濒危珍稀植物半枫荷转录组中SSR位点分析

分析半枫荷转录组中的SSR位点信息,并设计简单重复序列(SSR)引物,以期为半枫荷EST-SSR分子标记提供有力工具。利用MISA工具筛选了半枫荷转录组测序获得的77629条Unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;在此基础上利用Primer 3.0设计SSR引物,并随机选择50对SSR引物对4株不同来源的半枫荷进行多态性扩增分析。在半枫荷的转录组中,共找到15041个SSRs,分布于10669条Unigenes,SSR位点发生频率为13.74%,含多个位点的序列数为3114,占SSRs位点总数的29.19%,以复合形式出现的位点数2044个,占SSRs位点总数的19.16%,SSRs的平均距离是3.2 kb。SSRs位点中二碱基重复是主要类型,占总SSRs的42.17%;其次是单碱基重复基序(38.25%)SSRs。所包含的重复基元中,单碱基重复基元A/T(5572),二碱基重复基元AG/CT(4845)是优势重复基元类型,分别占总SSRs的37.05%、32.21%。利用Primer 3共设计出28590对SSR引物。随机选择50对引物进行PCR扩增,其中44对(88.0%)扩增出清晰、可重复的条带,15对(34.1%)扩增条带表现出多态性。半枫荷转录组SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析、分子标记辅助育种和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记。     

棉花非冗余性EST-SSR新标记的开发及其评价

利用Clustal X等软件对公共数据库现有的393 753条棉花EST序列分析,得到349 815条非冗余EST序列,借助自主开发的SSRmine软件共发掘SSR位点11 372个,分布于10 507条EST中,EST-SSR的频率是3%,平均相隔21 kb出现一个SSR。在2~6 bp的重复基元中,三核苷酸和六核苷酸分别占34.1%、40.6%,二、三、四、五和六核苷酸基序分别以AG/CT、AAG/CTT、AAAT/ATTT、AAAAG/CTTTT和AAAAAG/CTTTTT的类型最多。利用去冗余的且在亚洲棉、陆地棉、海岛棉中没有被开发过的410条EST序列设计开发了200对非冗余性SSR引物,利用自主开发的SSRD软件通过SSR引物序列下载、预处理、Blastn、提取相似性分值≥81%的引物编号、提取引物冗余对、冗余引物写成一行等6个步骤去除来源于自身部分同源序列以及与CMD释放的不同棉种相似性SSR引物,得到了非相似性引物,定名为CRIXXX (CRI即Cotton Research Institute)。并分别选用棉花12个种的代表性材料对其中100对进行引物功效评价,包括多态信息含量(polymorphism information content, PIC)及引物通用性研究。结果显示,从自主开发的100对SSR引物筛选出56对均能在12份材料间扩增出稳定明显的条带, 其中多态性引物35对,多态率占35%。引物的PIC变幅为0.097~0.888,平均为0.482;1对海岛棉EST-SSR引物在12份材料间的通用性为100%,25对亚洲棉引物通用性为81%,74对陆地棉引物通用性为80.1%。     

芝麻EST-SSR标记的开发和初步研究

为了加速分子标记在芝麻研究中的应用,利用网上现有的芝麻EST(expressed sequence tags)数据信息,开展了芝麻EST-SSR功能性标记的开发和利用研究。 在所有的3 328条芝麻EST序列中共确认得到1 785条非冗余EST序列。其中,在含有微卫星重复的148条序列中共检测有155个EST-SSR。非冗余EST序列总长为774.266 kb,平均每4.99 kb含有一个EST-SSR。EST-SSR的分布频率和特征分析表明,以AG/TC为重复基元(motif)的SSR出现最多,占总SSR的37.42%。利用这些序列,设计开发了50对EST-SSR引物,并分别选用36个芝麻、2个棉花、2个大豆和2个油葵进行多态性和通用性研究。其中44对引物在供试芝麻材料中扩增出条带,共产生108个位点,平均每对引物产生2.45个位点,多态信息含量(polymorphism information content, PIC)平均值为0.390。根据遗传相似性系数进行聚类,有26个芝麻材料聚类在两个大的亚类(III和IV)中,聚类结果表明芝麻的基因型与地理来源之间没有必然的联系。此外,分别有2对、3对和4对引物可以在棉花、大豆和油葵中进行通用性扩增。本研究证实这种全新开发的芝麻EST-SSR标记在芝麻遗传多样性分析、遗传图谱构建以及比较基因组等研究方面有广阔的利用前景。     

利用水稻基因组序列数据开发SSR标记的方法

水稻基因组序列中存在着丰富的简单重复序列(SSR)，而已经开发利用的仅仅是一小部分。本文提出了通过搜索水稻基因组序列中的简单重复序列开发SSR标记的思路和方法，并介绍了应用本方法成功地在500kb范围内，获得22个SSR标记，其中10个在定位群体中扩增出多态带的SSR标记并将其定位，本实例验证了利用水稻基因组序列数据开发SSR标记是十分有效的。     

桃(Prunus persica [L.] Batsch)转录组SSR信息分析及其分子标记开发

利用MISA软件筛选桃(Prunus persica[L.]Batsch)转录组数据,获得的109 248条Unigene,检测出24 102个SSR位点,分布于22 689条Unigene中,出现频率为20.76%。SSRs位点中主导类型是以AG/CT(占总SSRs的18.70%)为主的二核苷酸重复,占总SSRs的33%;其次是三核苷酸重复,出现频率为27%;四核苷酸重复,占总SSRs的25%。利用Primer 5共设计出9 657对SSR引物。随机选择50对引物进行PCR扩增,其中20对扩增出清晰可重复的条带,并且在同属材料(苹果试材)中也能获得理想结果,引物多态性检测发现,在15份桃试材中,10对引物具有多态性,利用UPGMA作图,可将15个桃材料很好区分。结果表明,桃转录组测序产生的Unigene是开发SSR标记的有效信息,为SSR标记在桃的遗传分析上提供可靠的标记选择。     

陆地棉耐盐相关EST-SSR以及EST-InDel分子标记的开发

随着棉花基因组学、转录组学等重要学科的快速发展,针对候选基因进行序列多样性分析,开发基于候选基因的分子标记,将能够极大推进棉花分子育种研究。本研究利用高通量的测序技术对耐盐陆地棉品种Miscott 7913-83和盐敏感品种苏棉12盐胁迫前后根、叶总RNA的混样进行了转录组测序,对不同盐处理时期Miscott 7913-83和苏12根和叶分别进行表达谱分析。获得3232条盐胁迫下差异表达基因;基于差异表达基因利用生物信息学手段大规模开发了SSR以及In Del等分子标记;随机选择了部分SSR及In Del引物进行验证,进一步证实了分子标记的准确性。本研究为快速开发陆地棉品种间多态性分子标记提供了高效可行的分析方法,通过开发陆地棉耐盐相关功能标记,以期用于分子标记辅助育种改良陆地棉耐盐性。     

基于梨EST和基因组序列SSR引物的批量开发与应用

目前基于梨属植物基因组开发的SSR引物太少,远不能满足其品种鉴别、遗传多样性分析和分子标记辅助育种等研究与应用的需要。为进一步开发更多的梨SSR引物,本研究从NCBI公共数据库检索到梨的4 338条ESTs和478条基因组序列。通过前处理和聚类去冗余后得到全长为343.81 kb的无冗余的686条ESTs,搜索获得725个SSRs,其平均长度为17.34 bp。在一至九个核苷酸的重复基元中,其主要类型是单核苷酸重复和二核苷酸重复,两者所占的比例分别为84.44%和10.34%。BLASTx同源性比较分析发现,上述686条ESTs中305条在数据库中可以找到同源序列,占ESTs总数的44.46%,功能已知蛋白质中碧桃来源的ESTs所占比例最大,为41.37%。GOA功能分类结果表明,293条ESTs可划分为生物过程、分子功能和细胞成分3大功能类,其中与细胞过程相关的ESTs数量最多,为103条。序列分析结果显示,EST-SSRs与基因组SSRs的平均检出频率分别为2 108.74 loci/Mb和91.11 loci/Mb,两者具有显著的差异。本研究基于梨的EST和基因组序列,应用MISA批量开发技术分别获得了111对EST-SSR引物和291对基因组SSR引物,随机抽取及合成11对引物的验证结果表明,开发得到的SSR引物在梨属植物中具有较好的通用性。     

黄麻全基因组SSR鉴定与特征分析

黄麻是世界上重要的天然韧皮部纤维作物之一。然而, SSR标记的缺乏限制了黄麻的遗传改良。本研究从圆果种黄麻测序品种CVL-1的基因组、基因、CDS和cDNA中挖掘SSR信息,利用SSR Primer软件查找SSR位点,并分析其分布特征。结果表明,基于基因组序列共开发了153,242个基因组SSR,平均密度为467.20个SSRMb~(–1);基于cDNA序列开发了10,747个SSR,平均密度为260.85 SSR Mb~(–1)。大部分重复基元为二至四核苷酸,占76.91%,其中cDNA序列SSR中三核苷酸重复基元数量较多而基因组SSR中二核苷酸重复基元数量较多。对于不同类型的SSR重复基元,随着重复单元数量的增加,其基因组和cDNA的SSR分布频率呈现逐步降低特征。黄麻全基因组SSR标记鉴定,不仅可以丰富黄麻分子标记的数量,而且为剖析黄麻重要农艺性状的遗传机制奠定基础。     

基于丝瓜全基因组序列SSR分子标记开发

为研究高效的丝瓜分子标记,本研究根据已报道的有棱丝瓜和普通丝瓜全基因组序列信息,利用MISA 2.1软件对丝瓜全基因组水平的SSR位点进行搜索,分别在有棱丝瓜和普通丝瓜中鉴定到341 829个和348 397个SSR位点,发生频率分别为2.20 kb/SSR和2.03 kb/SSR。有棱丝瓜和普通丝瓜重复单元最多的均为单核苷酸,分别占总数的73.90%和74.21%,其次为二核苷酸和三核苷酸重复单元。在有棱丝瓜和普通丝瓜中各鉴定到211种SSR重复基序,其中A/T、AT/AT、AG/CT和AAT/ATT重复基序类型出现频率最高。优选SSR位点,分别在有棱丝瓜和普通丝瓜中开发了278 522和284 966对SSR引物。通过比对两个基因组的SSR引物序列与自身的参考基因组,获得在有棱丝瓜和普通丝瓜中具有序列大小差异的SSR引物955对,随机挑选其中64对引物在6份表型差异较大的丝瓜材料中进行引物有效性检测,其中61对引物有目的条带扩出,16对引物具有多态性。本研究在丝瓜全基因组水平所开发的SSR分子标记可为后续丝瓜种质资源鉴定、亲缘关系分析及分子标记辅助育种提供基础。     

南瓜属EST-SSR标记的开发及在杂种纯度鉴定中的应用

为利用SSR标记进行快速、准确的南瓜杂交种纯度分析,进行了南瓜EST-SSR标记的开发.从NCBI数据库下载1 457条南瓜属作物EST序列,去除冗余序列后进行SSR位点搜索,共得到215条含有SSR位点的EST序列.这些SSR位点包含111种重复基元,其中二核苷酸(62个,占28.84％)和三核苷酸(86个,占40....     

枳壳EST-SSR标记的开发

GenBank上已公布的枳壳EST序列为开发新的SSR标记提供了宝贵的数据资源。本研究利用在线SSR鉴定软件SSRIT分析来自枳壳EST数据库的11029条Unigene序列。分析结果共发现327条EST序列含有348个SSR位点,占总数的2.96%。其中,三核苷酸重复的SSR类型最多,共有161个,占检索总数的46.26%。Primer 3.0设计合成58对EST-SSR引物,其中36对能扩增出产物,6对引物产生多态性分离,分别占所设计引物总数的62.07%和10.34%。本文研究成果为今后枳壳遗传多样性分析、遗传图谱构建及比较基因组等研究方面奠定了基础。     

Microsatellite polymorphism in Pisum sativum

Pisum sativum sequences were retrieved from Genbank/EMBL databases and searched for all possible dinucleotide and trinucleotide tandem repeats. One‐hundred and seventy‐one simple sequence repeats (SSRs) were found among 663 sequences. The different dinucleotide or trinucleotide motifs occurred at varying frequencies. CT/AG was the most frequent dinucleotide, and TCT/AGA the most frequent trinucleotide. Forty‐three microsatellite markers were generated from these sequences and used to assess the genetic variability among 12 pea genotypes. Thirty‐one were polymorphic among the genotypes and the average number of variants per marker was 3.6 when considering only polymorphic markers. Overall, the number of variants for a given SSR marker was correlated with the length of the SSR but some 12‐bp long SSRs showed the same degree of polymorphism as longer ones. The groupings resulting from the SSR genotyping among the 12 genotypes gave an interesting insight into the possible origin of one recent cultivar. Database‐derived SSR markers are highly variable. They can provide useful information on the genetic diversity among P. sativum cultivated types.     

黑白轮枝菌基因组中微卫星的频率和分布

为了明确重要植物病原真菌黑白轮枝菌基因组中的徽卫星(SSR)分布情况,利用软件SciRoKo从已测序的VaMsl02菌株基因组(32.8 Mb)中,成功搜索得到4224个SSR.结果显示,三碱基重复徽卫星的数量最多,为1481个,占SSR总数的35.1％;其次是二碱基、六碱基、四碱基和五碱基;单碱基重复的微卫星数量最少,为308个,仅占总数的7.3％.不同重复单元的徽卫星在黑白轮枝菌基因组中的分布是非随机的,具有明显的偏好性.单碱基、二碱基、四碱基和五碱基偏爱出现于非编码区,尤其是基因间区.三碱基和六碱基重复微卫星较为集中分布在外显子区,并且重复次数变化丰富,推断黑白轮枝菌编码区的SSR可能会通过调节自身的重复次数来适应新环境.     

Development of EST‐SSR markers for diversity and breeding studies in opium poppy

All publicly available opium poppy expressed sequence tag (EST) sequences, totalling 20 885, were assembled into unigenes and examined for simple sequence repeats (SSRs). Nearly 19% of the 14 957 unigenes contained SSRs with 4% harbouring more than one SSR. Average density of the SSRs was 1 SSR per 3.6 kb of non‐redundant EST sequence. Trinucleotide SSRs were most frequently identified (39%), and many of the most prevalent motifs were AT‐rich. Flanking primers were designed for 86% of the SSRs and 67 primer pairs were tested on 37 opium poppy accessions and seven related species. All markers were transferable to the related species. Polymorphism information content (PIC) values for the markers were intermediate for comparisons within opium poppy (average of 0.27) and slightly higher for comparisons across species (average of 0.29). The markers were found to be useful for diversity analysis as they successfully distinguished among Turkish opium poppy accessions and land races.     

鹅掌楸EST-SSR引物开发及通用性分析

通过对6520条鹅掌楸EST序列进行检索,在364条ESTs中发现394个SSRs,鹅掌楸EST-SSRs平均密度为每8.5kb含有1个SSR;在检索出的SSRs中,二核苷酸重复单元的SSRs类型最多,占总数的61.9%。利用SSR-ESTs序列共设计176对EST-SSR引物,其中132对在鹅掌楸上有扩增产物,66对扩增出多态,多态性引物占所设计引物的36.9%。这批EST-SSR引物在物种之间具有较高的通用性。研究表明在鹅掌楸中表现多态的66对EST-SSR引物,85%在中国马褂木中有扩增,54%在白玉兰中有扩增。     

High‐throughput development of SSR marker candidates and their chromosomal assignment in rye (Secale cereale L.)

Shotgun survey sequences of flow‐sorted individual rye chromosomes were data mined for the presence of simple sequence repeats (SSRs). For 787,850 putative SSR loci, a total of 358,660 PCR primer pairs could be designed and 51,138 nonredundant SSR marker candidates were evaluated by in silico PCR. Of the 51,138 SSR primer candidates, 1,277 were associated with 1,125 rye gene models. A total of 2,112 of the potential SSR markers were randomly selected to represent about equal numbers for each of the rye chromosomes, and 856 SSRs were assigned to individual rye chromosomes experimentally. Potential transferability of rye SSRs to wheat and barley was of low efficiency with 4.3% (2,189) and 0.4% (223) of rye SSRs predicted to be amplified in wheat and barley, respectively. This data set of rye chromosome‐specific SSR markers will be useful for the specific detection of rye chromatin introgressed into wheat as well as for low‐cost genetic and physical mapping in rye without the need for high‐tech equipment.     

猕猴桃EST序列的SSR信息分析

从NCBI公共数据库中最新公布的猕猴桃表达序列标签（Expressed Sequence Tag,EST）中随机抽取56,400条序列,应用SSRHunter软件查找微卫星（Microsatellite,SSR）重复序列。研究结果表明,从猕猴桃EST序列中获得了7939条SSR,其中包括二核苷酸重复5131条（64.63%）,三核苷酸重复1237条（15.58%）,四核苷酸重复284条（3.58%）,五核苷酸重复397条（5.00%）, 六核苷酸重复890条（11.21%）。大约每2.48kb 长度的单一基因序列中即存在1个SSR, 即平均7个单一基因中存在1个SSR。二核苷酸重复序列是最丰富的重复单元,其次为三核苷酸重复和六核苷酸重复。在所获得的SSR重复单元中,AG/CT为优势重复,共分布4654条（90.70%）。通过筛查猕猴桃EST序列中的SSR,可为猕猴桃基于EST-SSR的分子生物学研究奠定理论基础。