人基质蛋白酶2(MMP-2)类血红素结构域原核表达优化

用构建的人基质蛋白酶-2（MMP-2）类血红素结构域原核表达载体PET25b—PEX转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选阳性菌落LB液体培养基培养，异丙基-β—D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达产生的表达蛋白，大小约29kD，与预期大小相符。设置不同的IPTG诱导终浓度，诱导时间，诱导时菌液OD值和LB液体培养基的pH值，SDS-PAGE电泳和软件分析发现，当IPTG浓度为0．7mmol／L，诱导4h，诱导时菌液OD值为0．7时，实验能获得最高的PEX蛋白表达；5L大规模培养时，LB培养基pH值为7．5时，可获得较高的重组PEX蛋白表达。     

人基质金属蛋白酶2(MMP-2)类血红素结构域克隆及原核表达

提取人神经胶质瘤U87细胞总RNA,通过RT-PCR克隆到人基质金属蛋白酶2（MMP-2）类血红素结构域pex的cDNA序列-PEX,连接pMD18-T载体和PEX,测序分析,构建原核表达载体PET42a-PEX,转化大肠杆菌BL21（DE3）,异丙基-βD-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后显示目的蛋白有37%的表达量,为进一步研究其抗肿瘤血管生成鉴定基础。     

加味参附姜苓汤对围月经期咳嗽变异性哮喘患者血清MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达的影响

目的 研究加味参附姜苓汤对围月经期咳嗽变异性哮喘患者血清金属基质蛋白酶-2（MMP-2）、金属基质蛋白酶-9（MMP-9）及金属基质蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）表达的影响,探讨其治疗围月经期咳嗽变异性哮喘的作用机制。方法 将围月经期咳嗽变异性哮喘患者80例,随机分为治疗组和对照组各40例。治疗组服用加味参附姜苓汤治疗,对照组口服氨茶碱缓释片联合酮体芬片治疗,疗程3个月。观察两组疗效及治疗前后血清MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达变化。结果 治疗组总有效率为90.0%,对照组为72.5%,治疗组疗效优于对照组（P<0.05）。治疗后两组血清MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达水平显著降低（P<0.05,P<0.01）,且治疗组降低较对照组显著（P<0.05,P<0.01）。结论 加味参附姜苓汤对围月经期咳嗽变异性哮喘具有较好的疗效,其可能通过下调患者血清MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达而发挥治疗作用。     

基质金属蛋白酶-2在胃癌中的表达及其对癌微血管生成和转移的影响

目的：观察胃癌组织中基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达及其对癌微血管生成和转移的影响。方法：应用免疫组化S-P法检测87例胃癌组织中MMP-2的表达和微血管密度(MVD)。结果：胃癌组织MMP-2阳性表达率为59．8％(52／87)。MMP-2的阳性表达与胃腺癌患者的淋巴结转移与临床病理分期关系密切。结论：MMP-2与胃腺癌新生血管的形成及转移密切相关,是判断胃癌转移有价值的指标。     

猪SsMT-1A和SsMT-2A的原核表达及金属结合特性研究

【目的】通过对猪(Sus Scrofa)金属硫蛋白1A(metallothionein-1A of S. Scrofa, SsMT-1A)和2A(Metallothionein-2A of S. Scrofa, SsMT-2A)的生物信息学分析、原核表达和纯化,研究它们与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性。为饲料中添加Zn和Cu在促进猪生产性能的作用机制研究提供理论基础。【方法】首先,从NCBI中获得SsMT-1A和SsMT-2A的基因序列,利用ClustalX2和ExPASy分析两者的蛋白序列和结构差异,利用MEGA-X构建两者与其他物种MT蛋白分子的进化树。其次,构建pET-28a-SUMO-SsMT-1A/SsMT-2A原核表达载体,转化BL21(DE3)plysS,用IPTG诱导表达。利用Ni-NTA柱亲和层析和葡聚糖凝胶层析纯化重组蛋白。最后,利用大肠杆菌金属耐受性实验、圆二色光谱（circular dichroism, CD）、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser analytic ionization time of flight m...     

胎膜早破孕妇胎膜组织中NF-κB、COX-2和MMP-9的表达及意义

将病例分为绒毛膜羊膜炎组和非绒毛膜羊膜炎组,采用免疫组化SP法检测32例胎膜早破(PROM)和20例正常孕妇胎膜组织中核转录因子κB(NF-κB)、环氧合酶-2(COX-2)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。结果表明:所有PROM胎膜标本,诊断为绒毛膜羊膜炎者占46.88%,正常组中胎膜感染占10.00%;PROM组胎膜组织中NF-κB、COX-2、MMP-9表达明显高于对照组孕妇(P0.05);绒毛膜羊膜炎组胎膜NF-κB、COX-2、MMP-9表达明显高于非绒毛膜羊膜炎组(P0.05);胎膜早破组患者胎膜组织中COX-2、MMP-9阳性表达与NF-κB采用线性相关分析呈明显正相关关系(P0.01)。NF-κB、COX-2及MMP-9均参与了PROM的发病。COX-2、MMP-9基因的表达受多功能NF-κB的调控。NF-κB活化可能是PROM发生的关键因素。     

COX-2，MMP-9和bFGF在大肠癌中的表达及临床意义

目的探讨COX-2,MMP-9和bFGF在大肠癌发生、发展及浸润转移中的作用及相互关系．方法应用免疫组化染色（SP）法检测COX-2,MMP-9和bFGF在66例大肠癌及22例正常大肠组织的表达情况．结果大肠癌组织COX-2,MMP-9和bFGF阳性表达率分别为84．8％,75．8％,65．2％,与正常大肠组织的27．3％,9．1％和4．5％相比有显著性差异（P〈0．01）,COX-2表达与肿瘤组织的浸润深度和淋巴结转移显著相关（P〈0．05）;MMP-9表达与淋巴结转移显著相关（P〈0．05）;bFGF表达与肿瘤组织的浸润深度显著相关（P〈0．05）;Spearman等级相关检验显示,COX-2的表达与MMP-9和bFGF的表达显著相关（P〈0．05,P〈0．01）．结论COX-2,MMP-9和bFGF在大肠癌的发生、发展中发挥着重要作用,COX-2可能通过促进MMP-9和bFGF的表达,从而促进大肠癌的浸润和转移．     

鸭白细胞介素-2基因克隆、原核表达及生物学活性检测

根据GenBank发表的鸭白细胞介素-2(IL-2)基因序列设计并合成了特异性引物,以经ConA诱导的广州白鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度为360 bp的目的基因片段. 将该基因克隆到pMD18-T simple vector上,经酶切、PCR鉴定及序列测定,结果表明获得了鸭IL-2成熟蛋白基因的完整克隆. 构建的表达质粒pET-IL-2经BamHI、XhoⅠ双酶切鉴定构建正确;经SDS-PAGE分析,在约33 000处出现新的蛋白条带,Western-blotting分析表明,融合蛋白能够被抗His单克隆抗体识别,体外活性检测表明,重组蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性.     

苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的克隆及原核表达

【目的】获得苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的全长序列,并在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达,为探明苹果蠹蛾雌雄间的信息素交流机制奠定基础。【方法】提取苹果蠹蛾触角总RNA,利用RT-PCR、3′-RACE和5′-TAIL-PCR扩增技术获得CpomPBP2基因的全长序列;通过构建原核表达载体pET28a-CpomPBP2对CpomPBP2进行重组表达与检测;并对融合蛋白pET28a-CpomPBP2进行Western blot鉴定及可溶性鉴定。【结果】以苹果蠹蛾触角总RNA为模板合成cDNA第一链,以cDNA为模板经RT-PCR、3′-RACE和5′ TAI PCR扩增,得到CpomPBP2基因约3 000 bp的全长序列;测序结果表明,CpomPBP2基因开放阅读框长约510 bp,编码169个氨基酸,预测的成熟蛋白分子质量为16.45 ku,等电点(pI)为5.09。经SDS-PAGE电泳分析表明,融合蛋白CpomPBP2以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为20 ku。Western blot鉴定结果显示,获得了目标蛋白CpomPBP2。用终浓度1.0 mmol/L IPTG诱导8 h后,可获得大量融合蛋白。【结论】获得CpomPBP2的全长序列,成功构建了CpomPBP2的原核表达载体,经Western blot鉴定,CpomPBP2表达正确。     

泛素样小蛋白4(SUMO4)的克隆、原核表达、纯化及鉴定

【目的】为人类泛素样小蛋白4(SUMO4)多克隆抗体制备和疾病研究奠定基础。【方法】根据Gen-Bank提供的核酸序列,设计7条单链DNA,采用重叠延伸PCR方法,合成SUMO4基因编码区。基因片段经限制性内切酶双酶切,构建到表达载体pGEX-4T-1中。酶切、测序鉴定后,将重组子转染BL21 RIL菌株,表达及纯化融合蛋白。用SDS-PAGE和Western blot检测纯化效果,鉴定表达产物。【结果】成功合成了长度约为280 bp的SUMO4基因,经双酶切鉴定,SUMO4原核表达载体构建成功,插入片段测序正确。GST-SUMO4融合蛋白在终浓度1mmol/L IPTG、28℃诱导5 h后产量达到高峰,SDS-PAGE证实表达产物以可溶形式存在,分子量约为37 ku,GST亲和层析的纯化效果良好,Western blot验证融合蛋白分子量与预期值相符。【结论】SUMO4蛋白在大肠杆菌中高效表达,并以可溶性蛋白形式存在。     

产肠毒素大肠杆菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在烟草中的表达

融合保护性抗原的LT类全毒素具有传输抗原载体和免疫佐剂两重功效。利用基因工程技术，构建了带有信号肽的Pr1as-K88ac-STII-LTA 2/UP-LTB融合基因的双价植物表达载体。双价植物表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101，并利用农杆菌介导技术叶盘法转化模式植物烟草。转基因烟草经PCR和RT-PCR初步检测，证明外源基因已经整合到受体植物基因组中，同时表明融合基因在转录水平上有表达。转基因烟草的获得，为进一步研制新型的抗腹泻植物口服疫苗奠定了良好的基础。     

谷胱甘肽硫转移酶与hEGF在大肠杆菌中的融合表达及活性研究

为了得到具有生物学活性的人表皮生长因子(hEGF),将含有人表皮生长因子基因的原核表达载体pGEX-4t-1(+)-hEGF转化入BL21-CodonPlusTM-RP表达宿主菌进行大量表达,SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体的形式存在。收集包涵体,用氧化复性的方法,加入还原型的谷胱甘肽进行复性,之后通过GlutathioneSepharoseTM4B纯化柱,分离纯化得到复性的融合蛋白。以兔抗人EGF单克隆抗体为一抗,进行Western blotting鉴定,证明分离纯化得到的融合蛋白含有目的蛋白hEGF。最后对复性的融合蛋白进行了活性分析,表明该融合蛋白具有良好的hEGF生物学活性。     

猪瘟病毒石门株NS3基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,扩增了猪瘟病毒石门株NS3基因的丝氨酸蛋白酶、NTPase、RNA解螺旋酶活性功能区长度为2 000 bp的片段,将其克隆到pET-32a中,构建了原核表达载体pET-NS3,并将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,同时对表达产物进行了SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,IPTG诱导表达得到的pET-NS3融合蛋白的相对分子质量约为97 ku,与预期结果一致,且该重组蛋白能被CSFV阳性血清所识别。     

鼠疫杆菌YscF抗原基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

为了克隆表达鼠疫耶尔森氏菌的YscF抗原基因,并对其免疫原性进行初步研究,将PCR扩增的YscF基因连接到pMD-18T载体,测序正确后再将YscF基因连接到表达载体PET32a,构建PET32a-YscF重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;诱导表达蛋白采用Ni2+亲和层析法纯化,Western blot检测其免疫原性。结果显示,28 ku的PET32a-YscF融合蛋白能被兔抗鼠的多抗识别,说明表达产物具有良好的抗鼠疫抗原特异性。     

葡萄卷叶伴随病毒ⅢCP基因在E.coli中的表达

将葡萄卷叶伴随病毒 的 CP基因克隆到表达载体 p ET- 30 a中 ,转化大肠杆菌 BL2 1,筛选得到阳性克隆 GB- 1,用 IPTG诱导使其表达。SDS- PAGE电泳分析表明 ,该 CP基因在大肠杆菌 BL2 1中得到大量表达。用该病毒的 CP抗血清通过间接 EL ISA证明所表达的蛋白具有很好的抗原性     

GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化及纯化

优化GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中的表达条件,并对其表达产物进行纯化。通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件,SDS-PAGE电泳分析以确定GST-LRF融合蛋白表达的最佳条件。并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱和电洗脱法纯化目的蛋白。结果表明:重组质粒转化菌E.coliBL21(DE3)在37℃、0.1 mmol/L IPTG诱导5 h时,GST-LRF融合蛋白表达量最高,经电洗脱法纯化得到了GST-LRF融合蛋白。已确定GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌的最佳表达条件,并纯化得到目的蛋白,为进一步制备抗LRF的单克隆抗体及LRF功能的研究奠定了基础。     

食源性大肠杆菌的PCR检测

为了将PCR技术更好地应用于食品安全检测,利用多重PCR对大肠杆菌uidA基因和7种毒理基因进行扩增,并对人为污染大肠杆菌的水和牛奶进行普通和实时定量PCR限度检测。结果发现,2组多重PCR反应即可完成uidA和7种毒理基因的检测;普通PCR和实时定量PCR检测限度相同,对人为污染水检测限度为2.8×10 cfu/mL, 对人为污染牛奶的检测限度为2.8×10⁴ cfu/mL。     

蛇毒纤溶酶ALF基因在大肠杆菌中的表达

根据蛇毒纤溶酶(A lfim eprase,ALF)氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性,设计了14条单链DNA,采用重叠延伸PCR方法人工合成了ALF基因编码区。通过克隆使其分别连接在融合标签N usA,T h ioredox-in,Skp,H is T ag和信号肽pe lB的C端,构建成了多种ALF表达载体p43-A lf,p25-A lf,p32-A lf,p15-A lf和pSkp-A lf,转化大肠杆菌后进行了诱导表达,并对表达产物进行了SDD-PAGE分析。实验结果表明,合成的ALF基因长度为603 bp;构建的表达载体在大肠杆菌中均获得了很好的表达,其中pSkp-A lf表达量最高,目的蛋白含量高达菌体总蛋白的45%。