鸭坦布苏病毒包膜蛋白的原核表达和间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立特异性和敏感性高的检测鸭坦布苏病毒感染的方法,采用原核表达系统对鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因进行了克隆与表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白大小为54.3 ku.Western blot结果表明,经亲和层析法纯化后的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应.以纯化的重组E蛋白作为包被抗原,初步建立了检测E蛋白抗体的间接ELISA方法.对ELISA各种反应条件进行了优化,确定了最适工作条件.优化后确定的抗原最适包被浓度为7 μg/mL,血清的最佳稀释度为1;320,酶标抗体最适稀释度为1:1 000.在优化条件下,阴性和阳性临界值判定标准为0.324 4.本研究建立的快速检测DT-MUV抗体的间接ELISA方法为该病的检测和流行病学调查提供了技术手段.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp4抗体ELISA检测方法的建立

克隆、表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒DY株(GenBank:JN864948)的Nsp4蛋白,并利用Nsp4作为包被蛋白建立了ELISA检测方法。优化的Nsp4抗体ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为1μg/mL,血清最佳稀释度为1∶40,最佳封闭液为100mL/L牛血清,酶标二抗的最佳工作稀释度为1∶4000,最佳显色时间为37℃反应15min。用建立的ELISA检测方法和IDEXX ELISA检测试剂盒检测血清样品130份,总符合率为93.19%。Nsp4抗体ELISA检测方法的建立,可为PRRSV的抗体监测提供技术支持。     

以PRRSV Nsp2-399重组蛋白为包被抗原建立PRRSV抗体ELISA检测方法

为了获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2-399重组蛋白,以及利用Nsp2-399蛋白建立PRRSV早期感染的ELISA检测方法,试验克隆、原核表达了PRRSV DY株(GenBank登录号为JN864948)Nsp2-399重组蛋白,同时利用该蛋白建立并优化了ELISA检测方法。结果表明:成功克隆表达了PRRSV Nsp2-399重组蛋白,并建立、优化了Nsp2-399 ELISA检测方法。优化后的Nsp2-399 ELISA的最佳抗原包被浓度为1μg/mL,血清最佳稀释度为1∶40,最佳封闭液为10%胎牛血清,酶标二抗的最佳工作稀释度为1∶4 000,最佳显色条件为37℃、15 min。猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒阳性血清样品用建立的Nsp2-399 ELISA方法进行检测,S/P值均小于0.21,ELISA方法特异性良好。用本试验建立的ELISA方法和IDEXX ELISA检测试剂盒分别检测血清样品125份,总符合率为94.40%。说明成功建立了Nsp2-399 ELISA抗体检测方法,可用于PRRSV的抗体检测。     

鸭坦布苏病毒病EDⅢ-ELISA方法的建立

为建立鸭坦布苏病毒抗体ELISA检测方法,采用RT-PCR扩增鸭坦布苏病毒ZJSBL01株E蛋白结构域III(EDIII)基因,将其克隆至原核表达载体p ET-28a,转化到BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得了重组EDIII蛋白。利用EDIII蛋白作为包被抗原,建立了检测DTMUV Ig G抗体的间接ELISA方法,并对反应条件进行优化。最终确定抗原包被浓度为4μg/m L、血清稀释度为1:40、抗原包被条件为37℃包被4 h、封闭液为含3%BSA的PBST、封闭条件为37℃封闭2 h、酶标二抗稀释度为1:1 000、底物反应时间为15min作为ELISA的最佳反应条件。当检测样品S/P大于0.306判定为阳性。建立的ELISA检测方法特异性强、重复性好,对开展鸭坦布苏病毒抗体检测及血清学调查具有重要意义。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2 000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD₄₅₀≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。     

绵羊支原体HSP70的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立绵羊支原体(Mycoplasma ovis)的血清学检测方法,根据GenBank收录的绵羊支原体HSP70蛋白C端的基因序列(登录号：CP006935.1),构建了重组原核表达质粒。通过原核表达获取重组蛋白,并将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了绵羊支原体间接ELISA抗体检测方法。结果显示,成功构建了绵羊支原体HSP70蛋白的重组原核表达质粒;重组蛋白在大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞中,同时以可溶性蛋白和包涵体蛋白的形式表达;以重组蛋白作为包被抗原建立的绵羊支原体间接ELISA抗体检测法,抗原包被最佳浓度为4μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 000。建立的ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,为绵羊支原体的检测及试剂盒的开发提供了技术支持。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2主要抗原区域的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

本研究以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HPPRRSV)重组NSP2蛋白为包被抗原,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。通过RT-PCR技术,从PRRSV SCMS08株中,成功扩增出NSP2的主要抗原区域。将其克隆到pET-32a(+),成功构建原核表达载体,并转化宿主菌(E.coli)Rosetta 2(DE3)。以镍柱纯化表达蛋白,SDS-PAGE检测证实重组蛋白获得了高效表达,Western blot检测表明所表达蛋白能够被抗组氨酸标签单克隆抗体和PRRSV阳性血清识别。以此蛋白包被酶标板,初步建立了PRRSV NSP2-ELISA诊断方法。优化的NSP2-ELISA的最佳抗原包被浓度为1.7μg·mL-1,血清的最佳稀释度为1∶40。用该方法检测185份血清样品,与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果符合率为90.8%。建立的间接ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征的常规诊断及流行病学调查。     

微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体检测ELISA方法的建立

为建立快捷的含病毒隐孢子虫的检测方法,本研究利用已构建的微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白重组表达质粒表达并纯化重组蛋白,建立以该重组衣壳蛋白为包被抗原检测抗体的间接ELISA检测方法.经优化后间接ELISA的最佳条件为:抗原包被浓度为0.25 μg/孔,被检血清稀释度为1:200,酶标二抗稀释度为1:2000,封闭液为含5％脱脂奶粉的PBST溶液.该方法检测安氏隐孢子虫阳性血清,柔嫩艾美尔球虫阳性血清,蓝氏贾第虫阳性血清,弓形虫阳性血清与微小隐孢子虫阳性结果均为阴性.该方法灵敏度为1:1600,特异性较强且具可重复性,可用于含病毒隐孢子虫的抗体检测及流行病学调查.     

边缘无形体MSP2的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立可检测边缘无形体（Anaplasma marginale）的血清学检测方法,该研究根据GenBank收录的边缘无形体MSP2基因序列（登录号：EU526889）,构建重组质粒pET28a-MSP2,原核表达获得pET28a-MSP2重组蛋白,将纯化后的蛋白作为抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,该研究建立的间接ELISA方法,抗原最佳包被浓度、血清最佳稀释度和酶标二抗最佳工作浓度分别为8μg/mL、1∶400和1∶2 000,特异性、灵敏性和重复性良好。本试验成功表达并纯化了边缘无形体的MSP2蛋白,并建立了边缘无形体抗体间接ELISA方法,为边缘无形体的监测和诊断提供参考。     

南非Ⅱ型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立

为满足口岸对南非Ⅱ型口蹄疫检测、监测的需求,在对南非Ⅱ型口蹄疫抗原表位分析及相关基因合成的基础上,进行融合蛋白pGEX-VP1~VP3的体外表达,采用柱上酶切方法制备VP1~VP3蛋白。将纯化VP1~VP3抗原包被96微孔板,分别优化抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度,确定阴性临界值。经反复优化,建立的南非Ⅱ型间接ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为6.4ug/ml,血清最佳稀释度为1:200,酶标二抗最佳稀释度为1:4000,阴性临界值(OD450)为0.562。检测样品判定标准为:OD450>0.622为阳性,OD450<0.502为阴性,0.502≤OD450≤0.622为可疑。特异性试验结果表明,所建立方法与其它血清型口蹄疫间无交叉反应。南非Ⅱ型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立为我国口岸口蹄疫检疫提供了新的查验方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7α抗体ELISA检测方法的建立

本研究克隆、表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒DY株(GenBank:JN864948)的Nsp7α蛋白,并利用Nsp7α作为包被蛋白建立了ELISA检测方法,并对检测条件进行了优化。结果显示,ELISA最佳条件:抗原包被浓度为1μg/mL,血清稀释度为1∶40,封闭液为10%牛血清,酶标二抗工作稀释度为1∶4000,显色时间为37℃反应15 min。用建立的ELISA检测方法和IDEXX ELISA检测试剂盒检测血清样品115份,总符合率为93.91%。本研究中Nsp7α抗体ELISA检测方法的建立,为PRRSV的抗体监测提供了新的技术支持。     

猪圆环病毒2型CaP蛋白的表达及在ELISA中的初步应用

本研究旨在建立以PCV2 Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET32a-ORF2并转化至Rosetta菌,在1.0 mmol·L-1 IPTG和37℃条件下诱导下,Cap蛋白获得高效表达,Western blot检测证实其具有免疫反应活性,以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法.结果表明抗原最适包被浓度为2.16μg·mL-1;血清最佳稀释度为1:40;抗原最佳包被条件为4℃过夜;最佳封闭条件为1%BSA 37℃1 h;血清反应时间为37℃30 min;酶标二抗最适作用时间为37℃45 min;底物最佳反应条件为37℃显色15 min.用该方法对四川省184份猪血清样品进行检测,总阳性率为80.98%(149/184),与商品化的PCV2 ELISA试剂盒得到的结果基本一致.本试验成功建立了PCv2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测.     

鸡传染性喉气管炎病毒gD基因的表达及间接ELISA检测方法的初步建立

将含有ILTV gD糖蛋白基因的重组质粒pMD-T-gD用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,回收目的片段,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-gD.将pET-gD转化到宿主表达菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达目的蛋白大小为55 000,Western blotting表明表达产物具有良好的免疫原性.表达的蛋白产物经纯化后作为ELISA包被抗原,以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG作为二抗,初步建立了间接ELISA诊断方法,并确定了抗原最佳包被浓度为24.5 mg/L;最佳血清稀释度为1:80,初步确定ELISA判定标准为D450≥0.25判为阳性,小于0.25为阴性.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法，利用大肠杆菌表达系统成功表达E2蛋白并纯化，利用纯化后的蛋白作为包被抗原，用方阵法对影响ELISA试验的各个因素进行优化，并进行特异性、敏感性和重复性试验。确定E2抗原最佳包被浓度为1μg/mL,最佳血清稀释度为1∶40,最佳封闭液为1%明胶，最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min;最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD_450nm≥0.255。与血清中和试验和商品化试剂盒进行比较，总符合率分别为98%和96%,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与其它常见牛病毒阳性血清均无交叉反应。本研究成功建立了间接ELISA方法，为进一步用于大批量牛血清样本的抗体检测和流行病学研究奠定了基础。     

利用重组E2蛋白检测BVDV血清抗体间接Dot-ELISA方法的建立

利用大肠杆菌表达的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白作为抗原,建立了检测BVDV血清抗体的间接Dot-ELISA.最佳工作条件为:E2蛋白抗原的最适包被质量浓度2.0 mg/L(2.0 ng/点),酶标抗体的工作浓度为1:500,血清稀释度为1:100,3%明胶-TBS作为封闭液,封闭45 min效果最佳.通过重复性试验、交叉试验、特异性试验和稳定性试验等证明,该方法重复性好、特异性强、灵敏度高;与用BVDV全病毒为抗原的IDEXX ELISA试剂盒相比,特异性96.67%,灵敏度90%,符合率95%.应用建立的检测方法对河北省4个奶牛场采集的178份腹泻奶牛血清样本进行检测,结果BVDV血清抗体阳性率40.45%,与IDEXX ELISA试剂盒的检出率无明显差异.     

牛源无乳链球菌sip蛋白抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

为测定牛源无乳链球菌表面免疫相关蛋白(sip)的抗原性,本实验通过建立间接ELISA方法,对该蛋白的抗原性进行分析及鉴定.根据无乳链球菌sip基因序列,设计一对引物,以临床分离菌株基因组DNA为模板,PCR扩增sip抗原表位优势区编码的基因序列,并将其与原核表达载体pET-30a(+)连接,构建重组质粒pET-sip,转化宿主茵BL21中,经IPTG诱导,获得重组蛋白,western blot分析表明,重组蛋白具有良好的抗原性.以纯化的表达产物作为包被抗原,建立检测无乳链球菌抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为3.125μg/mL,血清最佳稀释度为1:160,酶标二抗最适稀释度为1:4000.应用该方法对无乳链球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌兔阳性血清进行检测,结果表明,该方法具有良好的特异性和灵敏度.     

基于重组蛋白SP41的布鲁氏菌间接ELISA检测方法的建立及初步应用

对布鲁氏菌黏附素SP41蛋白进行表达、纯化,以表达重组蛋白为包被抗原,建立了检测布鲁氏菌病绵羊血清抗体的间接ELISA方法。克隆布鲁氏菌SP41基因,PRC、酶切、测序鉴定正确后,构建pET-32a(+)-SP41原核表达载体,转化表达菌E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达重组SP41蛋白,纯化表达产物后包被酶标反应板,方阵滴定法进行最佳血清稀释度和最侍抗原浓度的筛选,结果显示重组蛋白SP41最佳抗原包被浓度为0.6mg/L,最佳血清稀释度为1:50。交叉试验、阻断试验、重复性试验表明,该方法重复性好、特异性强。利用此方法检测217份绵羊血清样本,结果表明该方法的阳性检出率要高于虎红平板试验和试管凝集试验。     

猪瘟野毒感染抗体阻断ELISA检测方法的建立与初步评价

以猪瘟野毒E2蛋白为包被抗原、辣根过氧化物酶标记的猪瘟野毒单抗作为酶标抗体,建立检测猪瘟野毒抗体的阻断ELISA方法.猪瘟野毒E2最适包被浓度为0.03 μg/mL,待检血清最适稀释度为1∶4,酶标猪瘟野毒单抗稀释度为1∶1 000.用建立的阻断ELISA方法检测369份临床阴性血清,计算阻断率,确定临界值,阻断率＞4...     

牛传染性鼻气管炎病毒DQ株gD基因表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用

以原核表达的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gD蛋白作为包被抗原,建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法.构建pET30a-gD重组质粒,在大肠杆菌中表达IBRV重组gD蛋白,Western-blot检测该重组蛋白具有良好的免疫活性.通过方阵试验确定了抗原的最适包被浓度为2.5 μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:200,酶标二抗最佳稀释倍数为1:5 000,与病毒中和试验,全病毒ELISA方法的检测结果符合率分别为87.5%、92.5%.用该法对黑龙江部分地区采集到的863份牛血清样品进行检测,结果阳性率为82.27%.本试验建立的间接ELISA方法可用于IBR的检测和流行病学调查.     

猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA方法的建立及应用

应用纯化的EMCV VP1重组蛋白建立了检测EMCV抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最佳工作条件。结果表明,重组蛋白抗原的最适包被浓度为0.54μg/mL;与间接免疫荧光试验比较,结果表明该方法具有良好的特异性和敏感性。此方法中VP1抗原最佳稀释度为1:100,待检血清的最佳稀释度为1:50,酶标二抗的最佳稀释度为1:800,1%明胶为封闭液,OD450时阴阳性血清的临界值为0.35。对2006年天津7个地区66个猪场295份屠宰猪的血清样本的检测结果显示,天津各地区血清EMCV抗体阳性率在41.67%～93.33%之间,平均84.75%,猪场抗体阳性率在50%～100%,平均93.94%。