橡胶树多主棒孢病菌毒素的纯化

利用海南橡胶树多主棒孢培养液,通过透析、冷冻干燥浓缩、硫酸铵沉淀以及离子交换层析等方法对粗毒素进行了浓缩与提纯,获得的粗毒素通过生物测定和聚丙烯酰胺凝胶电泳验证。结果显示,该方法能获得较纯的具有活性的蛋白毒素,其在凝胶电泳中显示分子量约为14.4ku。     

橡胶树多主棒孢病菌原生质体转化体系的建立

由多主棒孢病菌侵染引起的棒孢霉落叶病是严重危害橡胶生产的一种世界性病害,近年来在中国也有发ⅱ生.在菌龄、细胞壁酶种类、酶作用浓度、作用时间、酶解温度、渗透压稳定剂等因素对橡胶树多主棒孢原生质体制备和再生影响分析的基础上,笔者首次建立了PEG介导的多主棒孢病菌遗传转化体系,并获得了多主棒孢病菌绿色荧光转化子.该体系中,多主棒孢病菌的原生质体再生率为19.12%,转化率为10.34个/μgDNA.     

不同来源橡胶树多主棒孢病菌致病性及基础生物学特性的比较

对已在我国海南、云南、广西等省区橡胶树上发生为害的3株多主棒孢病菌(Corynespora cmssiicola)和来自印度的橡胶树多主棒孢病菌进行了致病性及基础生物学特性的比较研究.结果表明,印度HCcYD01菌株的致病力最强;基础生物学特性测定结果表明,参试的3株国内菌株与印度菌株问除分生孢子大小、孢子萌发和致死温度相似外,在菌落形态、最适培养基、光照条件、碳氮源利用、最适生长温度和pH等方面存在一定差异.由多主棒孢引起的橡胶树棒孢霉落叶病业已成为影响天然橡胶产量的主要限制因素,本研究旨在了解我国橡胶树棒孢霉落叶病的最初发病病原,为该病发生规律的研究及防控措施的制定提供理论依据.     

国内橡胶树多主棒孢Cassiicolin毒素多样性及致病性分析

由多主棒孢引起的棒孢霉落叶病是橡胶树的主要叶部病害,cassiicolin毒素是病菌的主要致病因子。本研究通过ITS序列分析对供试多主棒孢菌株进行了准确鉴定,利用cassiicolin毒素不同亚型编码基因特异引物对不同地理来源和寄主来源的49个多主棒孢菌株毒素类型进行了分析,并利用生物萎蔫法对不同亚型毒素进行了致病性分析。结果显示,78%供试菌株含有cassiicolin基因,其中Cas2亚型有10个菌株,Cas5亚型有28个菌株,其它为Cas0型(未检测到cassiicolin毒素基因)。含有Cas5亚型的菌株均来源于橡胶树,并且为橡胶树上的优势群体;Cas2亚型菌株则来源于橡胶树、黄瓜、番木瓜和木薯等不同作物;Cas2和Cas5毒素对不同橡胶树品种的致病性存在明显差异。     

巴西橡胶树棒孢霉落叶病概述

对巴西橡胶树棒孢霉落叶病的发生与为害、症状、病原生物学、流行学及防治策略等进行了概述。     

橡胶树多主棒孢菌室内产孢条件的优化

对橡胶树多主棒孢菌株3种室内产孢方法进行了比较,通过产孢量、孢子大小、活力和致病力等方面的评价,发现菌丝打断法结果优于自然产孢法和纸片产孢法。进一步的研究结果表明:光暗交替、28℃、pH7、RH75%是孢子产生的最适条件;产孢时培养基越多,产孢量越高;菌丝打断后36h时产孢量达到最高。采用菌丝打断法共进行25个多主棒孢菌株的室内产孢试验,所有菌株产孢量均在6.1×105个/cm2菌落以上。     

10种无机盐对橡胶树多主棒孢病菌的抑菌作用及对粗毒素的钝化

以橡胶树棒孢霉落叶病病原菌及其产生的粗毒素为供试材料,研究了10种无机盐对多主棒孢菌株菌丝生长、分生孢子萌发的抑制作用和对其粗毒素的钝化作用。结果表明:CuSO4.5H2O、FeCl3和FeSO4.6H2O在2～5mg/mL浓度范围内对多主棒孢病菌菌丝生长及其孢子萌发都有很强抑制作用,菌丝生长抑制率为100%,孢子萌发率为0。KMnO4在0.5～5 mg/mL浓度范围内能够完全抑制孢子的萌发,而1～5 mg/mL浓度范围内却促进菌丝的生长。KMnO4和FeCl3在浓度为0.5 mg/mL时对该毒素均有很强的钝化作用,萎蔫指数分别为2.04%和3.97%。     

橡胶树多主棒孢病菌遗传多态性分析

利用ISSR（简单序列重复区间扩增多态性）和RAPD（随机扩增多态DNA）技术对供试的18个多主棒孢菌株进行了遗传多态性分析,研究结果表明,2种分子标记技术均能揭示橡胶多主棒孢病菌的遗传多态性。同时利用P距离模型构建了18个多主棒孢菌株的UPGMA聚类分析树状图,根据2种技术构建的UPG—MA聚类树状图可将供试菌株分为3个主要类群。ISSR类群和RAPD类群与地理来源均不存在明显的关系。     

橡胶树多主棒孢病菌强致病菌株的筛选及产毒条件优化

从采白海南、云南和广西的橡胶树棒孢霉落叶病病样中分离获得17株单孢菌株,致病性测定结果表明,来自海南的HC-10菌株致病性最强.HC-10产毒条件及毒素活性测定结果表明,改良Fries 3号培养基、25℃光照12 h培养10 d、转速为160r/min以及培养基初始pH值为4最有利于毒素的产生;温度、紫外线及不同的毒素浓度与毒素的活性存在一定的相关性.     

海南橡胶树棒孢霉落叶病病情调查与病原鉴定

报道了我国海南橡胶树棒孢霉落叶病病情调查结果，并通过病害诊断、病原菌基础生物学特性研究和分子鉴定认为，该病的病原为多主棒孢[Corynesporacassiicola(Berkandcurt.)Wei]真菌。     

巴西橡胶树棒孢霉落叶病病原菌的生物学特性

研究多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)的生物学特性,结果表明,菌丝生长的最适温度为28℃,最适pH为6～9,孢子萌发的最适温度为28～30℃。该菌能有效利用各种碳源和氮源,碳源以麦芽糖最好,氮源以蛋白胨最好。光照处理对菌丝生长速度影响不显著,交替光照有利于产孢。菌丝致死温度是60℃,15min;分生孢子的致死温度是55℃,5min。在PDA,PSA,Czapek等培养基上生长良好,但不能大量产孢,在保湿的卫生纸、玻璃片和橡胶离体叶片上,能大量产孢。     

木薯器官及其混合物水浸提液对橡胶树棒孢霉落叶病病菌的化感作用

采用生长速率法探讨不同浓度木薯器官及其混合物水浸提液于不同处理天数对橡胶树棒孢霉落叶病病菌的化感作用。结果表明:(1)根、叶水浸提液表现为化感抑制效果,浓度越大,效果越明显。(2)茎水浸提液在浓度为10~100 mg/mL时无明显化感效果;浓度达1 000 mg/mL时,处理后3~7 d时表现为显著的化感促进效果。(3)根、茎、叶比例为4:2:1的混合物水浸提液在10~100 mg/mL浓度时无明显化感效果,当浓度达1 000 mg/mL时,在处理后4~6 d表现为化感抑制效果。(4)茎、叶比例为2:1的混合物水浸提液在10 mg/mL浓度时化感效果不明显;当浓度达到100 mg/mL时,处理后2 d表现为显著的化感抑制效果,处理后3~6 d化感效果不明显;浓度达到1 000 mg/mL时,处理后2~3 d无明显的化感效果,处理后4~6 d则呈现显著的化感促进效果。建议间作木薯的胶园收获木薯后,应及早将茎干移出胶园,以减少橡胶树棒孢霉落叶病的发生。      

木薯根系分泌物与土壤浸出液对橡胶树2种致病菌的化感效果

采用平板试验,通过生长速率法分析木薯根系分泌物及其土壤浸出液对橡胶树白根病病菌及棒孢霉落叶病病菌的化感效果,为判断胶园林下种植木薯的可行性提供理论依据。结果表明：（1）木薯根系分泌物对橡胶树白根病和棒孢霉落叶病病菌均表现为化感促进效果,但在任一处理时间,不同浓度间对白根病病菌的化感效果与对照均未达显著差异,而对棒孢霉落叶病病菌的化感效果呈现明显的剂量效应,浓度达40 mg/mL时,化感促进效果与对照达到显著水平。（2）木薯根系分泌物的任一浓度,对橡胶树白根病和棒孢霉落叶病病菌的化感效果,在不同处理天数间均未达到显著水平。（3）木薯土壤浸出液对橡胶树白根病和棒孢霉落叶病病菌均呈现化感促进效果,且存在明显的剂量效应;对橡胶树白根病病菌,处理后2 d,达到显著化感效果所需浸出液浓度至少为40 mg/mL,处理后3 d和处理后4 d,达到显著化感效果所需浸出液浓度至少为8 mg/mL;对棒孢霉落叶病病菌,在任一处理时间达到显著化感效果的浸出液浓度均至少为200 mg/mL。（4）土壤浸出液小于8 mg/mL时,3个处理时间之间的橡胶树白根病病菌化感效果无显著差异,当浓度达到40 mg/mL时,处理后2 d的化感促进效果显著大于处理后3 d和4 d;4种土壤浸出液的任一浓度,对橡胶树棒孢霉落叶病病菌的化感效果在不同处理时间之间均未达到显著差异。所以说,幼龄胶园间作木薯会在一定程度上促进橡胶树棒孢霉落叶病和白根病的发生。     

巴西橡胶树主要种质对棒孢霉落叶病抗性评价

由多主棒孢(Corynespora cassiicola)引起的橡胶树棒孢霉落叶病已成为影响天然橡胶产量的主要限制因素。本实验对从我国海南、云南和广西等地分离得到的17个橡胶树多主棒孢病菌菌株进行了致病性测定,获得强致病力菌株HC-10。分别用该菌株菌丝体接种鉴定、粗毒素叶片穿刺接种和叶片萎蔫生物鉴定等3种方法对我国选育的45个巴西橡胶树品种进行抗病性评价。结果表明,不同橡胶树品种对棒孢霉落叶病的抗性水平存在明显差异。在供试的45个品种中,不同抗性评价方法的鉴定结果基本一致,抗病品种占13.3%~17.8%;轻感病品种占66.7%~73.4%;易感病品种占11.1%~17.8%。     

橡胶树多主棒孢病菌Cassiicolin基因条形码数据库构建及分子检测技术

多主棒孢（Corynespora cassiicola）是为害我国主要热带作物的植物病原真菌,其寄主范围广、形态差异显著、症状类型多样,且含有一种寄主专化性毒素Cassiicolin,存在6种毒素类型。本研究利用已公布的Cassiicolin毒素基因（Cas1~Cas6型）,构建了含287个菌株的国内橡胶树和部分热带作物多主棒孢Cassiicolin基因条形码数据库,建立了一套特异性强、灵敏度高的分子检测技术,可检测100 pg/μL的目标基因组DNA,系统分析了我国橡胶树、木薯、番木瓜、瓜菜等主要热带作物的919株多主棒孢的毒素类型,发现国内仅存在Cas2和Cas5这2种毒素类型,其中Cas5型的菌株占94.8%,为橡胶树多主棒孢的优势种群和特有毒素类型。而Cas2型是橡胶树和其他作物多主棒孢共有的毒素型。系统发育分析发现,不同毒素类型的多主棒孢菌株与寄主来源密切相关,但与地理来源没有明显的相关性,且Cas5型多主棒孢具有明显的寄主专化性。通过构建多主棒孢Cassiicolin基因条形码数据库,为明确我国主要热带作物多主棒孢病菌的种群结构和优势种群情况,发掘、保存多主棒孢菌种资源以及制定病害的防治策略上具有重要的指导意义。     

钾水平对巴西橡胶树幼苗 MDA 含量和保护酶活性的影响

采用水培技术研究不同钾水平对 RRIM600 无性系种子实生幼苗各器官 MDA 含量和保护酶活性的影 响。结果表明： 在低钾胁迫下, 除叶部的 K0、 K1、 K10 处理、 根中的 K10、 K50 处理外, 缺钾降低了巴西橡胶树幼苗各器官中 MDA 含量, 但各器官中各处理间 MDA 含量差异不显著; 除叶部的 K0 处理、 茎部的皮和根中 K50处理外, 缺钾降低了各器官中 SOD 酶活性, 且在叶部 SOD 酶活性显著降低; 除叶部的 K1、 K10、 K50 处理、 根中的 K1 处理外, 缺钾降低了各器官中 POD 酶活性, 但各器官中各处理间 POD 酶活性差异不显著; 缺钾极显著提高了巴西橡胶树幼苗叶片 CAT 酶活性。 因此, 在巴西橡胶树幼苗各器官中抵御低钾胁迫主要靠各种保护酶相互协调来完成。     

借助ITS序列用GFP标记巴西橡胶树棒孢霉落叶病病原菌

由多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)侵染引起的巴西橡胶树棒孢霉落叶病是影响橡胶树产胶量的主要病害之一。为了开展该病原菌在活体叶片中的病理学研究,本实验将绿色荧光蛋白gfp基因表达盒插入了多主棒孢菌经定点突变后的ITS序列中,构建了重组质粒p ITGH,并经PEG介导转化了原生质体,获得了GFP标记的多主棒孢菌转化子,所获得的转化子经过连续7次转接培养后仍能在分生孢子、分生孢子梗、芽管和菌丝中稳定地发出强烈的绿色荧光,其生长特性和致病性与野生菌株无明显差异。     

橡胶树叶片转化酶提取方法的比较

比较液氮研磨样品与蛋白抽提液研磨样品对6种提取橡胶树叶片转化酶方法的效果。结果表明：液氮研磨法对转化酶活性影响很大,特别是中性/碱性转化酶和细胞壁结合的酸性转化酶已基本失活,而可溶性酸性转化酶活性丧失也比较严重。利用蛋白抽提液研磨样品,用Hepes-NaOH法提取的可溶性转化酶的酶活性最高,达472.44 μmol（glucose）/[g（FW）·h]; 虽然磷酸-柠檬酸法获得的粗酶液的蛋白含量较低, 但其酶活性高达441.61 μmol（glucose）/[g（FW）·h]; Tris-HCl法提取的细胞壁结合酸性转化酶的酶活性最高, 达35.83 μmol（glucose）/[g（FW）·h]。从转化酶的比活力看,磷酸-柠檬酸法最佳,所提取的可溶性转化酶比活力约为Hepes-NaOH法的4倍。本研究结果为进一步完善橡胶树叶片转化酶的提取方法提供重要的指导意义。