把握细节，提高猪场非洲猪瘟荧光PCR检测结果的准确性

非洲猪瘟病毒荧光PCR检测在各猪场实验室已经普及,影响荧光PCR检测结果准确性的因素众多,为提升基层兽医实验室非洲猪瘟病毒核酸检测结果的准确性,对实验室设施、设备、人员、仪器、样本选择、核酸提取及操作细节等常见问题及注意事项进行梳理汇总,为基层开展日常非洲猪瘟病毒核酸检测提供参考。     

猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断

2009年3月贵州省某猪场送检病猪3例,为确诊病因,进行了流行病学调查,实验室剖检病变观察,细菌学、荧光抗体和RT-PCR检测。经流行病学调查和剖检病变观察,该病例为疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒感染所致;该病例细菌分离鉴定结果为阴性,猪瘟直接荧光抗体检测结果为阳性,猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒RT-PCR核酸检测为阳性。表明,该病例为猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染。     

2018—2022年四川省达州市兽医系统实验室检测能力比对分析

为科学评估达州市兽医系统各实验室的检测能力,2018—2022年达州市动物疫病预防控制中心组织辖区内7个县级兽医实验室开展检测能力比对工作。比对结果显示,2018—2022年达州市兽医系统实验室的总体检测结果准确率为95.18%,各年度平均正确率在85.71%～100%,总体准确率较高但稍显不稳定。达州市县级兽医实验室能较好掌握实验室常用检测方法,可满足非洲猪瘟等主要动物疫病检测需要,但不同区域实验室检测水平不一,血凝与血凝抑制试验（HA-HI）检测的准确率较低。建议当地县级兽医实验室以自身实际情况为基础,进行针对性的抓重点补短板强弱项行动,加强实验室建设,提升检测能力,为达州市动物疫病防控体系提供有力保障。     

小反刍兽疫防控知识问答(下)

<正>6.实验室诊断方法有哪些?如何确诊?血清学检测方法:抗体检测可采用竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。病原学检测方法:病毒检测可采用琼脂凝胶免疫扩散、抗原捕获酶联免疫吸附试验(ELISA)、实时荧光反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、普通反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),对PCR产物进行核酸序列测定可进行病毒分型。疑似患病动物的病料需经国家外来动物疫病研究中心进行确诊。(地址:山东省青岛市南京路369号,联系电话0532—85621552)     

一例猪瘟的诊断与分析

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是猪瘟病毒引起的急性、烈性和高度接触性传染病。通过分析某养殖场猪瘟的发病情况、临床症状、病理变化和实验室诊断,得出结论:必须采取实验室诊断方法进行猪瘟的鉴别诊断,多重荧光RT-PCR检测试剂盒适用于县级以上兽医实验室。     

H9亚型禽流感病毒间接免疫荧光检测方法的建立与比较

将禽流感病毒(AIV)接种犬肾上皮细胞(MDCK),24h后以鸡抗禽流感抗体和兔抗鸡荧光抗体进行间接免疫荧光试验(IFA),结果于细胞核、细胞质内观察到特异性的荧光。利用96孔细胞板培养MDCK细胞,以间接免疫荧光作为判定指标对禽流感病毒进行毒力测定,并与禽流感病毒通用荧光反转录-聚合酶链反应(荧光RT-PCR)检测方法进行比较。结果表明间接IFA、荧光RT-PCR对同一样品检测的最高稀释度分别为10-5.25TCID50和10-6,Ct<30,两种方法对禽流感病毒的检测敏感性均很高。但由于荧光RT-PCR仅对抽提的RNA进行检测,而间接IFA是对禽流感活病毒进行检测,因此在临床样品检测和动物产品检疫中间接IFA更具准确性和实用性。     

2019年秋防小反刍兽疫病原学和抗体监测分析

为扎实做好南通市羊小反刍兽疫监测工作,科学评估小反刍兽疫感染状况和流行趋势,按照《关于印发2019年南通市动物疫病监测与流行病学调查工作方案的通知》要求,对南通市7个县(市)区的435份血清样品和125份拭子样品用阻断ELISA和荧光RT-PCR试验方法检测小反刍兽疫免疫抗体和病毒核酸,检测结果显示,羊小反刍兽疫抗体阳性率为98.16%,所有县(市)区的羊小反刍兽疫免疫抗体阳性率均高于95%,且平均阻断率也达到89.32%,未检出小反刍兽疫病毒核酸阳性样品,说明南通市的羊小反刍兽疫在动物疫病防控系统的全体同志的共同努力下取得了较好的免疫效果,为重大动物疫病的防控打下坚实的基础,为逐步消灭羊小反刍兽疫提供依据。     

一步法CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR诊断方法的建立与初步应用

根据猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,分别设计了1对特异性引物和1条Taq Man探针,建立了一步法检测CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法特异性高,与PCV2,PRV,PPV,PEDV,JEV,BVDV无交叉反应;可以检出20个拷贝数的模板RNA,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)低于4%,方法重复性好。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对50份疑似病例组织进行检测,结果荧光定量RT-PCR检出30份PRRSV阳性,13份CSFV阳性,均高于常规RT-PCR方法的检出数(24份PRRSV阳性,10份CSFV阳性)。本研究建立的双重实时荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异性好、灵敏度高的特点,可用于PRRSV和CSFV的实验室快速诊断和流行病学调查。     

犬瘟热病毒原液TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种不提取病毒RNA,直接采用Taq Man荧光定量RT-PCR检测样本上清液中犬瘟热病毒的方法。通过扩增CDV的NP基因部分片段构建重组质粒,建立Taq Man荧光定量PCR方法,对所建立的方法进行特异性、敏感性、重复性检测;比较了提取核酸后进行荧光定量RT-PCR与不提取核酸对原液进行荧光定量RT-PCR检测的结果,最后对疑似CDV病料进行检测。结果显示,建立的CDV质粒Taq Man荧光定量PCR检测灵敏度比普通PCR灵敏度高1 000倍。将核酸提取液和病毒原液稀释后用该研究建立的方法进行检测,最小检测稀释倍数分别为10~7和10~5,表明提取核酸后样本中的有效c DNA浓度比直接使用病毒原液检测高100倍。特异性和重复性检测结果表明,该方法特异性良好且重复性较高。对97份临床病料进行检测,建立的方法共检出60份阳性,阳性检出率高于普通RT-PCR和胶体金快速检测试纸板,提取核酸法与原液法的一致率为100%。标准曲线分析表明,当病毒含量高于10~2拷贝·μL~(-1)时,与普通RT-PCR以及胶体金快速检测试纸板相比,CDV原液Taq Man荧光定量RT-PCR检测技术阳性检出率更高、准确性更好,值得临床推广应用。     

兽医实验室实验员荧光定量PCR理论与操作的调查分析及培训建议

通过在线问卷调查方式,获得包含广西壮族自治区市、县级疫控兽医系统及屠宰场、养殖场、第三方检测等实验室共172份实验员填写的样本数据。调查结果显示,广西兽医实验室实验员对荧光PCR仪的理论知识认知水平与实际操作熟练程度参差不齐。因此,为提高市、县级疫控兽医系统及屠宰场、养殖场、第三方检测等兽医实验室荧光PCR仪培训效率、提高实验室检测水平,应建立培训返岗机制、讲师培养机制、训前调研训后测评机制,鼓励基层实验员参与实验室培训工作,进一步完善兽医实验室培训制度。     

浅谈提高兽医比对实验准确性的方法

目前兽医实验室考核(人员比对实验)和实验室比对实验中经常涉及比对实验,一个结果的好坏直接决定排名前后,甚至直接与目标管理考核和绩效考评挂钩,因此,全国各地非常重视这一实验。比对实验涉及项目多为ELISA、血凝与血凝抑制实验和PCR。提高这3个实验结果的准确性就可以到达比对实验结果全部正确的目标。     

猪瘟病毒4种检测方法的比较

应用病毒分离鉴定、荧光抗体法、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和夹心ELISA 4种方法,分别对23份猪瘟病料组织中的猪瘟病毒(CSFV)进行了检测,并比较4种检测方法的优缺点。结果显示,病毒分离鉴定法准确性较高,诊断比较容易,但存在试验步骤繁琐,所需时间长的缺点;荧光抗体检测法所需时间较短,但需要经验比较丰富人员来判定结果,且存在假阳性结果,特异性比较差;RT-PCR检测法具有快速、敏感等优点,特别是样品保存不理想时更有价值,利用套式PCR(nested-PCR)可以提高检测的特异性;夹心ELISA检测法具有快速、敏感等优点,但在样品保存不理想时会出现假阴性结果。     

2018—2021年天水及周边地区家禽安卡拉病的流行病学调查

为了解天水及周边地区家禽安卡拉病的流行情况,该研究于2018年6月—2021年12月,通过实地察看、座谈交流、问卷调查、临床诊断、实验室检测等方式对辖区内重点养禽场进行跟踪调查。通过ELISA、荧光PCR检测方法对93个不同规模养鸡场、1个鸭场、2个信鸽场的1222份血清样本进行安卡拉病毒抗体及核酸检测。结果显示,安卡拉抗体阳性率分别为鸡23.68%~76.52%（平均57.76%）、鸭25.56%,信鸽22.58%;安卡拉病毒核酸阳性率分别为鸡12.50%~34.29%（平均24.31%）、鸭子0%、信鸽0%。可见,安卡拉病在天水及周边地区规模养鸡场普遍存在,鸭子和信鸽上尚未发现感染。     

一步法TaqMan~探针实时荧光定量RT-PCR快速检测PRRSV的建立及初步应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了一步法检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法具有较高的特异性,与PCV,JEV,SFV,PRV,PPV无交叉反应;可以检测到10个拷贝数的模板RNA或1个TCID50的PRRSV,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<1%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对72份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出40份阳性,高于常规RT-PCR方法(28份阳性)。建立的荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于PRRSV的实验室快速诊断和流行病学调查。     

鸡新城疫的诊断

介绍了鸡新城疫的临床诊断要点,总结了病毒分离、血凝抑制试验、血清中和试验、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验和RT-PCR这7种实验室诊断方法。     

如何做好兽医实验室荧光定量PCR理论与操作的有效培训

通过在线问卷调查方式,得到包含广西市、县、屠宰场、养殖场、第三方等实验室共172份实验员填写的样本数据,调查结果提示了广西兽医实验室实验员对荧光PCR仪的理论知识认知水平与实际操作熟练程度参差不齐,因此,为提高市县级、养殖场、第三方等兽医实验室荧光PCR仪培训效率、提高实验室检测水平,应建立培训返岗机制、讲师培养机制、训前调研训后测评机制, 鼓励基层实验员参与实验室培训工作, 进一步完善兽医实验室培训制度。     

鸭肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

根据鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHV)3D基因序列,设计合成1对引物,通过优化RT-PCR反应条件,建立了DHV的RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该引物仅特异性扩增出DHV 460 bp的特异性片段,而扩增鸭瘟病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)和鹅副粘病毒(GPMV)的核酸扩增结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法能检测到100 pg的DHV核酸;对6份临床病料进行RT-PCR扩增,DHV的检出率为83.33%(5/6)。结果表明:该方法具有良好的特异性和敏感性,可对临床病料中的DHV进行快速检测。     

日照市猪A型口蹄疫检测与疫情风险分析

日照市近期对养殖场、屠宰场和无害化处理厂进行一次猪A型口蹄疫专项调查。实验室进行猪A型口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测和猪口蹄疫病毒荧光RT-PCR试验,结果表明,未发现猪A型口蹄疫病例,但存在诸多导致疫情发生的不安全隐患。     

BVDV-1型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性及临床样品检测试验。【结果】BVDV-1检测的最佳探针浓度为0.25μmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,对阳性质粒标准品的最低检测限为1.7 copies/μL。特异性试验显示：建立的方法仅能特异性扩增BVDV-1,对蓝舌病、口蹄疫、水泡性口炎、小反刍兽疫和猪瘟等病毒不发生交叉反应,特异性良好,变异系数小于1%。采用建立的方法对172份临床血液样本进行BVDV核酸检测,结果检出BVDV阳性样本33份,阳性率为19.19%,与《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》(GB/T 18637—2018)中实时荧光定量RT-PCR检测结果一致。【结论】本研究建立的BVDV基因1型实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样本的检测,为BVDV-1的检测及监测提供了有力的技术手段。     

口蹄疫病毒实时TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

基于口蹄疫病毒聚合酶3D蛋白基因的序列分析,设计合成了特异的引物和探针,通过反应条件的优化,建立了实时TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法.试验表明,实时TaqMan荧光定量RT-PCR能特异性检测A、O、Asia Ⅰ 3种血清型的口蹄疫病毒,对猪水泡病、猪瘟、蓝耳病等猪常见病原检测结果均为阴性.对比检测试验表明,实时TaqMan荧光定量RT-PCR的检测敏感性比常规的多重RT-PCR提高达105倍,对口蹄疫病毒细胞增殖病毒液的检测灵敏度可达0.063个TCID50·对临床样品的检测试验证实,该方法可以有效检测临床样品中的猪水泡皮、组织、血清及O-P液中的口蹄疫病毒.