基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征验证

根据RNAi原理构建的抗海南番木瓜环斑病毒(PRSV)植物表达载体p CAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS,通过基因枪法将载体导入番木瓜的愈伤组织中,经卡那霉素抗性筛选后再分化成为植株。描述转化植株的分子特征同时进行抗病毒试验分析其抗病性。实验结果显示:转基因株系474为单拷贝插入的杂合子,插入位点在第7号染色体supercontig_61的717 141位置;抗病毒试验中,在接种病毒后28 d内非转基因株系1280有高浓度的病毒积累并很快表现出明显的病症,而转基因株系474基本无病毒积累且无发病症状。表明转基因株系474具有较好的PRSV抗性,有待于进一步田间试验。     

诱导剂对番木瓜相关防御酶的影响

研究不同浓度水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和壳聚糖(CTS)对番木瓜防御酶活性的影响.结果表明:SA、MeJA、CTS能提高番木瓜叶片相关防御酶的活性,其中喷施SA处理的POD、PAL、PPO、几丁质酶以及β-l,3-葡聚糖酶的活性高于喷施MeJA和CTS的处理.同一处理中,0.5 g/L SA、0.05 mmol/L MeJA和1％ CTS处理的POD、几丁质酶以及β-1,3-葡聚糖酶活性较高.     

水杨酸处理对花生主要防御酶活性的影响

用不同浓度水杨酸(SA)处理花生植株,然后测定不同时间花生叶片中,苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)等主要防御酶活性的变化。结果表明,水杨酸处理花生叶片可明显诱导花生防御酶活性提高,且以7.5 mmol/L浓度水杨酸的作用效果最为显著,各种防御酶在24~48h内逐渐被诱导达到活性高峰。外源水杨酸诱导花生防御酶活性提高,使花生获得系统抗性。     

禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜体内PRSV-CP基因表达的抑制作用

为了解禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜植株体内PRSV基因表达的影响,以组织培养的日升番木瓜为研究对象,以β-actin基因为内参基因,应用RT-PCR技术对番木瓜体内的PRSV-CP基因进行半定量分析,建立一个特异、稳定的RT-PCR半定量检测体系,研究了禾生素、病毒必克和病毒A处理对番木瓜体内PRSV基因表达量的影响。初步说明,0.2 %的禾生素及4.0 g/L和1.0 g/L的病毒必克显著抑制了番木瓜体内PRSV-CP基因的表达,而病毒A及其它浓度的禾生素和病毒必克对番木瓜体内的PRSV-CP基因的     

壳聚糖对番木瓜种子萌发及相关酶活性的影响

在实验室条件下,研究0～12.5 mg/mL壳聚糖溶液浸种处理对番木瓜种子萌发及相关酶活性的影响。结果显示,5.0～10.0 mg/mL壳聚糖溶液浸种能有效地提高番木瓜种子发芽势、发芽率、淀粉酶活性、过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化物酶(POD)活性,其相关酶的活性显著高于对照;12.5 mg/mL壳聚糖溶液浸种对番木瓜种子萌发及相关酶活性的影响则相反,与对照之间差异不显著。表明10.0 mg/mL壳聚糖溶液为番木瓜种子萌发的最适浓度。     

番木瓜环斑病毒海南株系植物RNAi表达载体的构建

为研究广谱抗环斑病毒（PRSV）海南株系转基因番木瓜育种方案,采集海南番木瓜各主要种植区的PRSV株系,以外壳蛋白（CP）、辅助成分－蛋白酶（HC-Pro）和复制酶（Nib）基因作为靶标基因,通过序列比对和运用Clustalx软件分析,得到干扰基因的保守区域和挑选出海南PRSV典型株系的代表样品。以pUCCRNAi为骨架质粒,利用代表样品的CP、NIb、Hc-Pro基因片断保守序列构建RNAi发夹结构,将发夹结构导入pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体,构建出抗PRSV植物表达载体pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS、pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS、pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS。实验将PRSV不同株系保守序列的分析与RNAi的高效抗病设计理念相结合,可用于创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。     

dsRNA介导的PRSV-CP基因3''-端同源序列瞬时表达对番木瓜环斑病毒侵染的影响

体外合成我国番木瓜主产区环斑病毒外壳蛋白(PRsv-CP)基因3'-端278 bp同源区段,构建包含278 bp正义链、内含子(PDK内含子)及278 bp反义链的RNA介导的植物表达载体p2301-CPU,直接转化根癌农杆菌EHA105.通过根癌农杆菌介导的瞬时表达法,研究同源dsRNA对番木瓜环斑病毒(PRSv)侵染的干扰作用.结果表明,瞬时表达的dsRNA能够特异地干扰PRSV侵染.     

几种制剂对番木瓜环斑病的防治效果

分析研究水杨酸(SA)、病毒必克、草酸钾、磷酸钠和磷酸二氢钠等5种制剂对番木瓜环斑病发病前和发病后的防治效果,结果表明:发病前,0.05 g/L的水杨酸、O.1 g/L的病毒必克、1.0 g/L的草酸钾、0.5 g/L的磷酸钠、3.0 g/L的磷酸二氢钠的防治效果分别为71.67%,92.63%,83.72%,80.09%,76.2l%;发病后,水杨酸降低病级数1.67,病毒必克等也一定程度控制了病情发展,而清水处理的病级数上升了1.47.差异均极显著.     

原核表达番木瓜环斑病毒NIa-Pro及其双重酶活鉴定

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)编码的核内涵体蛋白a蛋白酶(Nuclear inclusion body a proteinase,NIa-Pro)是一种多功能病毒非结构蛋白,在病毒侵染宿主及病毒与宿主互作中起着重要作用。本研究利用以麦芽糖结合蛋白(MBP)为融合表达框架的原核表达系统构建了表达NIa-Pro的重组载体pMAL-c5xNP,并转化大肠杆菌,经IPTG诱导和Ni~(2+)-NTA-琼脂糖亲和层析纯化获得了可溶的重组融合蛋白MBP-NIa(N端和C端分别融合MBP和His标签),然后利用蛋白酶Factor Xa切去重组融合蛋白中的MBP,再通过直链淀粉树脂亲和层析纯化获得了可溶的重组蛋白NIa-Pro。活性检测结果表明,重组蛋白PRSV-NIa-Pro具有非特异的双链DNA酶和特异的蛋白酶双重活性。     

dsRNA介导的PRSV-CP基因3＇-端同源序列瞬时表达对番木瓜环斑病毒侵染的影响

体外合成我国番木瓜主产区环斑病毒外壳蛋白（PRSV-CP）基因3＇-端278bp同源区段,构建包含278bp正义链、内含子（PDK内含子）及278bp反义链的RNA介导的植物表达载体p2301-CPU,直接转化根癌农杆菌EHA105。通过根癌农杆菌介导的瞬时表达法,研究同源dsRNA对番木瓜环斑病毒（PRSV）侵染的干扰作用。结果表明,瞬时表达的dsRNA能够特异地干扰PRSV侵染。     

番木瓜畸型花叶病毒(PLDMV)调查鉴定

对采自广州、景洪（云南）、海口（海南）的各１７,２４,１３个番木瓜样品进行ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ和生物测定等分析鉴定,发现来自广州和海口的样品中有２１个样品感染番木瓜环斑病毒（ＰＲＳＶ）,而来自景洪的样品中未发现感染ＰＲＳＶ,在所有样品中都未发现感染有番木瓜畸型花叶病毒的。      

用Golden Gate法构建广谱抗番木瓜环斑病毒海南株系的CRISPR/FnCas9植物表达载体

分子生物学育种是目前防治番木瓜环斑病毒(PRSV)最有效的方法。早期转基因番木瓜抗病毒的策略是根据"致病菌衍生的抗病性"(PDR)原理,将病毒来源的基因全长序列,转入番木瓜并获得抗性。PDR策略最主要特点依赖于靶目标病毒基因序列相似性,不能有效解决海南的番木瓜环斑病毒遗传多样性复杂的株系。本研究着眼于创制广谱的抗PRSV新策略,用最新的CRISPR/FnCas9基因编辑技术和Golden Gate载体构建系统,依据不同PRSV株系的保守序列分析结果,将5个sgRNA(2个CP sgRNA,2个Nib sgRNA和1个HC-Pro sgRNA)串联在一个载体上,实现一个载体可识别剪切5个位点,从而达到广谱抗PRSV的效果,应对海南地区PRSV株系复杂的问题。目前载体已经进行了测序验证,并在番木瓜上进行了叶片局部瞬时表达,初步表现出对PRSV的抑制效果,这为获得广谱抗番木瓜环斑病毒的番木瓜品种奠定良好基础。      

PRSV运动相关病毒蛋白的Sos恢复系统诱饵载体构建及自激活效应检测

为研究与番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白(CP、HC-Pro、CI)互作的寄主因子,构建以Sos恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的3个病毒蛋白诱饵载体,并检测其自激活作用来验证是否适用于后续的文库筛选.通过RT-PCR从番木瓜环斑病毒海南分离物中扩增出这3个病毒蛋白的片段,按正确方向将目标片段分别插入诱饵载体pSos中,并将重组质粒导入酵母温度敏感酵母菌株cdc25H,检测其表达产物对酵母Sos恢复系统Ras信号通路的激活作用而产生的细胞温敏特性影响.结果表明,这3个含番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白的诱饵载体构建正确,对酵母菌株cdc25H的Sos恢复系统无激活作用,激活试验为阴性.     

齿兰环斑病毒外壳蛋白基因的表达及其表达产物抗血清的制备

用pET－21d构建齿兰环斑病毒（ORSV）外壳蛋白基因大肠杆菌表达载体pEO。经SDS－PAGE和Westernblotting分析,含pEO的大肠杆菌正确表达了ORSV外壳蛋白基因。此表达产物为融合蛋白。用表达产物制备抗血清,并应用于间接酶联法检测ORSV,具有较高的灵敏度（10ng／mLORSV）和特异性。     

盐胁迫对大豆种子萌发过程中吸水和水解酶活性的影响

利用不同浓度的NaCl溶液对两个品种的大豆种子进行胁迫萌发试验,研究了盐胁迫对大豆种子萌发的过程中吸水速率和水解酶活性的影响。结果表明:两品种大豆对NaCl胁迫的反应不同,低浓度(50 mmol·L~(-1))的NaCl对早熟毛豆种子吸水和萌发均有促进作用,而对1号毛豆为抑制作用,当盐胁迫浓度达100 mmol·L~(-1)时,早熟毛豆和1号毛豆种子的发芽率、发芽势、发芽指数等均受到显著(P0.05)和极显著(P0.01)抑制。高浓度NaCl胁迫处理使大豆种子吸水受到显著抑制,进而引起淀粉酶活性和蛋白酶活性降低,可能是高盐胁迫抑制大豆种子萌发的主要原因;盐胁迫下早熟毛豆较快的吸水速率和较高的水解酶活性可能是其发芽率高于1号毛豆的原因。     

基于CRISPR基因编辑系统抗番木瓜曲叶病毒的植物转化载体的构建

双生科病毒具有毁灭性强、寄主多样、分布地域广等特点,一直是困扰世界农作物生产的一大难题。用物理和化学方法防治该类病毒不仅花费成本高,见效低,而且还可能对环境造成负面影响,因此用分子手段培育抗病品种才是有效途径之一。本研究结合最新的CRISPR/Cas9基因编辑技术和Golden Gate克隆技术,设计并构建了抗番木瓜曲叶病毒基因编辑串联多切点表达载体。表达载体转入农杆菌AGL1后经注射本氏烟草叶片进行瞬时表达,48 h后通过激光共聚焦显微镜能观察到有绿色荧光的出现,定位的位置为细胞核与细胞质膜。本研究为番木瓜抗曲叶病毒研究提供理论基础。