新城疫病毒SDWF2003株F基因的克隆与分子特征分析

将新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）SDWF2003株经10日龄SPF鸡胚增殖后,提取病毒基因组RNA,并以此为模板,RT-PCR扩增获得与F基因预期大小一致的DNA片段,亚克隆到pMD18-T载体并酶切鉴定正确后进行测序。软件分析显示：基因全长1662bp,编码553个氨基酸,裂解住点为^112R-R-Q-K-R-F^117,是典型强毒株氨基酸序列结构;此分离毒株属于基因Ⅶ型,该型F蛋白第101位、第121位特征性氨基酸残基分别是K（赖氨酸）和V（缬氨酸）,而本研究分离病毒F蛋白第101位、第121位分别是Q（谷氨酰胺）和V（缬氨酸）;同源性比较,与LaSota、F48E9、Ch99核苷酸同源性分别为84．4％、87．1％、98．9％,氨基酸同源性分别为88．3％、91．7％、98．4％。     

4株NDV分离株F基因的克隆与序列分析

对4 株具有一定代表性的NDV(新城疫病毒)分离株的F基因进行RT PCR(反转录聚合酶链反应)扩增和序列分析,根据基因裂解位点的氨基酸序列推测,其中1 株属于弱毒株,3 株属于强毒株;核苷酸序列及其推导的氨基酸序列比较结果表明,3株强毒株与Clone30 基因核苷酸序列的同源性在83.6%~84.0%之间,与F48 E9典型NDV强毒株同源性在86.5.6%~88.3%之间,推导的氨基酸序列同源性与Clone 30 株在85.9%~87.0%之间,与F48E9典型NDV强毒株在89.1%~91.3%之间;利用MegAlign软件绘制了NDV 的系统发育进化树,结果表明, 3株分离强毒株为Ⅶ基因型,弱毒株为基因Ⅱ型。     

Experimental studies with foot-and-mouth disease virus type Asia-1, responsible for the 2005 epidemic in China

This study was carried out to investigate the biological characteristics of the foot-and-mouth disease (FMD) virus strain Asia-1 China/2005, which is responsible for the 2005 epidemic in China. The result showed that this strain is not host restricted, and could not only cause FMD in cattle and sheep but also in pigs by either inoculation or direct contact.     

口蹄疫病毒感染细胞的研究进展

口蹄疫是引起偶蹄动物的急性发热性水泡性疾病,具有高度接触传染性,对发病国家和地区经济有破坏性作用和不良的政治影响。口蹄疫病原体为小RNA病毒科的口蹄疫病毒,是一类单股正链RNA病毒,该病毒有多种血清型及其亚型,相互之间无交叉保护力或保护力极其有限。目前,口蹄疫病毒感染的分子机理还不是很清楚。口蹄疫病毒感染细胞的过程主要包括病毒与细胞的吸附、病毒穿透细胞壁进入细胞、病毒粒子的脱衣壳、病毒RNA的翻译转录、病毒基因组的复制以及病毒粒子的成熟过程,最后是成熟的病毒粒子衣壳包装成为完整病毒。文章就口蹄疫病毒感染细胞的过程做一概述。     

仔猪先天性震颤瘟病毒RT-PCR检测方法的建立

旨在建立检测仔猪先天性震颤瘟病毒(APPV)的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法。根据GenBank上登录的APPV基因组序列,设计1对引物,以临床上表现典型震颤仔猪的淋巴结为材料,提取RNA,建立了RT-PCR方法,并进行敏感性、重复性和特异性试验,对其扩增产物测序比对分析;利用该方法,对临床病料进行检测。结果显示,从典型震颤仔猪的淋巴结中均扩增到与预期大小有一致的片段,经测序比对,扩增片段序列与APPV相应片段的核苷酸同源性在89%以上;该方法只能扩增出APPV片段,而其他几种常见猪病毒均为阴性,3次重复检测结果基本一致,可检测最低cDNA浓度为184.11ng/μL;对临床病料检测,典型病例的检出率达100%。试验结果表明,建立的RT-PCR方法具有良好的特异性、重复性、敏感性等优点,可用于临床APPV引起的仔猪先天性震颤早期检测、病毒鉴定和分子流行病学调查。     

间接血凝试验在家畜口蹄疫免疫抗体检测中的应用

为了节省IHA（间接血凝试验）血凝抗原,扩大家畜O型口蹄疫免疫抗体检测数量,在不影响检测效果（合格率）的基础上,探索和改进原正向间接血凝试验检测方法。试验分别用口蹄疫O型-Asia 1型二价灭活苗和猪O型口蹄疫苗对天水地区几个养殖场的家畜进行了免疫注射,免疫后（牛免疫21 d、猪免疫28 d）随机抽样采血,常规分离血清,采用简化后的正向间接血凝试验进行牛和猪口蹄疫O型免疫抗体检测试验。结果表明：免疫合格率分别达到97.5%和92.5%;改进后的IHA既加快了操作速度、节省诊断抗原,又降低了检测成本。在家畜O型口蹄疫检测工作中具有推广应用价值。     

用反转录聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒的研究

本文报告了建立反转录聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ）检测禽呼肠孤病毒（ Ａ Ｒ Ｖ）的方法,根据禽呼肠孤病毒 Ｓ１１３３ 毒株 Ｓ１ 基因序列,设计合成两对引物,用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术对 ６ 株禽呼肠孤病毒国际标准株进进行了检测。结果两对引物对 ６ 株 Ａ Ｒ Ｖ 均可扩增出与预期大小相符 ５３２ｂｐ 和 ４３５ｂｐ 的 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 产物,而对其它 ６ 种禽病病原核酸的扩增结果均为阴性;该 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 可以检测出 １ｐｇ 的 Ａ Ｒ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 模板。     

狂犬病病毒野毒株糖蛋白基因序列测定及分析比较

对我国河南某地野鼠体内分离的狂犬病病毒野毒株MRV糖蛋白全基因进行序列测定，与已发表的代表性毒株糖蛋白基因进行核苷酸和推导氨基酸序列的比较分析，结果表明在同一基因型中，MRV和国际标准攻毒株CVS的同源性最高(96．5％)，和中国减毒株CTN的同源性最低(79．8％)；在G基因的四个功能区中，氨基酸同源性最高的是抗原区，同源性最低的是膜内区；MRV的抗原部位和糖基化位点氨基酸均有变异；建立了各毒株的系统进化树。     

妊娠期绵羊子宫内膜Fit-1基因表达的RT—PCR检测

以β-actin基因作为内源性内标,采用RT—PCR方法检测了Flt-1基因mRNA在东北细毛羊、小尾寒羊妊娠期不同阶段子宫内膜中的表达量。结果显示,绵羊妊娠期在不同阶段的子宫内膜中Flt-1mRNA均强烈表达,且随着妊娠期的延长,Flt—1mRNA的表达量有逐渐增强的趋势（P〈0．05）;在相同的妊娠阶段小尾寒羊子宫内膜中的Flt-1mRNA表达量显著地高于东北细毛羊的Flt-1mRNA表达量（P〈0．05）。     

口蹄疫疫苗研究进展

接种疫苗是特异性预防口蹄疫的有效手段,安全有效的疫苗是成功预防、控制乃至最终消灭口蹄疫的先决条件。在口蹄疫的防控中,灭活疫苗功不可没,但同时也存在许多隐患。随着分子生物学、遗传学及免疫学等学科的迅猛发展,口蹄疫疫苗的研究也取得了较快的进展,各种基因工程疫苗如亚单位疫苗、合成肽疫苗、重组活载体疫苗、核酸疫苗等不断涌现,为口蹄疫的防控带来了新的希望。现对口蹄疫灭活疫苗和新型疫苗的发展过程及其研究进展做一介绍。     

黄芪多糖和低浓度嗜水气单胞菌对中华绒螯蟹免疫相关因子基因表达的影响

采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法研究黄芪多糖和低浓度嗜水气单胞菌对中华绒螯蟹免疫相关因子基因表达的影响。结果表明:注射低浓度嗜水气单胞菌后,河蟹血细胞抗脂多糖因子(ALF)、热休克蛋白(HSP)、抗菌肽(Crus1)、脂肪酸结合蛋白酶(EsFABP3)、JAK通路细胞受体因子(EsDOME)、JAK通路信号转导与转录激活因子(EsSTAT)、河蟹肝胰腺HSP、EsFABP3和EsSTAT及河蟹鳃组织HSP的基因表达水平显著上调(P<0.05),黄芪多糖能够显著提高河蟹血细胞中ALF、酚氧化酶(PO)、HSP、Crus1、Toll样受体基因(TLR)、EsFABP3、EsJAK、EsDOME、EsSTAT、河蟹肝胰腺中ALF、PO、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、HSP、TLR、EsFABP3、EsJAK、EsSTAT及河蟹鳃组织中ALF、GPX、HSP、Crus1、masquerade样蛋白(MasL)、TLR、EsJAK、EsDOME和EsSTAT的基因表达水平(P<0.05)。除了HSP和MasL外,注射黄芪多糖的河蟹免疫相关因子的基因表达水平普遍高于嗜水气单胞菌组河蟹。     

Foot-and-mouth disease: measurements of aerosol emission from pigs as a function of virus strain and initial dose

Measurements of airborne foot-and-mouth disease virus have been made using 20 pigs that had either O UKG or C Noville injected into their heel-pads to determine if the kinetics of virus emission are related to the virus strain and dose administered in the challenge inoculum. Viable virus was detected in aerosol emissions for 3 days regardless of the strain or dose of virus given. No correlation was found between the peak level of virus emission and dose, but pigs infected with a lower dose of virus had a delayed onset of aerosol emission and emitted a greater total amount of aerosolised virus. Irrespective of the dose, both the total amount and the peak level of virus emission were higher from pigs infected with C Noville compared to those infected with O UKG. The results suggest that care should be taken when extrapolating from laboratory derived data to the field; this is particularly the case in the early days of an outbreak when the aerosol characteristics of the virus involved may be unknown and the amount of virus that an individual animal has been challenged with remains uncertain.     

北京郊区猪戊型肝炎流行初步调查

用间接ELISA试剂盒对北京市郊区所采集的174份猪血清样品进行了抗体检测,结果显示,其抗体总阳性率达62.1%。针对戊型肝炎病毒(HEV)ORF2/ORF3重叠区设计了简并引物,采用巢式RT-PCR对随即采取的少量猪粪便样品进行了抗原检测。结果表明,部分粪便样品中存在HEV。     

口蹄疫病毒衣壳蛋白氨基酸突变对病毒热稳定性的影响

口蹄疫是世界范围内广泛流行的一种偶蹄动物的烈性传染病,其病原为口蹄疫病毒(FMDV),它对热比较敏感,当温度高于30℃时,病毒衣壳容易解离为五聚体亚单位而影响疫苗的免疫保护效果。因此,改善病毒的热稳定性,制备热稳定优良的口蹄疫疫苗具有重大的应用价值。在实验室建立的口蹄疫病毒型内嵌和全长感染性克隆的基础上,在结构蛋白引入1个或2个氨基酸突变,分别构建了2种基因修饰的口蹄疫病毒全长重组质粒。全长质粒经NotⅠ线化后分别转染表达T7RNA聚合酶的BSR/T7细胞以拯救重组病毒。间接免疫荧光和电镜分析表明,成功拯救到2株口蹄疫重组病毒。重组病毒经RT-PCR和序列测定证实只有1株重组病毒所含的耐热突变可以稳定遗传。热失活试验显示,拯救病毒与亲本病毒的耐热特性基本一致。结果表明在结构蛋白上引入V2090A-S2093F-H30568R的突变,并对口蹄疫病毒的热稳定性并没有明显的影响,为未来发展热稳定的口蹄疫疫苗提供了一定的参考。     

口蹄疫转基因植物疫苗研究进展

口蹄疫是国际社会广泛关注的严重动物传染病之一,其控制措施主要是疫苗免疫。传统疫苗在该病的防控中起了重要的作用,但是其弊端也不容忽视,研制新型的口蹄疫疫苗是今后的发展方向。近几年来,随着生物技术的发展,可饲疫苗由于其具备的诸多优点而成为国内外研究的热点,口蹄疫转基因植物疫苗的研究在国内外也已经开始,并取得了一定的成果,期望易感动物食用此转基因植物后产生免疫力,达到预防口蹄疫的目的。文章综述了国内外口蹄疫转基因植物疫苗研究的成果。     

猪O型口蹄疫病毒P1/3C基因共表达重组腺病毒的构建与鉴定

通过PCR和RT-PCR扩增出目的基因,将FMDV P1和3C基因通过IRES串联,构建出重组腺病毒穿梭质粒,在BJ5173细菌中同源重组获得同源重组腺病毒质粒,转化XL1-Gold超级感受态细胞以扩大培养,PacⅠ酶切后转染AD-293细胞,纯化获得了重组腺病毒。该重组腺病毒于AD-293细胞连续传代培养,初步浓缩后TCID50为1010.71/mL。应用O型口蹄疫病毒阳性血清进行间接荧光抗体试验,病毒感染的AD-293细胞可见清晰荧光,证明该重组腺病毒对目的基因进行了成功的表达,为FMDVP1/3C基因共表达腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。