块根特异启动的木薯SBE Ⅰ、SBE Ⅱ基因RNAi载体的构建及鉴定

利用基因重组技术,分别克隆木薯SBEⅠ基因ORF中的494 bp的片段和SBEⅡ基因ORF中的340 bp的片段;并通过重叠延伸PCR方法,扩增融合SBEⅠ、SBEⅡ基因片段的大片段SⅢ,将其正向、反向插入植物RNAi表达载体pART27中,同时克隆块根特异性启动子取代原来载体上自有的35S启动子,构建块根特异启动的可编码发夹结构的RNAi表达载体Sp-pRNAiSⅢ,为后续培育高直链淀粉含量的木薯新品种等实验打下基础。     

甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的转化

植物中具有A20/AN1锌指结构域的蛋白参与了逆境应答,为研究甘蔗A20/AN1型锌指蛋白基因ShSAP1的功能及在甘蔗抗逆育种方面的价值,本研究通过构建ShSAP1基因的RNAi载体并进行甘蔗的遗传转化,以期通过反向遗传学进行ShSAP1的功能分析。将ShSAP1锌指编码区片段分别以正向和反向插入到中间载体pTCK303内含子的两侧,构建中间载体pTCK-iShSAP1,而后把干扰片段连入pCAMBIA-GUS中,获得RNAi表达载体pCAMBIA-iShSAP1,将该载体转导根癌农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法侵染甘蔗胚性愈伤组织,并对部分转化幼苗进行了初步的PCR鉴定。经过限制性内切酶分析和测序验证,RNAi载体pCAMBIA-iShSAP1构建成功;转化幼苗经PPT抗性筛选后,获得了58株抗性植株,对抗性幼苗进行了Bar基因的PCR检测,得到6株PCR阳性植株。本研究完成了ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的遗传转化,为ShSAP1的功能研究打下了一定的基础。     

调控木薯淀粉合成的干涉载体构建及转化木薯的研究

为了调控木薯块根淀粉含量与组成,以甘薯块根特异表达Sporamin A启动子驱动构建了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶AGPase小亚基(ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit 1,AGPase SU1)、可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase 1,SSS1)、颗粒性淀粉合成酶(granule-bound starch synthase 1,GBSS1)的干涉载体,通过农杆菌介导法转化木薯SC205的胚性愈伤,获得了转化再生株系。酶切鉴定及测序表明,构建的上述3个调控木薯块根淀粉合成的干涉载体构建正确,对获得的转化再生株系用潮霉素筛选及潮霉素抗性基因HPT的引物进行扩增,部分株系有阳性扩增条带,初步说明本研究获得了以调控木薯块根淀粉含量与组成的转基因木薯SC205株系。     

木薯淀粉分支酶基因双价块根特异性反义表达载体的构建

淀粉分支酶(starch branthing enzyme,SBE)是高等植物淀粉生物合成的关键酶之一,包括分支酶I(SBEI)和分支酶II(SBEII)两种类型,调控着支链淀粉的合成.利用DNA重组技术,将这两种分支酶反义基因片段构建在一个植物表达载体中,形成双价反义表达载体p1301-SBEII-Spo-SBEI,其中SBEI反义基因置于CaMV35S启动子之后,SBEI反义基因置于块根特异型启动子.Sporamin之后,两者具有各自的Nos终止子.通过反复冻融法,将双价表达载体转入农杆菌EHA105,并采用PCR技术对所构建的农杆菌工程菌株进行了鉴定分析.     

大豆耐盐基因GmHAL3a的克隆及RNAi载体的构建

利用同源克隆方法从大豆中克隆到一个耐盐基因HAL3,命名为GmHAL3a,组织表达分析发现GmHAL3a基因在大豆根中表达量最高,荚中次之,叶中表达量最低;非生物胁迫实验表明该基因受NaCl、LiCl和山梨醇诱导表达;通过生物信息学的方法分析发现该基因具有2个跨膜螺旋区域,可能定位于叶绿体中;同源序列比对证实该基因氨基酸序列具有与其他物种相似的保守位点:黄素单核苷酸(FMN)结合位点和磷酸泛酰半胱氨酸(PPC)脱羧酶活性位点。同时扩增了这个基因的2个干扰片段,用Gateway技术将扩增的片段通过BP反应连接到入门载体pDONR221,测序后又通过LR反应分别将目的片段插入到RNAi载体pB7GWIWG2(Ⅱ),再转入根癌农杆菌EHA105中。这2个载体的构建对于进一步研究大豆中GmHAL3a基因的功能具有重要意义。     

草莓NCED基因正反义表达载体和RNAi载体的构建

根据草莓（Fragaria ananassa Duch）NCED基因序列（GenBank： HQ399498）,克隆NCED基因开放阅读框,将该片段插入植物表达载体pBI 121的CaMV 35S 启动子和NOS 终止子之间,构建了正义表达载体pBI 121NCED。克隆NCED基因正义、反义片段和作为内含子的gusA基因片段,以植物表达载体pBI 121为基础,以pCAMBIA2301作为中间载体,通过多次酶切和连接,成功构建了草莓NCED基因RNAi表达载体pBI 121NCEDRNAi和反义表达载体pBI 121NCEDF。经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后,成功将pBI 121NCED、pBI 121NCEDF和pBI 121NCEDRNA 3个重组表达质粒导入农杆菌EHA105中。研究结果为进一步研究草莓NCED基因的功能奠定了基础。     

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因RNAi载体的构建

采用PCR技术扩增得到胰蛋白酶抑制剂KTi基因正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GUS基因片段,将其分别连入克隆载体pMD18-T Vector中.然后以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,通过AHLG作为中间载体,根据RNAi原理将组成RNAi 结构的4个目的片段分别连入其中,成功构建了种子特异性RNAi表达载体p1301-KTiRi.研究结果为RNAi技术在大豆品质改良中的应用提供了基础.     

酿酒酵母ADH2基因沉默表达载体的构建

利用重叠延伸PCR获得酿酒酵母基因沉默组件SADH2,经酶切与酿酒酵母穿梭质粒pYES2.0连接,构建酿酒酵母ADH2基因沉默表达载体。经酶切及测序鉴定成功构建了ADH2基因沉默表达载体pSADH2。     

CryIA(c)和gna融合基因植物表达载体的构建

采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR),通过连接多肽FMDV2A序列将CryIA(c)和gna基因相融合,得到CryIA(c)-2A-gna抗虫融合基因。并进一步将玉米UBI启动子和融合基因(CryIA(c)-2A-gna)分别连接到植物表达载体pCAMBIA3300上,构建成由玉米UBI启动子驱动抗虫融合基因的植物表达载体pNUBG。经过限制性酶切分析鉴定,结果表明,含有融合基因的植物表达载体构建成功。     

玉米特异启动子驱动下结核hsp65基因植物表达载体构建及鉴定

以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上;将globulin1-Hsp65联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中;电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中。结果表明：成功构建了pC1300GHsp65质粒,酶切鉴定得到3 Kb和8.6 Kb两条带,测序分析表明,克隆的Hsp65与NCBI上公布序列一致;成功转化到农杆菌中,酶切从农杆菌中所提的质粒条带大小与预期结果相符合。结果显示,已成功构建和转化了pC1300GHsp65质粒,为成功研制利用转基因植物生产抗结核口服疫苗奠定了基础。     

玉米类受体激酶基因Psy2的生物信息学分析及RNAi转基因表达鉴定

根据玉米细菌性褐斑病抗病基因的定位结果预测得到1个编码受体激酶(Receptor-like kinases,RLKs)基因Psy2,采用生物信息学方法对显性基因Psy2和隐性基因psy2编码蛋白的结构、功能和理化性质进行预测和分析。结果表明,psy2的编码氨基酸与Psy2相比共有57个氨基酸差异,包括起始密码子Met提前1位、1个精氨酸的缺失和55个氨基酸替换;两者理化性质差异较小,都被归类为不稳定蛋白;都具有信号肽,属分泌性蛋白;psy2无法形成有效跨膜结构域(Transmembrane domain,TM),但都定位于质膜;Psy2基因的进化与相应的物种进化相一致。推测psy2蛋白的氨基酸残基替换、缺失以及跨膜结构域的改变影响了信号的正常传导。通过基因枪转化法将RNA干扰表达载体导入受体HiⅡA×HiⅡB的幼胚,获得阳性转基因植株,经过q RT-PCR检测显示,Psy2a-RNAi在成株期(开花期)的干扰效果比苗期显著增强。     

木薯MeSWEET10a基因启动子EBE区编辑载体的构建及验证

木薯细菌性枯萎病（cassava bacterial blight, CBB）是由地毯草黄单胞木薯萎蔫致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. Manihotis, Xam）引起的木薯重要病害,影响木薯产量,我国主栽的木薯品种均不抗Xam。Xam分泌的TAL20效应蛋白可结合木薯MeSWEET10a基因启动子的EBE区,激活该基因表达,促进糖类运输至Xam侵染的部位,为病菌的繁殖提供碳水化合物。本研究利用在线软件CRISPR-P v2.0设计EBE区的基因编辑靶点,构建CRISPR/Cas9基因编辑质粒pCAMBIA1301-Cas9-EBE-sgRNA。将重组质粒转化LBA4404根癌农杆菌,利用农杆菌介导法侵染木薯脆性胚性愈伤组织。提取侵染和未侵染的木薯脆性胚性愈伤组织DNA,PCR扩增靶点EBE区及潜在的脱靶位点,并进行Sanger测序分析编辑效果。结果发现EBE区被成功编辑,且没有脱靶现象。本研究有助于进一步获得MeSWEET10a基因启动子EBE区域的木薯突变体,以增强木薯抗细菌性枯萎病的能力。     

青稞幼苗期叶片中 SBEⅡa基因的克隆及其表达分析

为进一步研究淀粉分支酶(Starch branching enzyme,SBE)在青稞叶片淀粉代谢中的作用,以青稞品种喜马拉雅2号和康青1号为材料,通过同源克隆技术分离 SBEⅡa基因,并对分离得到的 SBEⅡa基因进行生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术和淀粉分支酶活性测定试剂盒分析了在高温、低温和盐胁迫条件下 SBEⅡa基因的表达情况和SBEⅡa蛋白酶活性的变化情况。结果表明,从喜马拉雅2号和康青1号克隆得到的 SBEⅡa基因ORF区为2466 bp,编码821个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质分子量为92.09 kDa,预测等电点(pI)为5.4,是酸性蛋白;该蛋白酶的不稳定系数为38.03,属于稳定蛋白;参试材料与大麦的亲缘关系最近,与细江蓠的亲缘关系最远。qRT-PCR和蛋白酶活性测定结果表明, SBEⅡa基因在不同环境下表达水平和SBEⅡa蛋白酶活性变异具有高度的正相关性,在不同环境和不同材料之间没有明显差异。     

中国水仙NtBCH基因的克隆及LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体的构建

参考洋水仙BCH基因设计引物,以中国水仙花瓣cDNA为模板克隆出中国水仙NtBCH基因,全长959 bp,编码303个氨基酸。以中国水仙LCYE和BCH为目的基因,利用pKANNBIAL、pBI121和pCAMBIA1301等载体构建了LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体,为利用基因工程技术改良中国水仙奠定了基础。     

利用RNAi方法构建MS26基因雄性不育植物表达载体及农杆菌介导玉米遗传转化研究

应用RNAi技术创制了花粉彻底败育的玉米雄性不育株系,为玉米杂交制种提供雄性不育的基础材料。构建玉米MS26 RNAi植物表达载体,其中,以玉米综31未成熟的幼胚组织为受体,利用农杆菌介导法将目的基因定向转入到玉米中,以甘露糖为选择剂进行筛选获得能够稳定遗传的转基因植株。通过Taqman探针法进行分子检测,获得18株单拷贝T0代转基因植株,碘-碘化钾染色分析结果显示,12株完全不育。在田间试验中,5个转化事件的所有T1代转基因植株在散粉期都表现雄性不育,且除此之外与野生型玉米对照植株之间没有其他形态不同。实时定量PCR结果显示,MS26 RNAi转基因玉米植株中MS26基因的表达量显著下调,由此可推断,MS26 RNAiT-DNA已经整合到玉米基因组中,并能引起完全的雄性不育。     

植物防御素D1基因种子特异表达载体构建及在玉米中的转化

以绿豆基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增了绿豆防御素D1基因序列,与GenBank中绿豆防御素基因的相应片段有99.08%同源性,克隆片段长为355bp。将种子特异启动子sbeIIb和D1基因插入到带有耐盐基因的表达载体pCAMBIA1301-BADH中,构建了无抗生素选择标记的种子特异表达载体pSBEIIb-D-B,该载体是利用耐盐基因BADH替代抗生素基因作为筛选标记,消除了对环境及肠道微生物的潜在威胁。将该载体利用超声波辅助农杆菌介导法转化了2个玉米自交系丹598、988的愈伤组织,经分化诱导出苗后进行PCR检测,证明得到转基因阳性植株,相对转化率最高达到7.8%。     

番茄XRN2基因的克隆、表达分析及遗传转化

为了研究番茄XRN2基因的功能,利用RT-PCR技术从番茄各组织混合cDNA中扩增了番茄XRN2基因全长编码序列,并对其进行了表达模式分析。结果表明该基因在番茄根部表达最强烈。通过对番茄叶片进行伤害诱导处理,发现番茄XRN2基因表达呈上升趋势。将该基因在组成型启动子CaMV35S驱动下定向构建至植物表达载体pCambia1301-35S,重组载体命名为pCambia1301-35S-XRN2和pCambia1301-35S-AsXRN2。通过农杆菌介导法转化获得转基因番茄,为进一步阐明XRN2基因在番茄中的功能奠定了基础。     

中国水仙NtMYB1基因的克隆及表达分析

为研究调控花青素合成机制,利用RT-PCR和RACE技术从中国水仙‘金盏银台’（Narcissus tazetta var. chinensis‘Jinzhan Yintai’.）的花瓣和副冠中克隆得到一个MYB基因的cDNA序列,命名为NtMYB1,在GeneBank上登录号为KC763973。序列分析表明,NtMYB1基因全长842 bp,其中开放阅读框长681 bp,编码226个氨基酸,推测的蛋白分子量为25.2 ku,理论等电点为7.94。NtMYB1具有明显的R2R3-MYB结构域,且在R3结构域的下游含有一个相对保守的PDLNLDLSIG氨基酸基序。同源性分析表明,其编码的氨基酸序列与陆地棉、甜樱桃的MYB蛋白相似性分别达到65％和63％。利用实时荧光定量PCR技术检测NtMYB1基因在中国水仙花不同发育时期和部位的表达水平,分析结果表明,NMYB1基因在中国水仙成花不同时期均有表达,但表达量具有明显差异,其中NtMYB1基因在花蕾期的相对表达量约为花苞期的40倍,且其表达量在花瓣要高于副冠。推测NtMYB1可能参与调控花青素合成基因的转录沉默。     

高粱花叶病毒Hcpro、CP和PIPO基因酵母双杂交载体构建及自激活验证

采用同源克隆技术获得侵染甘蔗高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段.将该基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKTT-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKTT-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定,证明重组诱饵载体构建成功后,将重组质粒导入Y2H Gold酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.结果表明,含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性.含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His营养缺陷平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对ADE2、HIS3报告基因无自激活作用.研究结果为下一步利用酵母双杂交系统检测与高粱花叶病毒Hcpro、CP、PIPO蛋白相互作用的甘蔗蛋白提供基础.     

农杆菌介导的花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2 RNAi抑制表达遗传转化研究

以成熟花生种子萌动4d的上胚轴为受体材料,采用农杆菌介导的转化方法,将倒位重复Δ12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2片段分别与CaMV35S启动子和种子特异性表达的大豆凝集素启动子相连导入花生.经PCR检测证实含有AhFAD2倒位重复基因片段的RNAi抑制表达框架已成功转入花生.