长白山野生膜荚黄芪cDNA文库的构建与初步鉴定

以长白山区野生膜荚黄芪根和叶为试材,参照TRIzoL说明书提取总RNA,采用SMART技术构建其全长cDNA文库,为分子水平上揭示膜荚黄芪次生代谢调控机制提供充足的基因资源。结果表明:原始文库滴度为4.8×105 cfu/mL,重组率接近99.1%,插入片段大于0.5kb,平均大小1.54kb。所构建的cDNA文库的库容量、克隆效率和全长率满足挖掘膜荚黄芪次生代谢相关基因的要求。     

华东葡萄抗白粉病杂种后代cDNA文库的构建及EST序列分析

以抗白粉病的华东葡萄杂种后代6-12-4株系为试材,利用SMARTTM技术构建了白粉病病原菌诱导的全长cDNA文库。经检测,原始文库滴度为2.50×106pfu·mL-1,重组率达到99%,扩增文库滴度为3.0×109pfu·mL-1,重组率达到95%,插入片段长度在500～2000bp。随机挑取300个克隆,测序获得260条质量较高的ESTs,聚类及拼接后,共得到183个一致序列(所获序列已经提交GenBank,登录号为FG579859-FG580039)。经蛋白功能预测分析,获得含有TPR结构域的小的富含谷氨酰胺的蛋白、MYB类转录因子、水通道蛋白、富含脯氨酸蛋白、亲环素蛋白、ACI14蛋白、转脂蛋白等抗病相关基因,涉及到植物的信号转导,胁迫诱导,防卫反应等方面。这些EST序列为利用中国野生华东葡萄进行抗白粉病育种研究和利用提供了有价值的抗病基因片段,为丰富世界葡萄属植物抗白粉病基因提供序列数据。     

‘津田’芜菁消减cDNA文库的构建及分析

 以‘津田’芜菁红色块根和白色块根为材料, 利用SSH技术成功构建了消减cDNA文库并富集相关基因片段。从消减文库中筛选到960个阳性克隆, PCR鉴定插入片段长度主要分布于300～800 bp之间。克隆测序后与GenBank中的同源序列进行比较, 特异基因片段为302个, 其中99个与数据库中的序列具有相似区域且功能已知, 与数据库中序列没有显著同源性及功能未知的序列为203条。     

结球甘蓝留种技术

甘蓝是上海郊区蔬荣生产主要品种之一,也是周年供应的蔬菜品种。郊区的栽培面积较大,单嘉定地区全年有万亩以上,在经济收入中也占很大比重。甘蓝的留种工作对产量的高低和质量的好坏影响很大,目前主要有露地杂交制种与常规留种,具体方法如下。一、露地杂交制种 1.亲本繁殖亲本的好坏直接影响到     

结球甘蓝的地膜覆盖栽培

西吉县位于宁夏南部山区,气候条件适宜发展甘蓝生产,且实行地膜覆盖栽培增产增收潜力大。全县甘蓝年种植面积4000多亩,最大单球净重14.7kg,最高亩产10275kg,平均亩产7432.9kg,总产量3000多万kg,总产值达400万元以上。不仅解决了本县群众吃菜困难问题,而且还销往区内外其它地区,增加了农民收入。     

cDNA文库与RACE方法结合克隆马铃薯DnaJ -like基因全长cDNA

 以青枯病菌小种3号(生化变种2) PO41诱导24 h和48 h的马铃薯抗青枯病基因型ED13叶片为材料, 应用SMART技术构建了一个富集青枯病抗性相关基因的cDNA文库。继而利用RACE技术与该cDNA文库相结合克隆了一个马铃薯分子伴侣基因的全长cDNA。该cDNA长735 bp, 5′端有25 bp的非翻译区, 3′端具有完整的polyA 尾, 包含一个编码177 个氨基酸的完整开放阅读框架( GenBank 登录号:DQ885360) 。该分子伴侣基因与拟南芥DnaJ-like 20的部分核苷酸序列具有84%的一致性, 与其编码的氨基酸序列具有59%的一致性, 暂命名为StDnaJ。目前在马铃薯中尚未发现与之同源的已知基因。半定量RTPCR结果表明, 该基因同时受青枯病菌的诱导和茉莉酸的调节, 可能在青枯病菌和茉莉酸胁迫下具有促使胁迫损害细胞恢复活性的功能。     

结球甘蓝周年栽培技术

结球甘蓝周年栽培技术结球甘蓝又名茴子白，原产地中海沿岸，我国栽培历史不长，但由于其适应性强，产品耐运，可脱水销往国外，含蛋白质高，食用与药用营养丰富，种植和社会效益高，面积扩展快，尤以东北、西北、华北、内蒙冷凉地区栽培面积大。近年来已成为我国主栽和主...     

黄瓜多抗自交系NC-46转基因不定根的高频诱导及其cDNA文库的构建

利用发根农杆菌K599（带有质粒pBIN-35S-GFP）,以具有抗爪哇根结线虫和花生根结线虫等多种抗性基因的黄瓜自交系NC-46离体子叶为外植体,高效诱导出转基因不定根（诱导率达76.7 %）;并在此基础上成功构建了转基因不定根的cDNA文库。构建的cDNA文库重组率为98.3%,原始库容量达2.02 × 106 cfu,其中基因的完整性比率为47.6%,Unigene比例为66.7%。选用转基因不定根构建根的cDNA文库,克服了实生苗难以获得大量均一状态根的缺陷;克服了实生苗根受到土壤根际微生物、线虫等对根生理状态的影响以及对提取RNA的污染问题;利用改良的Smart cDNA文库构建法,获得的文库克隆含有完整的5′端非翻译区的全长cDNA;此外,构建的文库由于利用改良的pUC19载体替代了λTripIEx2噬菌体载体,获得的克隆无需再将插入到噬菌体载体上的cDNA转染到质粒载体,可直接用于杂交和测序筛选,因此在基因克隆筛选时更加方便。     

霜霉病菌侵染的黄瓜叶片cDNA文库的构建及抗病相关基因筛选

以接种黄瓜霜霉病菌的抗病黄瓜品种‘649’的叶片为材料,使用改良SDS法提取总RNA,构建黄瓜叶片全长cDNA文库,得到的原始文库滴度为5.5 × 106 pfu • mL-1,扩增后的文库滴度达6.5 × 109 pfu • mL-1,重组率约为99%,插入片段在0.5 ~ 2.0 kb之间,大多在1.0 kb左右。随机选取3 360个克隆进行测序,共拼接出2 507个unigenes,其中包括211个重叠群（Contigs）和2 296个单拷贝EST（Singlets）。生物信息学分析显示：这些unigenes中存在427条与植物防御/抗病相关的基因,其中包括两类抗病基因和细胞程序性死亡相关基因,这些基因的发现为下一步研究黄瓜抗病机理,克隆抗霜霉病相关基因提供了重要的参考。     

金钗石斛花芽cDNA表达文库的构建及鉴定

 cDNA文库是分离、筛选基因的重要平台。利用SMARTTM cDNA library construction技术, 成功构建了金钗石斛花芽cDNA表达文库。结果表明该文库的克隆数为3.02 ×10⁵ pfu, 插入片段的大小在0.5～2.5 kb范围, 插入片段的重组率接近100% , 说明所构建的cDNA文库质量较好。该文库的构建为克隆与金钗石斛花芽分化相关功能基因奠定了基础。     

枳根cDNA全长文库的构建与分析

为了解柑橘优良砧木枳（Poncirus trifoliata）根部的基因表达信息,利用SMART技术构建了枳的根组织全长cDNA文库。检测结果显示所建枳根原始文库的容量为1.08 × 106 cfu ? mL-1,扩增后文库容量为1.30 × 109 cfu ? mL-1,重组率为95%。通过文库随机测序获得182个长度大于100 bp的ESTs序列（GenBank登录号为JK316116 ~ JK316297）,序列拼接后得到96个Unigenes,包括12个Contigs和84个singletons。其中,68个Unigenes可与GenBank中登录的基因相匹配,56个与已知的柑橘基因相匹配,36个为全长基因。对24个全长基因完成了功能注释,并进一步开展了生物信息学分析,发现有6个应激反应基因和3个根发育相关基因。     

结球甘蓝1号和4号染色体双三体及其初级三体的分离与鉴定

 在结球甘蓝同源三倍体与二倍体杂交子代中, 获得了1个2n + 2的非整倍体植株, 经细胞学鉴定和核型分析, 确认该2n + 2植株为1号和4号双三体, 并由此进一步分离鉴定出了1号和4号两个初级三体。1号初级三体的主要特征是植株矮小, 株高仅为正常二倍体的1 /3左右; 4号初级三体的主要特征是花期提早, 较正常二倍体提早约14 d。1号和4号两个初级三体n + 1雌配子的传递率分别为8.89%和11.54%。     

甘蓝细胞质雄性不育材料的分子鉴定

根据Genebank中orf224和orf138基因序列的保守区设计特异引物,对2个甘蓝不育材料PM、QM的mt DNA进行PCR扩增。试验结果表明,orf138特异引物对2个不育材料的mt DNA扩增出350 bp大小的清晰条带;不育材料的特异片段与萝卜Ogu CMS所具有的Ogu orf138基因同源度达92.55%,长度均为297 bp,因此,初步推断2个不育材料是Ogura胞质雄性不育类型。     

山葡萄低温诱导酵母双杂三框cDNA文库构建和VaCIPK18互作蛋白筛选鉴定

类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL(calcineurinB-likeprotein)与其互作蛋白激酶CIPK(CBL-interacting protein kinase)组成的CBL-CIPK系统,在真核生物钙信号转导及各种胁迫应答途径中发挥重要作用。采用SMART与LD-PCR技术构建了山葡萄‘双丰’(Vitis amurensis Rupr.‘Shuangfeng’)叶片组织低温胁迫下的均一化酵母双杂交三框cDNA文库,库容量分别为1.7×106、1.3×10⁶与1.9×10⁶cfu·mL(-1),外源基因插入片段长度约为500～2 000 bp,重组率为100%,符合后续双杂交筛选要求。以本课题组前期鉴定受低温诱导表达、具有核质亚细胞定位的山葡萄VaCIPK18全长(VaCIPK18)、激酶结构域缺失(VaCIPK18^△S_TKc)以及NAF结构域缺失(VaCIPK18^△NAF)为诱饵,进行酵母双杂交筛选,获得了17个候选互作靶蛋白;从中选取并克隆了7个参与非生物胁迫的候选互...     

甘蓝杂种致死材料的鉴定与遗传分析

杂种致死是一种生殖隔离类型,致死材料的鉴定及遗传分析不仅有助于了解杂种致死的遗传机制,还可以为致死基因的定位和克隆奠定基础。利用已知携带杂种致死基因的甘蓝自交系09-211、09-222、10-260和其他自交系配制的杂交组合为试材,鉴定携带致死基因的新材料,并对甘蓝杂种致死性状进行了遗传分析。结果表明:11-204和11-176是2个新的甘蓝致死材料;11-176与09-222及10-260具有遗传等效性,而11-204与09-211具有遗传等效性;甘蓝杂种致死性状是由2个显性基因互补控制的,其中1个致死基因来自09-211或11-204,另1个致死基因来自09-222或10-260或11-176,其遗传模式符合Dobzhansky-Muller(DM)模式。