小麦TaUCHs基因的克隆和特性分析

为研究小麦的耐盐机理,在以前的工作中,本课题组采用cDNA-AFLP技术获得一个219 bp的泛素羧基末端水解酶的片段,本研究以该片段为基础,通过电子延伸、RACE和RT-PCR,得到了两个全长cDNA克隆,分别命名为TaUCH1和TaUCH2,这两条序列在编码区只有一个氨基酸的差异。保守结构域预测显示,TaUCH1和TaUCH2的中部和C末端各有一个C19肽酶结构域。将TaUCHs及其在植物中的同源蛋白进行对比发现,TaUCHs与水稻中的同类蛋白相似性最高,有88%的同源性。Southern杂交显示,TaUCHs在小麦中以多拷贝或基因家族形式存在。以上结果说明TaUCHs是小麦中的羧基末端水解酶基因,可能参与了植物胁迫反应中某些受损伤蛋白或重要调控蛋白的降解。     

小麦TaLEA4基因的克隆和表达

为探讨小麦胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)在水分胁迫过程中的生物学功能,以PEG6000(20%)处理6.0 h的洛旱2号幼苗为材料,利用RT-PCR方法克隆了小麦的TaLEA4基因,并分析了该基因在水分胁迫过程中的表达特征.序列分析显示,TaLEA4基因编码的蛋白具有2个典型的LEA4保守域.半定量RT-PCR分析表明,在小麦幼苗根系中,随着PEG6000介导的水分胁迫时间的推移,该基因的表达量逐渐上升,24 h达到最强,48 h又迅速回落;而在小麦幼苗的叶片中,该基因在水分胁迫0.5 h的表达量较强,其他时间点的表达水平都较低.可见,TaLEA4基因与小麦水分胁迫反应密切相关,该基因在根系和叶片中的不同表达特性预示着该基因在根系和叶片的水分胁迫反应中发挥着不同的生物学功能.     

小麦CO-like基因TaCO9的克隆及分析

CO蛋白(CONSTANS)是光周期途径中重要的调控因子,为了从普通小麦中进一步挖掘COlike基因,利用同源克隆的方法得到与大麦HvCO9基因同源的小麦TaCO9基因。结果表明,在冬性品种西农889中,初步克隆得到TaCO9基因的三个同源序列,分别命名为TaCO9-1、TaCO9-2、TaCO9-3。其cDNA序列全长均为870bp,开放阅读框为1 977bp,编码289个氨基酸,含有CO-like蛋白家族典型的CCT结构域,但不含B-box结构域;而在春性品种中发现TaCO9-1序列的第二外显子区域有6个碱基的插入,利用中国春缺-四体材料将该序列定位于小麦的1A染色体,命名为TaCO9-1A。系统发育分析表明,TaCO9蛋白与水稻Ghd7及大麦HvCO9位于同一分支。空间结构分析表明,其CCT结构域的NF-YA2区域较为保守,而该区域与CCAAT box互作相关。本研究克隆得到的TaCO9基因可能是小麦CO-like基因家族的新成员,与大麦HvCO9基因的结构相似,可作为新的小麦光周期候选基因加以研究利用。     

小麦SGT1基因的克隆与表达特性分析

为了研究SGT1基因在不同小麦抗病反应中的表达特性,采用RT-PCR和RACE方法,从小麦cDNA中分离出包含SGT1基因全长cDNA序列.该基因编码具有377个氨基酸的蛋白,具有已知SGT1蛋白典型的5个功能域,即TPR区、VR1区、CS区、VR2区和SGS区.小麦SGT1蛋白与大麦SGT1蛋白的氨基酸序列具有97%的相似性.Southern杂交结果显示,SGT1基因在小麦基因组中有3个拷贝.分析结果表明,大麦黄矮病毒、白粉病菌、纹枯病菌和赤霉病菌侵染小麦均可诱导小麦SGT1基因转录水平上调,说明SGT1可能参与了小麦不同抗病反应.     

小麦耐冷相关基因TaCTR的克隆及其表达特性分析

低温冷害是小麦生长发育过程中面临的重要非生物逆境因素。为了挖掘小麦耐冷功能基因,本研究采用同源克隆的方法从普通小麦品种小偃22中分离到一个耐冷相关基因TaCTR,该基因序列全长2 192 bp,含有12个外显子、11个内含子,编码区全长为1 407 bp,编码468个氨基酸,分子量约为53.43 kDa;系统进化树分析表明,该基因在进化关系上与山羊草最近;亚细胞定位结果显示,该基因编码的蛋白为膜蛋白;实时荧光定量PCR（RT-PCR）结果表明,TaCTR在不同品种、不同组织和不同发育阶段低温特异表达;在干旱、高盐及GA处理下,TaCTR的表达量显著上升,说明该基因可能参与调控小麦的抗逆反应。     

小麦TaPP2C59基因的克隆及表达分析

2C型蛋白磷酸酶(PP2C)是ABA信号途径的关键组分,在ABA信号转导及植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。为给TaPP2C59基因功能的研究奠定基础,同时为小麦对非生物胁迫应答的信号转导机理研究提供参考,本研究从小麦中克隆了第一个PP2C基因TaPP2C59,并对其在逆境胁迫以及多种信号分子处理下的表达模式进行研究。序列分析表明,该基因开放阅读框(ORF)为855bp,编码284个氨基酸。进化树分析表明,该基因编码的蛋白与水稻OsPP2C45蛋白和拟南芥AtPP2C59蛋白的亲缘关系最近。多序列比对分析表明,TaPP2C59具有PP2C家族蛋白的保守结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,该基因的表达显著受ABA、低温和高盐胁迫抑制。因此,可以推测TaPP2C59可能作为负调控因子参与ABA信号及非生物逆境胁迫应答。     

小麦ramosa3基因cDNA的克隆及其编码序列分析

为进一步研究小麦花序形态建成,依据Genbank中已公布的玉米等禾本科植物中 ramosa3 基因的保守区和小麦 EST序列设计特异性引物,利用 RT-PCR 从普通小麦中国春幼穗总RNA 中克隆得一长度为657 bp的cDNA片段,该片段编码 219 个氨基酸.蛋白序列比对表明,该编码序列与禾本科植物 ramosa3有较高的同源性,可推测此基因是小麦的 ramosa3基因.蛋白质结构预测表明,小麦 ramosa3具有6-磷酸海藻糖酶的结构特征,属于TPP酶家族成员.     

小麦ramosa2基因的克隆与序列分析

为了研究ramosa2基因在小麦中的功能,以普通小麦(Triticum aestivum L)中国春基因组为模板,玉米、高梁、水稻和大麦中ramosa2基因保守序列为参考设计引物,扩增到1条全长为771 bp的目的片段.序列分析表明,该核酸序列与高梁、玉米、水稻和大麦中ramosa2基因的同源性高达82.9%～95.2%;其预测编码的氨基酸序列与高粱、玉米、水稻和大麦ramosa2基因的氨基酸序列同源性达79.2%～95%.     

小麦铁结合蛋白基因的同源克隆

为了寻找一种简捷的克隆同源基因的途径,以小麦铁蛋白基因的同源克隆为例,利用玉米的铁结合蛋白基因序列比对小麦的EST库,在网上进行电子延伸后以起始密码子为起点,终止密码子为终点设计特异性强的引物进行基因克隆,经过引物O1和Fcds扩增片段的测序及Blast比对,证实本试验已成功地从小麦的基因组和cDNA中克隆出铁结合蛋白基因。最后对基于同源序列克隆基因的策略及引物设计技巧进行了探讨。     

小麦脱水素基因WDHN1-2的克隆及其表达分析

为进一步明确小麦脱水素基因WDHN1-2在逆境条件下的功能,以伞穗山羊草DHN1基因为探针,通过电子克隆及RT-PCR技术获得WDHN1-2基因后对其序列特征进行分析,同时利用基因表达综合数据库及半定量RT-PCR技术对该基因的表达模式进行解析。结果表明,WDHN1-2基因编码区(CDS)长为548bp,编码的氨基酸具有脱水素保守序列K、Y和S片段,与山羊草脱水素EMT25371亲缘关系最近。WDHN1-2蛋白属于稳定且高度亲水蛋白,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主;该蛋白在亚细胞中定位的可能性:过氧化物酶体细胞核线粒体基质,可能行使转录调控的功能。表达模式分析发现,WDHN1-2基因在小麦开花后22d的胚乳中表达量最高,在ABA、PEG、NaCl及4℃低温胁迫下表达量均先上升后下降。     

四倍体小麦Langdon HMT1基因的克隆及原核表达

硒是人类不可缺少的重要微量元素之一,人类必须补充足够的硒才能保证身体健康。同型半胱氨酸甲基转移酶(homocysteine-S-methyltransferase,HMT)基因与植物富硒关键酶硒代半胱氨酸甲基转移酶(selenocysteine methyltransferase,SMT)基因同源。为了发掘并利用麦类作物中的富硒关键酶基因,基于NCBI已公布的节节麦(Aegilops tauschii Coss.)同型半胱氨酸甲基转移酶1基因(AetHMT1)的序列设计HMT1基因的特异性引物H1-F/H1-R,克隆四倍体小麦Langdon HMT1的开放阅读框(open reading frame,ORF)后进行序列分析,并通过原核表达验证该基因。结果表明,利用H1-F/H1-R从四倍体小麦Langdon(LDN)克隆出两条长度均为975bp的序列,分别命名为LDNHMT1-1和LDNHMT1-2。LDNHMT1-1、LDNHMT1-2与AetHMT1基因一样,均编码342个氨基酸,分子量大小分别为35.19kDa和35.18kDa。通过氨基酸序列比对和进化树分析发现,LDNHMT1-1、LDNHMT1-2与其他HMT、SMT有较高的相似性。构建原核表达载体,并通过SDS-PAGE鉴定,成功获得LDNHMT1-1、LDNHMT1-2的原核表达菌株,且原核表达的蛋白质与预测分子量大小一致。     

六倍体小麦基因克隆方法研究进展

小麦基因组庞大,重复序列多,重要功能基因的克隆存在很大困难.目前,小麦基因的克隆方法主要有同源克隆、图位克隆、差减杂交、差异显示等.利用各种方法已经克隆出许多小麦基因,并对部分基因进行了功能研究.本文综述了目前常用的小麦基因克隆方法,比较了各种方法的优缺点和应用特点,并举出了利用这些方法得到的重要基因,希望能为从事小麦基因克隆的工作者提供参考信息.     

小麦AQPs蛋白TaPIP1基因cDNA克隆及其表达分析

为探索小麦水通道蛋白在氮素处理过程中的生物学功能,以0.1%尿素处理6.0 h的周麦19幼根为材料,利用RTPCR方法克隆了小麦PIPs类型的水通道蛋白基因TaPIP1,并分析了该基因的组织表达特性及其在尿素处理过程中的表达特征。TaPIP1全长1 062 bp,包括61 bp的5′非翻译区,128 bp的 3′非翻译区和一个长度为873 bp、编码290个氨基酸的开放阅读框。序列分析表明,TaPIP1基因与已知小麦（GQ452384和AAM00368）、大麦（BAA23746,CAA54233和BAA23745）、水稻（BAA24016）和玉米（AAK26754 ,ACG39699,ACG37183,CAA57955和AAK26756）等单子叶植物来源的同类基因同源性较高,相似性为85.9%～99.3%。半定量RTPCR表达谱分析显示,TaPIP1在抽穗期小麦的根、茎和旗叶中均能表达。氮素处理下该基因表达分析结果显示,TaPIP1在萌发期小麦根系中的表达受尿素的诱导。     

小麦TaGeBPL基因的克隆及表达分析

无表皮毛增强子结合蛋白GeBP(GLABROUS1 enhancer-binding protein)是植物体内特有的一类转录因子,可调控植物表皮毛的生长过程,在植物生长发育、衰老、抗逆、防御反应进程中发挥着重要作用。前期对自发斑点细胞坏死RILs(N13039H/N)进行转录组学比较,发现一个未知功能基因在两个材料中表达差异显著。为深入了解小麦中该基因的序列特征和表达特性,通过RT-PCR方法克隆获得了CDS区域片段。生物信息学分析结果表明,该基因位于3D染色体上,CDS编码区长度为1 527 bp,共编码508个氨基酸,含有1个DUF573结构域和3个核定位信号。InterPro比对表明,编码蛋白属于GeBP家族,故将该基因命名为TaGeBPL。亚细胞定位结果表明,TaGeBPL定位于细胞核。白粉病菌(Blumeria graminis f. sp.tritici,Bgt)侵染条件下的定量qRT-PCR结果表明,TaGeBPL基因在感白粉病近等基因系N9134S中的表达模式呈双峰曲线变化,侵染12和36 h时,基因表达显著上调,而在抗白粉病近等基因系N9134R中的表达呈单峰曲线变化,在侵染12 h时显著下调。TaGeBPL在N9134S中的相对表达量始终高于在N9134R中的表达量,由此推测TaGeBPL基因可能参与病原菌响应的相关途径。酵母转录激活试验表明,TaGeBPL转录因子没有转录自激活活性。本研究结果为深入解析GeBP的功能奠定了基础。     

花生多胺氧化酶基因的克隆与鉴定

多胺作为一类新型植物生理活性物质,对植物生长发育起着重要作用,在细胞工程与农业生产中具有广阔的应用价值。多胺氧化酶(Polyamine oxidase,PAO)是催化多胺降解的关键酶之一,对调控植物细胞中多胺浓度非常重要,影响植物的生长发育、形态建成过程。根据国际DNA数据库中已报道的PAO蛋白的保守结构域,设计简并引物(degenerate pri mer),通过RT-PCR方法首次从花生(仲恺花1号)中克隆PAO基因cDNA序列,并利用BLASTn、BLASTp及多重序列排比(Multiple Sequence Alignment)等生物信息学方法对所克隆的cDNA进行序列分析与鉴定,初步确定已从花生中克隆到PAO基因的同系物(homolog)。根据克隆的花生PAOcDNA序列(AhPAO1)设计特异引物,通过半定量RT-PCR方法检测花生胚根、胚芽和幼叶中AhPAO1基因的表达,结果发现胚根中AhPAO1基因表达最强,胚芽和幼叶中的表达无明显差异。本研究为进一步了解花生种子萌发和幼苗生长发育过程中多胺氧化酶基因表达的时空特异性奠定实验基础,并对进一步利用植物基因工程技术综合调控花生体内多胺水平有重要实践意义。     

TaMBD2基因cDNA全长克隆及其在小麦叶片和种子中的表达

为探讨甲基结合蛋白(MBD)在小麦生长发育过程中的生物学功能,通过RACE技术克隆了小麦TaMBD2基因的cDNA全长,并分析了该基因在小麦叶片、种子发育及萌发过程中的表达特性。RACE克隆及序列分析表明,TaMBD2基因cDNA全长为1 511 bp,其中5 UTR 164 bp,3 UTR 405 bp,ORF 942 bp。对该基因编码氨基酸序列的分析发现,TaMBD2编码蛋白中包含有1个典型的甲基结合域和1个CW型锌指结构域;通过RT-PCR分析发现,TaMBD2基因在叶片中的表达随着小麦的生长发育而逐渐增强;在种子发育过程中,该基因在花后20和30 d时的表达量最高;在种子萌发过程的胚和胚乳中,该基因的表达水平变化不大。     

普通小麦粒重相关基因克隆的研究进展

随着分子生物学特别是生物信息学和基因组学的发展,小麦粒重相关基因的克隆也取得了很大进展。本文主要介绍了与小麦粒重有关的TaGS5、TaGASR7、TaSus、TaWSC、Ta-6-SFT、TaGW2、TaCKX、TaTGW6、TaCWI、TaGS1基因以及TEF、SAP等家族基因TaTEF、TaSAP、TaSnRK2s的克隆及其功能研究的进展,以期为小麦高产育种提供参考。     

杂种小麦与常规小麦产量性状改良的比较分析

从1991－2000年，把每年参加产量鉴定的杂种小麦和常规小麦新品种的试验结果进行比较分析，结果表明：杂种小麦产量的平均超标优势为8．4％，变幅为3．0％－14．0％，年平均递增率为2．4％，而常规小麦的平均超标率为3．0％，变幅为1．1％－5．1％，年平均递增率仅为0．75％，就产量构成因素来看，杂种小麦的千粒重在不同年份均比常规品种的高，粒重优势显著，杂种小麦的穗粒数高于常规小麦，差异达显著水平，在群体条件下，杂种小麦的有效穗与常规小麦的变化基本一致；杂种小麦的株高改良已达到半矮秆水平，抗倒伏能力大大加强。