实基础。     

大豆PAL2-3基因的克隆及转化研究

大豆异黄酮是苯丙氨酸代谢途径中合成的一类次级代谢产物,在苯丙氨酸代谢途径中,苯丙氨酸解氨酶(PAL)是关键酶和限速酶。本课题组前期研究发现PAL基因的相对表达量与大豆异黄酮含量具有明显的协同增减趋势,并且在PAL基因家族成员时空表达模式分析中发现,PAL2-3(XM_003542493)是PAL基因家族中相对表达量较高的主要表达成员之一。本试验首先通过克隆大豆中PAL2-3基因;然后构建pCAMBIA3301-GmPAL2-3植物过表达载体,将构建好的pCAMBIA3301-GmPAL2-3表达载体重组质粒转化到根癌农杆菌EHA105中;采用农杆菌介导的大豆子叶节转化体系获得转化植株,并对T1代转化植株进行PPT检测,外源标记基因Bar检测以及荧光定量PCR检测,对转基因阳性植株进行大豆籽粒异黄酮含量的测定。结果表明T_1代转基因植株中PAL2-3基因的表达量是对照的5.11~11.24倍,总异黄酮含量最高的(2 587.63μg·g~(-1))是对照(1 616.90μg·g~(-1))的1.6倍。因此在大豆中过量表达PAL2-3基因可以提高大豆籽粒中异黄酮含量。     

大豆C_2H_2型锌指蛋白基因SCTF-1转化及功能分析

为探讨锌指蛋白在大豆对非生物逆境胁迫耐受过程中的作用,构建了锌指蛋白基因SCTF-1的植物表达载体p CPB-SCTF-1,利用花粉管通道法将其导入大豆中,通过抗性筛选及PCR检测,共获得了6株转SCTF-1基因植株,Southern杂交鉴定表明功能元件以单拷贝形式整合于受体基因组中。荧光定量PCR检测证明转化植株在根、茎、叶部位的表达与未转化植株相比显著提高。在4℃低温胁迫下,转SCTF-1基因植株相对电导率明显低于非转化植株,降低了21.10%~23.09%;丙二醛含量明显低于非转化植株,降低了10.56%~11.74%;过氧化物酶活性明显高于非转化植株,增加了25.02%~30.38%;转基因植株叶片未呈现明显的萎缩、萎蔫、打卷现象。因此,转SCTF-1基因的过量表达提高了转基因大豆的耐冷能力。     

抗虫基因cry1Ab13在大豆中的遗传转化及抗虫性鉴定

cry1Ab13基因是抗虫基因,编码的杀虫晶体蛋白对鳞翅目害虫具有一定的毒杀作用,构建了植物表达载体pCambia3300-35S-cry1Ab13,通过花粉管通道法将该载体转入大豆品种吉农28中,经PCR扩增检测得到15株T_1代阳性植株。Southern blotting分析显示有5株出现杂交信号,并以单拷贝形式整合到大豆基因组中。荧光定量PCR测定结果表明:cry1Ab13基因在转化植株的叶、茎秆中均有表达,每株表达量各不相同,在叶片部位表达量相对较高,最高为6.7,最低为2.5;在茎部表达量最高为0.76,最低为0.31。对T_1代阳性植株籽粒,采用圆盘分隔法接入大豆食心虫幼虫,进行初步抗虫试验,结果显示转化植株抗虫效果明显,但后代稳定性还需进一步研究。     

农杆菌介导法将Bt（cryI4）基因导入大豆的研究

构建含有Bt（cryIA）基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Bt，以大豆子叶节为受体，通过农杆菌介导法将Bt基因导入大豆品种黑农37中，获得转基因植株。并进行大豆的再生和遗传转化系统优化的研究，以获得较高的转化率。结果表明：在6-BA浓度为1．7mg·L^-1时，丛生芽分化率最高。确定该品种大豆在丛生芽分化阶段的草铵膦筛选浓度为3．5mg·L^-1。获得转化质粒pCAMBIA3300-Bt的转基因植株，其中T1代PCR阳性植株19株。采用real—timePCR的方法对T4代抗性植株进行助基因的转录水平的分析，初步证明成基因已整合到受体大豆的基因组内。