半滑舌鳎Dmrt1蛋白表达、纯化及功能

通过分析半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) Dmrt1重组蛋白注射卵巢后基因表达调控, 探讨Dmrt1在半滑舌鳎性别决定与分化中的功能。实验利用原核表达系统(Pet-32a)对半滑舌鳎Dmrt1基因进行重组表达, 并通过亲和层析纯化获得了重组目的蛋白(Pet-32-dmrt1)。重组蛋白注射卵巢后实时定量PCR分析结果显示, Cyp19a和Foxl2在6～24 h内两基因表达量均显著下调, Sox9a基因表达量在6～24 h内有显著上调, 但48 h后3个基因的表达量逐渐恢复正常表达水平。研究结果证实, Dmrt1重组蛋白具有生物活性, 且对性别相关基因表达调控具有一定的影响, 在性别决定中发挥一定作用。

     

半滑舌鳎生长因子midkine的定点改造及原核表达

为进一步研究半滑舌鳎midkine(MK)成熟肽活性与功能,对半滑舌鳎生长因子MK成熟肽进行定点改造及原核表达.根据大肠杆菌偏爱密码子的特点,实验利用SOEing PCR法对半滑舌鳎MK成熟肽进行定点突变.将改造后的半滑舌鳎成熟肽MK克隆到载体质粒pET32a(+),构建原核表达载体pET32a(+)-MK,并转化至大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株中.SDS-PAGE结果显示,与对照组相比,经IPTG诱导表达后半滑舌鳎重组蛋白MK存在于大肠杆菌上清液中,产物相对分子质量约为33 ku.研究表明,本实验对半滑舌鳎生长因子midkine成功进行了定点改造,原核表达质粒成功构建并在大肠杆菌中高效表达,且主要以可溶形式存在.     

半滑舌鳎类胰岛素生长因子-Ⅰ的原核表达及活性分析

根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Güther)类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-I)基因的cDNA序列, 设计引物扩增编码IGF-I成熟肽序列, 此序列由210个碱基组成, 包括B-C-A-D 4个功能域。利用PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体pET-28a上, 得到重组质粒, 将重组质粒导入到大肠杆菌BL21( DE3)后经IPTG诱导产生N端含6个组氨酸的融合蛋白。以SDS-PAGE电泳检测和SigmaScan软件分析获得的多肽, 结果表明: IGF-I融合蛋白大小为11.4 kD, IPTG诱导3 h时目的蛋白表达量最高, 占细菌总蛋白的58.5%, 1 L菌液表达目的蛋白40.7 mg, 主要以包涵体形式存在。利用Western-blotting方法验证融合蛋白可特异性的被6×His抗体识别。诱导表达后的菌液沉淀经6 mol/L盐酸胍变性、Ni²⁺离子亲和柱纯化和尿素梯度复性, 获得大小为11.4 kD的纯化蛋白。细胞增殖实验表明, IGF-I融合蛋白可显著促进乳腺癌细胞MDA231细胞的增殖, 具有生物学活性。本研究通过原核表达技术获得了体外重组的具有生物活性的半滑舌鳎IGF-I融合蛋白, 结果可为半滑舌鳎生长调控技术研究提供基础资料。

     

半滑舌鳎食欲素A体外重组表达及活性分析

为了在蛋白水平上认识半滑舌鳎食欲素A(orexin A)的摄食调控作用及机制,利用原核表达载体pET32a成功构建了重组半滑舌鳎orexin A/pET32a质粒,转化至大肠杆菌BL21后经IPTG诱导获得了N端含6个组氨酸的半滑舌鳎orexinA重组蛋白。获得的重组蛋白大小为24.9 ku,32℃下用1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h目的蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的52.8%,并主要分泌在上清液中。Western blotting免疫印迹表明,获得的orexin A重组蛋白可被6×His抗体特异性识别。Ni~(2+)-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的半滑舌鳎orexin A重组蛋白。下丘脑离体孵育实验表明,获得的orexin A重组蛋白能显著影响半滑舌鳎下丘脑NPY mRNA,orexin mRNA的表达水平和NPY肽的分泌,表明获得的重组蛋白具有生物活性。研究结果可为探究orexin A在半滑舌鳎摄食代谢中的作用机制及研制高效绿色的促摄食制剂提供基础资料。     

半滑舌鳎HIRA基因部分cDNA序列克隆及表达分析

为研究HIRA基因在半滑舌鳎胚胎发育中的作用及其组织差异表达,以半滑舌鳎为研究对象,采用同源克隆策略从其精巢中分离了长度为764bp的HIRA部分cDNA序列,该片段编码254个氨基酸,具有5个wD结构域。对氨基酸进行比较发现,半滑舌鳎HIRA与比较物种的氨基酸序列具有很高的同源性,与红鳍东方纯亲缘关系最近。实时定量PCR分析发现,HIRA mRNA在多细胞期到原肠胚期的表达量较高,表明HIRA对胚胎发育起重要作用;HIRA在不同组织中表达差异显著,其中在性腺中表达最高,推测HIRA在维持性腺的功能方面有一定作用。     

半滑舌鳎 WT1a 基因的克隆与性别分化期的表达分析

从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)全基因组序列中获得肿瘤抑制基因 WT1a 的部分序列, 然后利用 RACE 技术克隆了WT1a 基因的全长, 运用组织学方法, 对半滑舌鳎性腺分化早期的组织切片进行了观察, 并分析了该阶段WT1a 的表达特征。克隆结果显示, WT1a 基因cDNA全长为1 886 bp, 开放阅读框(ORF)长为1 470 bp, 编码490个氨基酸, 并且包含 KTS 三肽, 5′-UTR 和3′-UTR 分别长为245 bp 和171 bp。在 ORF 末端发现2个微卫星(SSR)序列和2个跨膜螺旋区域, 而在其他物种中未发现这些区域。氨基酸序列分析显示, WT1a 基因的保守性很高, 与人的同源性高达90%。通过组织切片观察发现, 该批半滑舌鳎在56 d时性腺开始分化, 并且卵巢分化早于精巢。荧光实时定量分析结果显示, WT1a 在半滑舌鳎成鱼性腺中表达量显著高于其他各组织, 在肝、肾、脾、心脏等组织中有微量表达, 并且在成鱼性腺中, 雄鱼表达量显著高于雌鱼, 雌鱼显著高于伪雄鱼。在胚胎发育各时期以及初出膜后WT1a的表达结果显示, 在12 h (原肠早期)显著升高, 20 h (神经胚期)达到最高。在性腺分化早期雌雄性腺中的表达结果显示, WT1a 在雌雄半滑舌鳎16~66 d 的性腺中表达量持续平稳升高, 在性腺分化时期表达量并没有特殊的变化。这些研究结果说明, WT1a 基因是半滑舌鳎性别相关基因, 并在半滑舌鳎的性腺分化、发育过程中持续表达, 但可能对性腺的分化过程并不起决定作用。

     

半滑舌鳎颗粒酶B基因的克隆和表达分析

颗粒酶(granzyme, Gzm) B是免疫炎症反应必不可少的介质,可激活半胱天冬酶3,进而诱导靶细胞的凋亡。本研究通过PCR扩增和RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)颗粒酶B基因(CsGzmBl)的全长cDNA序列,并对其序列特征和表达水平进行了分析。结果显示,CsGzmBl cDNA全长为923 bp,开放阅读框长度为780 bp,编码259个氨基酸(前19个氨基酸残基为信号肽序列),5′非编码区为49 bp,3′非编码区为94 bp。CsGzmBl的基因组结构比较保守,由5个外显子和4个内含子组成。CsGzmBl蛋白包含2个N端糖基化位点、1个催化三联体“His63Asp112Ser207”、1个“PHSRPYMA”结构域及6个保守的半胱氨酸。荧光定量PCR结果显示,CsGzmBl在半滑舌鳎健康成鱼不同组织中均有表达,其中,在脾脏中表达量最高,头肾、中肾、肝脏和鳃中表达量次之,在肌肉中表达量最低。与对照组0 h相比,CsGzmBl在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后的不同时间点的脾脏、肠、肝脏、皮肤、鳃和肾脏中的表达水平均有不同程度的上调。研究表明,CsGzmBl基因在半滑舌鳎抵御哈维氏弧菌感染过程中发挥重要作用。     

半滑舌鳎CD40基因克隆及其免疫功能分析

本研究通过RACE技术在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆得到1个CD40同源基因。该基因c DNA全长为2098 bp,开放阅读框为1011 bp,可编码由336个氨基酸组成的蛋白质。推导得到的CD40氨基酸序列包含1个信号肽、1个跨膜结构区、2个N-糖基化位点以及含4个富含半胱氨酸的保守结构区。不同物种氨基酸序列同源分析结果显示,该基因与哺乳类、两栖类以及硬骨鱼类相似性为28%~47%,其中与硬骨鱼类相似性较高。系统进化分析结果显示,半滑舌鳎CD40与其他硬骨鱼类CD40聚类为一支,哺乳类与两栖类CD40聚类为另一支。荧光定量PCR结果显示,CD40在健康半滑舌鳎不同组织中均有表达,其中在鳃、肝和脾等组织中表达量较高,在肠、肌肉和皮肤中表达量较低,在脑和肾中微量表达。经哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染刺激后,与PBS处理的对照组相比,该基因m RNA在半滑舌鳎3个主要免疫组织(肝、脾和肾)中表达量均呈显著性升高,在肝中12 h到达峰值,在脾和肾中6 h达到峰值。上述结果表明CD40基因参与了半滑舌鳎抵抗哈维氏弧菌的免疫应答反应。     

半滑舌鳎rimoc1基因在雌雄鱼中的差异表达

动物中普遍存在性别生长二态性,这种现象在海水鱼中更为明显。半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)性成熟雌鱼体重显著高于雄鱼,雌性个体的生长速度比雄性快2~4倍。本研究旨在探究rimoc1基因在半滑舌鳎雌、雄鱼中的表达差异及与性别和生长的关系。实时定量和原位杂交结果显示,rimoc1在雄性组织中未检测到表达,而在雌性组织中表达量最高的是卵巢和肌肉,在卵巢中表达相对稳定,在孵化后1.5年(1.5 yph)和3 yph的水平有所增加。在细胞系中通过siRNA干扰敲除rimoc1后,发现生长相关基因igf1、性别分化相关基因sox9b和foxl2的表达水平显著降低,而sox9a的表达升高。启动子活性分析显示,rimoc1启动子可能受到C/EBPdelta、Sox2和c-Jun等转录因子的调控。推测rimoc1可能在半滑舌鳎的性别分化和生长中发挥重要作用,为深入研究半滑舌鳎的性别生长二态性提供了基础。     

半滑舌鳎胚胎发育及其与水温的关系

2002年8～9月在山东莱州明波水产公司养鱼场,半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther, 1873)亲鱼经人工诱导催熟,在亲鱼培养池中雌、雄个体同时排卵、排精并完成了自然授精.卵子受精后,对受精卵进行连续的取样,在Nikon SMZ-10双筒解剖镜下观察胚胎发育的全过程.培养水温20.5～21.6 ℃,盐度33.50,pH 7.8～8.6,受精卵1 h 30 min细胞开始分裂,4 h 5 min为多细胞期,5 h 0 min为囊胚期,22 h 20 min胚孔关闭,40 h 20 min仔鱼开始孵出.根据本次实验以及1982年、1987年、1989年和2002年8月进行的半滑舌鳎人工孵化实验结果,应用3种数学统计方法,从理论上对半滑舌鳎胚胎发育的阈温度和有效积温值进行计算,结果表明,半滑舌鳎胚胎发育的阈温度和有效积温分别为13.2 ℃和347.0 ℃·h.     

半滑舌鳎Dmrt4基因DNA全序列的克隆与表达分析

克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Dmrt4基因DNA全序列,得到的序列长度为2271 bp,包含1个内含子,2个外显子,与其他鱼类的同源性在90%以上.Dmrt4基因在雌性和雄性半滑舌鳎的7个组织中都有表达,有差异表达的组织是脑、垂体和性腺,雄性的表达显著高于雌性(P<0.05).高温处理组的伪雄鱼中Dmrt4基因的表达与对照组的雌鱼没有显著差异(P>0.05),但是甲基睾酮处理组的雄鱼和伪雄鱼的表达显著高于对照组的雌鱼和雄鱼(P<0.05).Dmrt4基因的表达在胚胎发育过程中呈现先升高后降低的趋势,在原肠期表达量最高,显著高于其他几个时期(P<0.05),从尾芽形成期开始恢复到多细胞期的表达水平,之后几个时期 Dmrt4基因的表达无显著变化(P>0.05),一直到出膜前保持恒定.研究表明, Dmrt4基因是雄性中优势表达的基因,并且受雄性基激素调节,但并不是性反转的必要因素.这一研究为半滑舌鳎全雌群体的建立提供了分子水平的研究基础.     

半滑舌鳎骨形态发生蛋白4基因的克隆和表达分析

本研究克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)骨形态发生蛋白4(BMP4)基因的c DNA序列,并分析其在半滑舌鳎成鱼的组织表达分布及其在早期发育阶段的定位和表达变化趋势。结果表明,半滑舌鳎BMP4基因c DNA全长为1680 bp,包括了419 bp的5′非翻译区(5′UTR)、编码403个氨基酸的1212 bp的开放阅读框(ORF)以及49 bp的3′非翻译区(3′UTR)。同源性分析和分子进化聚类分析结果显示,半滑舌鳎与已报道慈鲷科(Cichlidae)各鱼种的同源性最高,并与之共同聚为鱼类BMP4分支。BMP4 m RNA在半滑舌鳎成鱼的13个组织中具有广泛的分布,并在鳃组织中表达量最高,其次在背鳍、软骨等组织具有中等水平的表达。此外,BMP4基因在早期胚胎发育阶段(卵裂期和原肠期)具有极高水平的表达,此后其表达水平逐渐降低;但在后期仔鱼期(孵化后3日龄和4日龄),其表达水平再次升高。整体原位杂交检测结果表明,BMP4 m RNA在早期仔鱼期主要在头部及躯干前部表达;后期仔鱼BMP4基因主要在冠状幼鳍、上下颌及胸鳍处表达;进入稚鱼期后在鳃盖骨及各鳍均有表达。上述研究结果揭示了BMP4在半滑舌鳎早期骨骼发育中的重要作用,为揭示海水硬骨鱼类骨骼发生、发育的调控机制奠定了理论基础。     

雌雄半滑舌鳎脑垂体基因表达差异研究

为研究半滑舌鳎雌雄个体大小和生长速度差异悬殊的分子机理,采集来自同一亲本、同一发育阶段的半滑舌鳎雄鱼和雌鱼脑垂体,分别与Affymetrix的斑马鱼基因芯片杂交,筛选差异表达基因。芯片杂交结果显示二者共有1 051个基因检测到明显的杂交信号,其中上调基因486个,下调基因561个。进一步比较雄鱼和雌鱼杂交信号的比值(Ratio值),有39个基因的Ratio值小于0.6或大于1.5,其中sh3gl1b、meis2.1、acta1、Noxa、slc25a5这5种上调基因和col1a2、klf7、acta2这3种下调基因可能与半滑舌鳎雌雄生长差异相关。这一结果为深入研究半滑舌鳎雌雄性别分化与生长调控机制提供了新思路。     

半滑舌鳎孕酮受体膜组分1基因的克隆及组织和时空表达规律

运用同源克隆和RACE方法获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)孕酮受体膜组分1(PGRMC1)的c DNA全长序列,生物信息学分析显示,半滑舌鳎PGRMC1 c DNA序列全长1335 bp,开放阅读框长546 bp;其编码的蛋白是单次跨膜蛋白,在N端13~35位氨基酸残基处有一个跨膜区域。半滑舌鳎PGRMC1氨基酸序列与青鳉(Oryzias latipes)相似性最高,达到了82.9%;与青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)相似度为81.2%。系统进化分析表明,半滑舌鳎PGRMC1与鳉形目和鲀形目鱼类PGRMC1聚为一个分支。采用实时荧光定量RT-PCR技术研究发现,性成熟雌性半滑舌鳎PGRMC1 m RNA在各组织广泛表达,其中在卵巢组织中相对表达量最高(P0.05)。在不同卵巢发育时期,半滑舌鳎PGRMC1 m RNA在脑、垂体和卵巢中的周期表达变化特征显示:脑中PGRMC1 m RNA在卵巢Ⅲ期表达量升高明显,Ⅴ期表达水平最高(P0.05);垂体中PGRMC1 m RNA表达量在卵巢发育Ⅴ期达峰值(P0.05);在卵巢中,PGRMC1 m RNA表达水平从卵巢发育Ⅱ到Ⅴ期稳步上升,Ⅴ期时达到最高值(P0.05)。综上,半滑舌鳎PGRMC1基因主要参与卵巢的发育和成熟过程,并在繁殖期介导孕酮调控卵母细胞的最终成熟,研究结果为半滑舌鳎繁殖内分泌调控研究提供了基础资料。     

半滑舌鳎Dorsalin-1-like基因的克隆与表达

摘要:  Dorsalin-1 是骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)家族成员,  在调控脊椎动物神经系统的发
育中具有重要作用。目前,  国内外有关脊椎动物 Dorsalin-1 的研究报道十分有限。本研究克隆了半滑舌鳎
(Cynoglossus semilaevis) Dorsalin-1-like基因的cDNA序列,  并分析了Dorsalin-1-like mRNA在半滑舌鳎成鱼的组织
表达差异及其在早期发育阶段的表达水平变化。 研究结果表明,  半滑舌鳎Dorsalin-1-like基因cDNA全长为1 961 bp,
包括了 153 bp 的 5′非翻译区(5′UTR)、 编码 419 个氨基酸的 1 260 bp 的开放读码框(ORF),  以及 548 bp  的 3′非翻译
区(3′UTR)。 同源性分析和分子进化聚类分析结果显示,  半滑舌鳎 Dorsalin-1-like 鲀 与红鳍东方 (Taleifugu rubripes)、
尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)等的同源性最高,  并与之共同聚为鱼类 Dorsalin-1 分支。此外, Dorsalin-1-like
mRNA 在半滑舌鳎成鱼的 13 个组织中具有广泛的分布,  并在心脏组织中表达量最高,  在肝、脊髓等组织中次之。
在半滑舌鳎早期发育阶段(卵期、仔鱼、稚鱼、幼鱼)中, Dorsalin-1-like 在卵期中的胚胎期表达量最高,  其次为前期
仔鱼期。上述实验结果表明, Dorsalin-1 在调控卵期和仔鱼期的早期发育中具有重要作用,  并可能通过调节神经系
统的发育进而参与心脏、骨骼等组织的发育调控。本研究旨在揭示 Dorsalin-1-like 基因在调控半滑舌鳎早期神经
系统发育的重要作用,  并为筛选半滑舌鳎骨骼发育的调控因子奠定理论基础。

     

温度对半滑舌鳎家系生长及性别的影响

以建立半滑舌鳎家系为研究材料,在受精后46 d,将家系在17.5、19.5、21.5、23.5、25.5和27.5℃6个温度梯度下培育65 d;分别在受精后64、80、103、118、129、198 d测量各温度梯度下半滑舌鳎鱼苗体长和体重,利用方差分析、Student-Newman-Keuls多重比较,分析半滑舌鳎家系鱼苗的生长规律及培育温度与体长和体重的相关性。结果显示,在以上温度范围内鱼苗的生长速度随温度的升高而加快,在198 d以后,25.5℃下鱼苗生长最快(P<0.05),21.5～23.5℃次之(P<0.05),27.5℃生长下降(P<0.05),17.5～19.5℃生长最慢(P<0.05)。在17.5～27.5℃,温度与半滑舌鳎家系生长体长、体重的Pearson系数分别为0.553和0.809,都达到极显著正相关(P<0.01)。体长、体重与温度关系式分别为L=2.460 7t0.9979(R2=0.362 8)和W=9.0×10-5t2.976(R2=0.789 5)。在198 d解剖统计各温度梯度下雌雄比例,同时固定30尾鱼苗性腺,利用光学切片法辨别并统计雌雄性别比例,对获得的性别比例进行方...     

半滑舌鳎皮肤溃疡病病原研究

为了对半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原进行研究, 从患有严重皮肤溃疡病的半滑舌鳎病灶中分离病原菌, 并经人工感染确认病原。对引起此次疾病的病原菌的形态特征、理化特性、胞外产物酶活性与溶血活性及其对抗菌类药物的敏感性等生物学特性进行了研究和分析, 还测定了16 S rRNA、gyrB基因序列, 分析了相应序列的同源性并构建了系统发育树。结果从病灶中分离得到4株优势菌, 经人工注射感染证实菌株A3为引起养殖半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原菌, 其半数致死量LD50为1.5×104.2 CFU/mL。其中, 16 S rRNA、gyrB在GenBank中的登录号分别是JN391271、JN168881。从基于16 S rRNA与gyrB基因序列构建的系统发育树看, 分离筛选出来的病原菌与哈维氏弧菌同源性最高, 结合生理生化特征和16 S rRNA、gyrB基因序列分析结果, 认为该病原菌为哈维氏弧菌。胞外产物酶活性及溶血活性检测结果表明,该病原菌具有淀粉酶、尿素酶、脂肪酶、蛋白酶和卵磷脂酶活性而不具有明胶酶活性, 在4%羊血TSA平板上呈β溶血活性。病原菌的药物敏感性试验结果显示, 该菌对四环素、强力霉素、诺氟沙星、磺胺异恶唑等敏感, 而对其他用于试验的抗生素敏感度低或具有一定的抗性。