猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析

[目的]在基因工程菌中实现猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7基因的高效表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其免疫学活性及应用价值。[方法]将已构建好的重组表达载体pET-ORF7转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG在最适条件下诱导表达,其表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行检测。应用Ni-NTAHis.Bind Resin层析柱在变性条件下纯化表达产物,通过梯度透析进行复性。采用Western Blot及间接ELISA法检测复性后重组蛋白的免疫学活性。[结果]重组质粒pET-ORF7在大肠杆菌中以融合形式成功表达,融合表达产物主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE检测所表达的重组蛋白分子量为33 kD左右,与预期大小相符。Band-scan软件对表达蛋白分析发现,表达产物约占菌体蛋白的50%。Western Blot及间接ELISA法显示复性后的重组蛋白与PRRSV阳性血清有特异性结合反应,表明其具有良好的免疫学活性。[结论]该试验将为进一步研制PRRSV单克隆抗体及诊断试剂盒奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因变异分析

采用RT—PCR方法对疑似PRRS阳性病料进行克隆和测序获得了0RF7基因片段。序列分析结果表明获得的0RF7基因序列不存在缺失现象。与美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列的同源性为91．3％,氨基酸同源性为92．6％;与我国最早的PRRSV分离株CH—la相比,核苷酸同源性为93．5％,氨基酸同源性为92．6％;与我国高致病性PRRSV毒株SD—ZQ的核苷酸同源性最高为98．1％,氨基酸只有两个不同,同源性为98．3％;与本省的Hn-1／06毒株的核苷酸同源性为97．3％,氨基酸同源性为97．5％;与2004年分离的FJ-2株与ORF7基因的核苷酸差异稍大为85．4％,氨基酸同源性为88．6％;与欧洲型分离株LV株和N-34株0RF7基因的核苷酸差异很大,同源性仅为41．1％和40％,氨基酸同源性为47．1％和47．6％。表明所获得序列的流行毒株属于美洲型,但其毒力已发生了变异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NX-1株ORF5,ORF7基因的克隆

为了从分子水平了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5和ORF7基因的特征,并为PRRSV的遗传进化和分子变异研究提供资料。对宁夏地区流行的PRRSV进行采样分析,运用RT-PCR技术分别扩增了PRRSV NX-1/2008毒株囊膜蛋白基因ORF5与衣壳蛋白基因ORF7,并对其进行了克隆,随后利用DNAS-TAR生物软件进行了同源性比对和进化分析。结果显示,PRRSV NX-1/2008毒株的ORF5,ORF7基因均与JXa-1/2007等高致病性毒株高度同源,ORF7的氨基酸同源性则达到了100%。与空间距离较远的JXa-1/2007毒株相比,NX-1株的ORF5基因在中和抗体决定区196位上发生突变,而与相距较近的HUB-1/2006,CH-1 a/2001等毒株相比较,则无此突变;与CH-1 a/2001毒株相比,GP5蛋白的免疫原性核心位点B 39位的F→I,在诱导中和抗体起重要作用的33位糖基化位点N→S,同时,诱骗位点A(30~38氨基酸)的32,33和35位氨基酸都发生了突变。NX-1株的ORF7基因与国内CH-1 a/2001等低致病性毒株间的突变有69%位于抗原决定区,而其中有56%是高致病性毒株的主动突变。研究表明,分离的PRRSV高致病性毒株与低致病性毒株的抗原性在基因组上有较大范围的变异,且这种变异可能还主要位于免疫决定区。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株ORF7基因序列分析

采用RT-PCR方法对疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得2个ORF7基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性比较分析。序列分析结果显示,2个ORF7基因之间核苷酸和氨基酸同源性分别为99.7%和98.4%,其与欧洲型代表毒株LV、美洲型代表毒株VR-2332、高致病性PRRSV变异株(JXA1、HUN4、HEB1、HUB1)及我国早期分离毒株CH-1a的核苷酸同源性分别为65.9%、93.0%～93.3%、97.6%～98.1%、94.6%～94.9%,氨基酸同源性分别为58.1%、93.5%～94.4%、95.2%～96.0%、91.9%～92.7%。遗传进化树分析结果表明,分离的2个ORF7基因与美洲型代表毒株VR-2332亲缘关系较近,属于美洲型,与CH-1a、HB-2(sh)、我国2006年以后分离的10株(JXA1、SD-09、HUB1、HEB1、HUN4、Henan-A14、GD、GDQY2、GZgy15-1、GD-2011)组成同一个亚群。     

北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因克隆与遗传演化分析

【目的】研究2014年新疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）遗传变异情况,监测PRRSV在新疆流行情况,为新疆的PRRSV血清学检测提供帮助。【方法】采用RT－PCR方法对分离自新疆地区的PRRS疑似病料进行ORF7基因扩增和测序,分析PRRSV ORF7基因变异情况。【结果】检测到18株PRRSV毒株具有ORF7碱基突变,均属北美洲型,与国外的参考毒株和国内的参考毒株有着不同的亲缘关系。其中,XJzx4、XJzx12与国外的参考毒株01NP1.2、PA8、VR－2332、LMY亲缘关系较近。除XJzx1、XJzx14外,其余毒株与内地毒株BJsy06、GD、HB－1 sh2002、HuN、JXA1、LN、NX06、SX2009亲缘关系较近,推断由内地毒株演化而来。【结论】新疆本地流行猪繁殖与呼吸综合征毒株是来自国内外不同地区毒株,ORF7基因在新疆具有不同的遗传变异类型。没有检测到新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因有缺失型突变。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白基因的克隆及表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增出PRRSV甘肃株的核衣壳蛋白(N)基因,将N基因克隆至pGEM-T easy载体上,获得含N基因的阳性重组质粒pGEM-T easy-N.对质粒中的插入片段进行测序,应用DNAStar分析所测序列与GenBank中已登录的PRRSV毒株的同源性,再将其亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达载体pGEX-4T-1-N,转化E.coliBL21(DE3)细胞,用SDS-PAGE检测表达产物,并对其进行纯化.结果表明:PRRSV甘肃株N基因核甘酸序列与PRRSV-VR2332株的同源性为93.3%,与欧洲LV株的同源性为66.1%;构建的重组表达载体在大肠杆菌中获得了成功表达,表达产物为40ku的可溶性融合蛋白.     

猪繁殖与呼吸综合征流行株ORF5基因遗传变异分析

[目的]分析猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）发病原因、流行趋势,为预防和控制PRRSV提供理论依据。[方法]根据GenBank上的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCCVR-2332的全基因序列,设计并合成引物,采用RT—PCR技术扩增了7株流行株（HIJ10,HL148,HLJ64,HLJ76,HL177,HLJ85,HLJ87）中的ORF5基因序列。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCCVR-2332、CH-1a、BJ-4、LV及疫苗株MLV进行序列比较。同时用系统进化树分析了分离株之间的亲缘关系。[结果]核苷酸序列分析表明这7株流行株中ORF5基因与VR-2332、CH—1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88．1％～98．8％,89．9％～95．2％,85．6％～98．7％;与LV的同源性为54．7％～56．9％。氨基酸序列分析表明这7株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ4等代表株的同源性分别为88．1％～96．8％,88．1％～94．5％,86．1％～96．5％;与LV的同源性为54．7％～56．2％。通过系统发育进化树分析可知HLJ48、HL164、HLU6、HLJ77、HLJ85与CH-1株亲缘关系密切,同属一亚群,表明所获得的毒株与参考株CH．1亲缘关系较近,可能由CH-1演化而来。HLJ10、HU87与疫苗株MLV关系较近,而且HLJ10、HLJ87的同源性高达100％,可能由于使用疫苗而感染,说明黑龙江省存在疫苗毒的隐性感染。[结论]流行株在ORF,基因区域的变异较大,同一地域分离株间ORF,基因序列同源性较高且亲缘关系较近,不同地域则较远。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2株ORF7基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]对猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2毒株核蛋白编码基因ORF7进行研究,为进一步了解其编码蛋白的功能和研制新的血清学诊断方法奠定基础。[方法]采用RT—PCR方法扩增HBKM2株的DR胛基因,然后利用DNAStar软件包对克隆的序列进行序列分析,将ORF7基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX—KG上,构建重组表达质粒pKG—N。将重组质粒转化到大肠杆菌B121。并经IPTG诱导表达,最后利用Western-blot对表达蛋白的免疫反应活性进行鉴定。[结果]HBKM2毒株的0R刀基因长约372bp;序列分析表明与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的同源性达99％以上;SDS—PAGE表明克隆的0R几基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达：Western-blot分析表明,重组蛋白GST—N能够与PRRSV高免猪血清发生特异性的免疫反应。[结论]成功地扩增了ORF7基因。且GST-N融合蛋白能在大肠杆菌中高效表达。     

河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒主要结构蛋白基因变异分析

    为了给河北地区预防和控制猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)提供理论数据,根据GenBank公布的多株PRRSV全基因序列,设计并合成3对特异性引物,应用RT-PCR方法分别扩增HB-3(cz )株、HB-4(hs)株的ORF5、ORF6、ORF7基因片段.分别将片段克隆入pGM-T载体后进行测序,并结合其他河北毒株与多株GenBank中PRRSV毒株ORF5～7基因序列进行比较.结果表明,河北省2007年以来发现的9个毒株序列同源性很强,与近年国内流行的毒株群相似性很高,达98.8%～99.5%,均属于美洲型;其主要结构蛋白E、M、N蛋白抗原表位区域极其类似;与前些年国内主要流行毒株群相似性较低,为91.9%～92.6%;遗传进化树分析表明国内美洲型分离株明显地分为2个亚群,河北省流行的毒株亲缘关系较近,在同一亚群内.     

广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因遗传变异分析

【目的】监测2021年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)的分子流行动态,为PRRSV综合防控措施的制定提供参考。【方法】在广东省内不同地区PRRSV检测为阳性的37个规模猪场采集521份患病猪组织样本进行PRRSV检测。对样本进行ORF5基因测序,采用DNAStar分析ORF5核苷酸的同源性及其推导氨基酸的同源性,并用Mega7.0构建基于ORF5基因的系统遗传进化树。【结果】从37个猪场采集的样品PRRSV阳性率为24.4%,猪场阳性率为45.9%。通过测序分析获得17株来自不同猪场的PRRSV ORF5基因序列,遗传进化分析表明所有毒株均属于北美毒株（PRRSV 2）,其中有5株属于Lineage 8(JXA1-like和CH-1a-like）谱系,9株属于Lineage 1(NADC30-like和NADC34-like）谱系,3株属于Lineage 3(QYYZ-like)谱系,没有监测到Lineage 5(VR2332-like)谱系的毒株。17株PRRSV毒株的...     

猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析

[目的]对猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）的GPS蛋白进行纯化与免疫活性分析,为建立相应的血清学诊断方法奠定基础。[方法]用构建好的重组表达质粒pGEX-6P-5转化B121后经IPTG诱导表达。对表达产物进行可溶性分析,再将重组目的蛋白纯化后进行SDS—PAGE鉴定和Western—blot分析,最后用重组抗原进行豚鼠免疫试验。[结果]经层析扫描分析目的蛋白含量占菌体蛋白总量30％左右,纯化后目的蛋白纯度可迭80％。经Western—blot及豚鼠免疫试验对纯化蛋白进行分析后证明,表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。[结论]该研究为深入研究PRRSVORFs基因及其编码蛋白功能提供了材料,同时也为生产猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程产品奠定了良好基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因并在原核表达系统中表达。[方法]根据GenBank上登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸序列设计1对引物,用RT—PCR方法扩增出PRRSV的核衣壳蛋白（N）基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T．1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-N。将重组质粒转化大肠杆菌BL31（DE3）感受态细胞,经TPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测。[结果]PRRSV肺组织所提取的RNA,经RT—PCR扩增,得到一段392bp的片段,与预期结果一致。SDS—PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约39．866Da,与预期结果相同。重组菌体超声裂解后,经10％的SDS—PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为可溶性蛋白。     

猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析

1材料与方法1．1表达菌及试剂猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）6P-1-GP5表达质粒由该实验室保存。Novagen蛋白纯化试剂盒、硝酸纤维素膜（NC膜）均购自华美公司;弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司;辣根酶标记兔抗猪IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;其他常规试剂均由国内生产。试验用豚鼠由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物厂提供,体重400-500g,共8只。     

猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析(英文)

[Objective] The purification and immunocompetence of GPS protein in porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) were analyzed in this study, which provided basis for establishing the corresponding serological method. [Method] The recombinant expression plasmid pGEX-6P-5 was transformed into BL21 and expressed after being induced with IPTG. The solubility analysis of expression products was carried out, and then the recombinant protein was purified for SDS-PAGE identification and Western-blot analysis. Finally, the recombinant antigen was used in the immune experiment of guinea pigs. [Result] The target protein content accounted for 30% of the total cells protein content according to the chromatography scanning, and the purity of target protein after purification reached 80%. The purified protein was analyzed by Western-blot and immune experiment of guinea pigs, and the results showed that the expressed protein had good reactionogenicity and immunogenicity. [Conclusion] This study provides materials for further studies on the function between PRRSV ORF5 gene and its editing protein, which also lays a foundation for porcine reproductive and respiratory syndrome virus genetic engineering products.     

猪繁殖与呼吸综合症流行株ORF_5基因遗传变异分析

[目的]分析猪繁殖与呼吸综合症发病原因,流行趋势,为预防和控制猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）提供理论依据。[方法]根据GenBank上的PRRSV的ATCCVR-2332的全基因序列,设计并合成引物,采用RT-PCR技术扩增了7株流行株中的ORF5基因序列。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCCVR-2332、CH-1a、BJ-4、LV及疫苗株MLV进行序列比较。同时用系统进化树分析了分离株之间的系统进化树。[结果]核苷酸序列分析表明这7株流行株中ORF5基因与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88.1%～98.8%,89.9%～95.2%,85.6%～98.7%;与LV的同源性为54.7%～56.9%。氨基酸序列分析表明,这7株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88.1%～96.8%,88.1%～94.5%,86.1%～96.5%;与LV的同源性为54.7%～56.2%。[结论]流行株在ORF5基因区域的变异较大,同一地域分离株间ORF5基因序列同源性较高且亲缘关系较近,不同地域则较远。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析

以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）YA株为材料，采用RT－PCR扩增其ORF5基因全长cDNA并进行序列测定和比较分析。结果YA株ORF5基因cDNA编码区长603bp，可编码200个氨基酸残基。与欧洲型代表株LV株、美洲型代表株VR－2332株在氨基酸水平上的同尖性分别为58％和90％，与国内首株分离株(CH－1a)的同源性高达95％，推测YA株属于美洲型。根据YA株ORF5基因编码的氨基酸序列，与具有代表性的12株美洲型毒株和2株欧洲型毒株绘制进化系统树，结果也显示YA株与美洲型分离毒株的遗传关系较近，而与欧洲毒株的遗传关系较远。进一步采用序列分析软件对推导的氨基酸进行比较分析，发现YA株ORF5编码的E蛋白存在5个潜在的N－糖基化位点，6个抗原位点，其糖基化位点的数目及抗原位点的分布与其它美洲毒株均存在一定程度的差异，但3个最主要的抗原表位相对保守。