适合于甜菜品种鉴定的ISSR核心引物的筛选

探寻适合甜菜品种鉴定的ISSR引物,用以构建甜菜品种的指纹图谱。利用一个品种对全部100条ISSR引物进行退火梯度实验,然后利用16个进口甜菜品种在每个引物的最佳退火温度下对全部引物进行扩增,筛选适合甜菜品种纯度鉴定的ISSR引物。结果从100条ISSR引物中筛选出多态性高、扩增条带清晰、重复性好的引物16条,这16条ISSR引物总共扩增100条多态性条带,引物的PIC值均大于0.6,从理论上讲,这些核心引物完全可以实现对现有甜菜品种的鉴定。     

适合甜菜品种鉴定的SRAP核心引物的筛选

为筛选适合甜菜品种纯度鉴定的SRAP核心引物,以12个进口国外甜菜品种为材料,对546对SRAP引物组合进行扩增,利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,选择适合甜菜品种纯度鉴定的SRAP核心引物组合。结果从546对SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富、重复性好的引物组合23对,这23对引物组合共扩增出177条多态性条带,引物的PIC值均大于0.6。平均每对引物扩增7.7条多态性条带,从理论上讲,这些核心引物完全可以实现对现有甜菜品种的鉴定。     

甜菜全基因组SSR引物的筛选与评价

旨在筛选出适合于甜菜分子生物学实验的SSR核心引物,为后续构建甜菜指纹图谱及遗传多样性分析奠定重要基础。本文利用4种不同的甜菜种质资源和4个不同的甜菜品种,对基于甜菜全基因组编码区序列设计的247对SSR引物进行了初步筛选。结果表明,247对引物中绝大多数引物没有多态性或者多态性不好,只有27对引物具有较高的多态性,这27对引物总共扩增出103条带,其中多态性条带95条,多态性比率为90.43%。这些引物多态性信息量(PIC)范围为0.549~0.983,平均每一对引物的PIC值为0.841。试验结果表明虽然经过了电子PCR的筛选,想要找到合适的甜菜SSR引物依然比较困难,说明甜菜的遗传基础比较狭窄。这27对SSR引物适用于甜菜分子标记,为甜菜品种标准化鉴定体系的大规模构建和应用奠定了重要基础。     

40个珍珠豆型花生SSR指纹图谱的构建

以南方花生主产区主栽的40个珍珠豆型花生为材料,利用62对SSR标记引物进行分子标记带型分析,从中筛选出12对多态性好、带型清晰的SSR标记引物进行指纹图谱构建。12对SSR标记引物共获得88个多态性位点,平均PIC值为0.779,利用这88个多态性位点构建了40个品种的SSR指纹图谱。研究结果为这些花生品种的鉴定奠定了基础。     

吉林省主推玉米品种的SSR分子标记纯度鉴定

针对吉林省主推玉米品种,构建了一套科学高效的纯度鉴定体系。以吉林省主推的50个玉米品种为研究材料,从GB/T 39914-2021公布的40对SSR引物中筛选出9对用于吉林省主推玉米品种的纯度鉴定。筛选出的9对引物杂合度在82%~100%,平均杂合度为91.5%,PIC值在0.44~0.75,平均PIC值为0.63。该组引物多态性高、稳定性强、分辨率高且非特异扩增片段少。将9重扩增体系进行优化,形成吉林省主推玉米品种纯度鉴定体系。用这9对引物对吉林省主推的6个品种进行纯度鉴定,可准确检测出品种的典型株、自交苗和异型株,共检测出10个自交苗和7个异型株,6份样品最高纯度为98%,最低纯度为96%,鉴定结果与田间鉴定结果相关性系数为0.766,相关性较高,结果可靠。     

西瓜品种ssR标记鉴定引物的筛选与分析

以16个西瓜品种为材料,从226对西瓜SSR引物中筛选出24对适合西瓜品种鉴定的引物,用该24对引物对68个西瓜品种进行分析,共检测出60个等位基因变异,等位基因变异范围为2⁹个,平均每个位点产生2.5个等位基因变异。68个西瓜品种遗传聚类分析结果显示,24对引物能够将所有品种进行有效鉴别,品种间遗传相似性介于0.4769个,平均每个位点产生2.5个等位基因变异。68个西瓜品种遗传聚类分析结果显示,24对引物能够将所有品种进行有效鉴别,品种间遗传相似性介于0.476⁰.984,并且至少存在1个位点的差异,说明由该24对SSR引物形成的引物组合可用于西瓜品种的鉴定。     

甜菜DAMD引物的筛选及不同凝胶系统对扩增产物多态性的影响

为了筛选适宜于甜菜品种纯度鉴定的DAMD引物,笔者利用12 个不同的甜菜品种分别对26 条DAMD引物进行扩增,并分别采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳和2%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。结果表明,从26 条DAMD引物中筛选出16 条扩增清晰的引物,这16 条引物共扩增出139 条带,其中多态性条带为122 条,多态性百分比为87.7%,这16 条引物可以作为甜菜品种纯度和真实性鉴定的核心引物,同时发现聚丙烯酰胺凝胶电泳与琼脂糖凝胶电泳的检测结果差异不大,而琼脂糖凝胶具有制作方便、检测简单以及不使用任何有毒药剂等优点,推荐甜菜DAMD扩增产物的检测使用琼脂糖凝胶电泳。     

甜菜品种SSR指纹图谱的构建及遗传多样性分析

筛选出20对多态性高、带型清晰、重复性好的SSR标记引物对供试甜菜品种进行PCR扩增,根据扩增产物构建SSR指纹图谱,并分析其遗传多样性。结果显示,共检测出112个等位基因,平均每对引物5.6个,利用获得的等位基因计算遗传距离,107个品种的遗传距离变化范围在0.065~0.467之间,平均遗传距离0.298。Shannon’s多样性指数变异范围0.78~2.90;PIC值介于0.08~0.83;Nei’s指数介于0.39~1.87。利用类平均法（UPGMA）进行聚类分析,可将107个甜菜品种分为2个类群。类群Ⅰ29个品种,类群Ⅱ78个品种。类群Ⅰ和Ⅱ又可分为多个亚群。结果表明,每个甜菜品种有区别于其他品种唯一的数字指纹,说明用于试验的20对SSR标记适用于甜菜品种真实性的鉴定,同时甜菜品种指纹图谱库的构建也为甜菜品种鉴定提供技术基础。     

基于SSR标记的小豆品种鉴定体系建立及应用

小豆是中国重要的食用豆类作物,建立小豆品种鉴定体系有助于品种测试、种子市场监管等工作。本研究选择不同地理来源、表型性状差异较大的12个小豆品种为实验材料,筛选出59对扩增稳定、多态性较高的初选核心引物,在5’端进行荧光标记后,另选择96份小豆品种进行复筛,进一步决选出28对核心引物,构建了182个小豆品种的DNA指纹库。这些引物共检测到245个等位变异,等位变异数范围为2～20个,平均每对引物检测到8.75个等位变异;Nei’s基因多样性指数变化范围为0.27～0.89,平均为0.62;PIC值在0.246～0.877之间,平均为0.583。对核心引物未能区分开的品种进行1个生长周期田间种植对比鉴定,表明分子指纹聚类结果与基于表型的分类结果相同。本研究建立的基于毛细管电泳平台的小豆SSR分子标记品种鉴定体系,可用于小豆种质资源鉴定和遗传多样性分析、DUS测试辅助筛选近似品种、品种真实性鉴定等工作。     

国产糖甜菜品种SSR指纹图谱的构建

为了构建14份国产甜菜品种的指纹图谱,利用6个差异较大的甜菜品系对50对SSR引物进行筛选,共选出7对多态性高、带型清晰、重复性好的SSR引物。利用这7对SSR引物对国产14份糖甜菜品种进行扩增,共获得40条谱带,其中多态性位点28个,多态性比率达75%;每对引物产生的等位基因数为5-8个,平均6.6个。利用其中三对引物S6,S13和BVGTT6构建了14份国产甜菜品种的DNA指纹图谱,结果表明,每个甜菜品种有唯一的数字指纹区别于其它品种,说明SSR标记适用于甜菜品种纯度和真实性的鉴定,同时甜菜品种指纹图谱库的构建也为将来可能出现的甜菜品种纠纷打下坚实的技术基础。     

甜菜CDDP核心引物的筛选及利用CDDP引物鉴别甜菜品种

为了研究CDDP引物在甜菜育种上的应用,选用12个甜菜品种对35条CDDP引物进行筛选。随后,利用筛选的引物对43个甜菜登记品种进行鉴别。结果显示35条CDDP引物中有10条引物可以作为甜菜品种真实性鉴定的核心引物。这些引物扩增的条带具有清晰、易于识别、多态性高的特点,普遍分布在50~400 bp之间。其中,引物KNOX-3就可以鉴别全部43个甜菜品种。引物MADS-1和F3’H4的组合也可以鉴别全部的43个品种。甜菜CDDP核心引物的筛选,对于将来利用CDDP引物鉴别甜菜品种、对甜菜种质资源进行分类,为有效维护农民、育种家以及糖厂的利益提供了理论和技术上的支持。     

红甜菜品种指纹图谱的构建

为了更好地保护育种家以及红甜菜种植者的利益,达到快速鉴定红甜菜品种的目的。笔者利用SSR引物构建了12 个红甜菜品种的指纹图谱。结果表明,只需要BVV21、SSD77 和SSD6 这3 对SSR的引物组合就可以实现对12 个红甜菜品种的鉴别,其中BVV21 一种引物就可以单独鉴别‘紫菜头’、‘甜研红1号’和‘880274’这3个红甜菜品种。     

利用InDel技术评价甜菜品种的一致性

为了探索InDel分子标记技术在鉴定甜菜品种一致性中的可行性，本研究以8个甜菜品种为试材，每个品种取24个单株，分别提取基因组DNA，利用9对InDel引物对每个甜菜品种的24个单株分别进行InDel-PCR扩增，根据扩增条带分析每个甜菜品种的一致性分布特征。结果表明8个甜菜品种所有位点的平均一致性比率在67.7%~88.1%之间。单一引物在不同品种中表现出的一致性比率具有一定差异。例如，利用ND286引物在品种985和品种1123中检测出的一致性比率为100%，但是在其他品种中检测出的一致性比率分布在46%~63%之间。不同引物在同一品种中表现出的一致性比率可能相同，但其区分出的不一致植株可能相同也可能不同。比如，在平均一致性最好的品种1015中，ND31和ND71引物在24个植株中检测出的一致性比率相同，但ND31引物区分出的差异植株为13、14和15号植株，而ND71引物区分出的差异植株为8、15和21号植株。因此利用单个位点引物对甜菜品种一致性进行鉴定不具有普遍性和科学性，应该综合多个位点的表现进行一致性鉴定，且现阶段甜菜品种一致性鉴定的标准不宜设置过高。     

利用SRAP与SSR标记分析不同类型甜菜的遗传多样性

为选育优质甜菜新品种, 指导种质资源引进和利用, 为进行分子标记辅助选择育种提供科学依据, 采用SRAP和SSR两种分子标记方法相结合, 对甜菜单胚雄性不育系及保持系等49份材料进行遗传多样性分析。利用4个表型差异显著的甜菜品系对SRAP的64对引物组合及SSR的11对引物组合进行扩增, 分别筛选出有效引物组合11对和9对。SRAP的11对引物组合共产生199条扩增带, 其中有86条多态性带, 多态性带的比率平均为43.7%。SSR的9对引物共产生35条扩增带, 多态性比率为100%。全部材料的平均遗传距离为0.3860, 平均遗传相似系数为0.6795, 大约30%的材料遗传距离或遗传相似系数具显著或极显著差异。遗传相似系数平均值比较, 多胚四倍体品系0.7264＞单胚杂交组合0.7243＞国外品种0.7060＞多胚二倍体品系0.6908＞单胚品系0.6837。在遗传距离0.20处, 将49个甜菜材料划分为A、B、C、D 4个类群, D类群又分为4个亚类, 较好地显示了甜菜材料丰富的遗传多样性。表明不同甜菜品种具有相当高的异质性, 国外与国内材料的遗传基础存在一定差异, 但生产应用的甜菜品种间存在亲缘关系较近、遗传基础较窄的倾向。     

利用SSR快速鉴定棉花品种真实性和纯度

利用SSR分子标记技术对棉花品种真实性和纯度进行分析研究,旨在为棉花品种提供分子鉴定依据。以具有代表性的棉花品种为材料,经过引物初筛和复筛,确定26对均匀分布于棉花染色体上的SSR核心标记。结果表明,26对核心标记在120份材料中筛选得到138个等位位点,其中129个为多态性位点,多态性比率达93.48%。以标准样品为对照,利用26对核心标记对10份棉花常规种进行真实性鉴定,发现仅有源棉6号与标准品种的DNA图谱高度一致,其他9份常规种与标准品种均存在8~18个差异位点,分子鉴定结果与田间鉴定相符。另外分别筛选5对特征引物作为纯度检测标记,采用单位点平均法统计4份常规棉品种检测结果表明,源棉6号纯度最高,为98.0%,源棉1号最低,为90.5%,检测结果与田间纯度鉴定呈现正相关性。研究表明利用SSR标记技术鉴定棉花品种真实性和纯度的方法完全可行。     

甜菜多重SSR-PCR体系的建立和优化

为了建立甜菜多重SSR-PCR体系,通过利用11对甜菜SSR核心引物,根据SSR扩增产物片段大小的不同,构建甜菜2~5重SSR-PCR反应体系。结果表明,在单一SSR-PCR的基础上,甜菜2~3重SSR-PCR的体系为：每增加一重SSR,仅仅增加相应引物的量以及减少去离子水的量。甜菜4~5重SSR-PCR,要在单一PCR的基础上增加0.5倍DNTPs的含量以及相应引物的量,同时根据个别引物扩增效率的不同,相应减少或者增加0.5倍个别引物的量,并成功的构建了16个4重PCR和9个5重PCR。多重PCR反应能够产生与单一PCR相同的多态性,但是却比单一PCR提高了2~5倍的效率,甜菜多重PCR体系的建立将大大加速甜菜品种纯度和真实性鉴定的速度,也将更快的促进甜菜分子生物学其他领域的发展。