新城疫北京强毒株融合糖蛋白（F）基因的克隆及序列分析

ＮＤＶ北京强毒株Ｆ４８Ｅ９经ＳＰＦ鸡胚增殖,超速离心纯化,异硫氰酸胍法提取病毒ＮＡ后,用ＲＴ－ＰＣＲ扩增,得到其融合糖白基因。将扩增产物与ｐＧＥＭ＾Ｒ－Ｔ载体相连接转化,经过ＡｍｐＩＰＴＧ－Ｘｇａｌ（ＡＩＸ）平板筛选,ＨｉｎｄⅢ酶切及ＰＣＲ鉴定,初步获得了含Ｆ基因的阳性克隆。用渐近法对克隆片段进行全序列分析,证明得到了作长１７４４个核苷酸的ＮＤＶ Ｆ蛋白基因。     

反转录—多聚酶链式反应（RT—PCR）快速检测两种大麦土传黄花…

大麦黄花叶病毒和大麦性花叶病毒是由土壤真菌传播并引起大麦黄花叶症状的两种重要病原病毒，用常规方法较难区分这两种不同的病毒。我们以江苏如东、杨州等地的大麦病苗为材料，利用反转录－多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，成功地扩增出了两病毒ＲＮＡ－１ ３‘端区域的１．１ｋｂ左右的特异性片段，建立了这两种病毒的ＲＴ－ＰＣＲ快速检测方法，并对利用ＲＴ－ＰＣＲ技术对该两病毒害进行早期快速诊断的实用性进行了探讨。     

奶牛硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(SCD)启动子的克隆及活性分析

硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是脂肪酸合成过程中的一个主要限速酶,为了研究奶牛脂肪合成的基因调控机制,本研究首先从奶牛组织中克隆得到4个不同长度的SCD基因启动子片段(分别为212、380、416和760bp),采用生物信息学的方法分析了启动子上不同的转录因子结合位点,将克隆片段与pGL3-basic荧光素酶报告基因载体进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切,连接形成重组启动子载体pGL3-SCD1、pGL3-SCD2、pGL3-SCD3和pGL3-SCD4。将载体纯化后,瞬时转染到HepG2细胞,对细胞施加胰岛素(10IU/mL)和亚油酸(120μm)处理,通过双荧光素酶报告基因检测启动子荧光素酶相对活性,结果发现,在SCD启动子序列上存在Sterol-regulated element(SRE)转录因子的结合位点,随着SCD启动子片段长度的延长,启动子活性也显著提高,pGL3-SCD4具有最高的启动子活性。与对照组相比,pGL3-SCD1~4启动子的活性在胰岛素刺激下都显著增强(P<0.05),其中pGL3-SCD4的启动子的相对活性最高,达到了46.93。在亚油酸刺激下,pGL3-SCD1~3的启动子活性没有显著变化,而pGL3-SCD4的活性显著减弱(P<0.05),研究表明pGL3-SCD4启动子上增加的片段(-398~-742)可能对于SCD基因的表达调控具有重要作用。     

草莓多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因（PGIP）的克隆及组织特异性表达

以草莓(Fragaria×ananassa)叶片为试材,采用PCR技术,克隆到1条多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因,命名为FaPGIP.基因组DNA片段包含一个长为168 bp的内含子;cDNA编码区全长999 bp,编码332个氨基酸残基.预测该蛋白质分子量为37.1 kD,等电点为7.67,N端24个氨基酸残基构成的疏水区域为信号肽,具有5个潜在的N-糖基化位点.序列同源比对结果表明,所克隆的FaPGIP基因与GenBank中登录的蔷薇科及其它物种PGIP基因具有较高的同源性.采用SyPred3D软件预测了该基因所编码的蛋白质的三维结构,表明FaPGIP蛋白质的三维模型类似马蹄的结构,含12段α-螺旋和21段β-折叠,中心LRR结构域由10个串联的LRRs基序组成.半定量RT-PCR分析显示,FaPGIP在草莓根、茎、叶、花和果五种组织中均有表达,其表达量为果>叶>花>根>茎,相对表达量分别为0.246 0、0.166 4、1.371 2、0.872 1和3.415 4.     

籽粒苋（Amaranthus cruentus L.）核糖体蛋白S25基因（cDNA）的克隆及其表达分析

Ribosomes, the agents of protein synthesis, consist of roughly equal amounts of RNA (rRNA) and protein (r-protein). Knowledge of the ribosome and its function mainly comes from the extensive work on 70S bacterial ribosomes. There are 21 proteins in the small (30S) subunit and 30 in the large (50S) subunit in E. coil ri bosomes. The 80S eukaryotic ribosomes are more com plex than the bacterial ones and contain at least 30 pro teins in the small (40S) subunit and 40 in the large (60 S) subunit. These r-proteins are named S1 to S30 and L1 to L40 according to whether they arise from the small or large subunit, and to their mobility in gels. In plants, several ribosomal protein genes and/or cDNAs have been isolated, such as the small subunit proteins S 11, S13, S14, S16, and S19 and the large subunit proteins L2, L7, L17, and L27. Here we report the r-protein S25 cDNA, Arps25, from Amaranthus cruentus L.     

PR—1a蛋白基因的克隆及序列分析

以珊西烟草（Nicotina tabacum cv. Xanthi-nc）的基因组DNA为模板，通过合成一对特异性引物，利用多聚酶链式反应（PCR）扩增获得PR－1a蛋白基因。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明：该基因由504个碱基组成，编码168个氨基酸。与已发表序列相比较，核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为99.9%和100％。     

玉米赤霉烯酮降解酶基因（ZEN-jjm）的克隆、表达及活性分析

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是世界上污染范围最广泛的一种镰刀霉毒素,能导致人或动物不孕、流产等症状,损害内脏器官并促进癌细胞的生长.本文通过设计1对特异性引物,从粉红螺旋聚孢霉(Gliocladium roseum)中克隆获得大小为795 bp的DNA片段(ZEN-jjm),通过构建E. coil原核表达载体进行表达.经HPLC检测证实,IPTG诱导后的细胞裂解上清能在3 h内完全降解液体中1μg/mL的ZEN.序列分析结果表明ZEN-jjm与zhd101存在9个碱基的差异,ZEN-jjm编码的ZEN降解酶与文献报道的乳糖水解酶存在3个氨基酸的差异,但ZEN毒素降解实验证实二者活性相似.     

蜂毒溶血肽（melittin）基因的克隆及序列分析

本项研究已克隆在λｇｔ１１载体上的编码蜂毒溶血肽２６个氨基酸的基因经酶切后,亚克隆到大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ的质粒ｐＵＣ １８的ＥｃｏＲＩ和ＰｓＩ位点上,构建成重组质粒ｐＵＭ１８,然后转化感受态的大肠杆菌ＪＭ１０１之中。经对转化子中重组ｐＵＭ１８上蜂窝溶血肽基因的ＰＣＲ扩增检测和序列分析,表明克隆成功。     

玉米颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS )基因cDNA的克隆及植物表达载体的构建

根据已发表的玉米颗粒结合型淀粉合成酶GBSS（granule-bound starch synthase）基因序列,设计两对引物,其中一对为定点突变的过度引物。从授粉后15d的玉米胚乳中提取总RNA,以反转录合成的cDNA第一链为模板,首次用定点突变、RT-PCR、融合PCR的方法克隆了GBSS 基因的全长cDNA（1818bp）片段。序列测定表明,该片段与文献报道的序列具有99.72％的同源性。并构建了以胚乳特异表达性的Gt1为启动子,以NOS-ter为终止子的植物表达载体pBI-Gt1-GBSS,其含有NPT‖选择标记基因。以期实现特定时期GBSS基因在玉米胚乳中的大量表达。     

丹参海藻糖-6-磷酸合成酶基因（SmTPS）的克隆及其表达分析

对丹参EST序列进行Blast分析,得到一条海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）基因,将其命名为SmTPS,GenBank注册号为JF937196。该基因cDNA全长2836 bp,包含一个长为2574 bp的ORF,编码857个氨基酸。生物信息学分析表明,分子量为97.04 kD,等电点为5.76,含α-螺旋、β转角、延伸连和无规则卷曲。该蛋白同时具有海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶（TPP）的功能结构域。系统进化树分析表明丹参TPS功能域和拟南芥AtTPS6属于一类,而TPP功能域与低等生物酵母ScTPS2属于一类。实时定量PCR结果分析表明,SmTPS基因在丹参不同组织器官中差异表达,其茎中表达量最高。在干旱和低温处理下,其表达量与对照相比均可上调约2倍,表明SmTPS基因在丹参抵抗干旱和低温胁迫中发挥一定的作用。     

猪小脂肪细胞因子1（SMAF1）基因cDNA的克隆及表达谱分析

采用比较基因组学和RT-PCR方法，根据人和小鼠SMAF1基因的保守序列，设计简并引物，克隆了猪SMAF1基因的cDNA序列。所克隆片断全长256bp（GeneBank登录号 DQ191892），包括一个编码了81个氨基酸的完整编码区，该序列与人和小鼠的SMAF1基因的相似性分别为86%和78％，预测的氨基酸序列与人、小鼠、大鼠和牛的相似性分别为81％、67％、70%和84%。猪SMAF1基因在脂肪组织中高丰度表达，在4月龄瘦肉型猪（大白猪）脂肪组织中的表达量显著低于脂肪型猪（梅山猪）（P＜0.05）。本研究结果表明，猪SMAF1基因可能具有和其它物种SMAF1基因相似的功能，推测其在脂肪细胞发生和/或脂肪细胞功能中具有重要的调控作用。     

一个水稻与稻瘟病毒菌（Magnaporthe grisea）互作相关新基因的克隆

以水稻抗瘟性近等基因系H7R和H7S为材料，采用PCR－差别筛选（PCR－based differential screening）的方法分离和克隆了一个受稻瘟病菌诱导表达的基因，RIM9b。Northern杂交显示该克隆为受稻瘟病菌诱导的早期反应基因（片段）。其转录丰度在诱导12h达到最高峰。Southern杂交结果表明该基因以单拷贝存在于水稻基因组中。序列分析表明克隆包含一个558bp的开放阅读框，其序列与GenBank中数据无同源性。     

棉花MADS-box蛋白基因（GhMADS-13）的克隆和表达分析

一组具有MADS-box结构域的转录因子在控制花器官的诱导与发育中起着重要作,以中棉所36（CCRI）均一化全长cDNA文库为基础,结合EST测序分析,分离获得一个棉花的MADS-box基因全长cDNA。该基因cDNA全长1079bp,包含一个732bp的完整的开放阅读框,编码234个氨基酸,具有典型的MADS-box结构域和完整的K区,命名为GhMADS-13（GenBank：FJ409870）。与拟南芥、葡萄等植物的AGL6类基因具有高度的同源性。实时定量RT-PCR分析表明,GhMADS-13在CCRI36的花器官发育中早期表达量逐步增加,后期有下降趋势。推测GhMADS-13可能在开花诱导和花器官发育过程中起着重要作用。     

巴西橡胶树4个环锌指蛋白基因（HbRZF）的物理定位

本文利用原位PCR技术和荧光原位杂交技术,对巴西橡胶树4个环锌指蛋白基因（HbRZF）在染色体的位置进行了物理定位分析。结果表明：用原位PCR技术检测到的HbRZF1和HbRZF3扩增信号分别定位于巴西橡胶热研7-33-97品种的第6号和第5号染色体长臂上,信号距着丝粒平均百分距离分别是45.76±3.18和66.33±0.75,信号检出率分别为28.79%和36.70%。用荧光原位杂交技术检测到的HbRZF2和HbRZF4探针信号分别位于第3号和7号染色体长臂上,信号距着丝粒平均百分距离分别为22.25±1.02和40.64±1.44,两种信号同时检出的机率为12.18%。本研究还对这些基因与其他定位的基因之间的连锁关系进行了讨论。     

微紫青霉菌（Penicillium janthinellum）P-type ATPase及金属硫蛋白相关基因的克隆

本研究以高抗多种重金属盐的微紫青霉菌（Penicillium janthinellum）菌株GXCR为材料构建基因组fosmid文库。其插入片段集中在36～50kb,含13348个克隆,重组率为100%,大约覆盖了GXCR基因组的14.83倍。基于序列特异性和简并引物,利用PCR扩增分析了与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）重金属盐抗性相关的CRS5和CUP2基因;基于兼并引物和序列特异性引物,利用PCR扩增分析了GXCR的P-type ATPase基因。通过菌落原位杂交和Southern blot鉴定了一个含铜转运P-type ATPase基因的阳性fosmid克隆,经亚克隆测序分析表明该基因与棒曲霉（Aspergillus clavatus菌株）NRRL1的P-type copper ATPase相似性达97%。没有筛选到与CRS5和CUP2基因同源的克隆,说明GXCR中可能不存在与酿酒酵母CUP2和CRS5高度同源的MT基因,同时也暗示酵母与丝状真菌的重金属盐的抗性机制有本质上的差异或者独特性。     

翘嘴鳜肌球蛋白轻链3b基因（MLC3b）的分子克隆和特征分析

翘嘴鳜以其优良肉质性状近期已成为中国极具商品价值和大力推广的人工养殖名贵鱼类之一。为了解其控制优良肉质性状的遗传基础,本文采用同源克隆RT-PCR方法,获得该鱼肌球蛋白轻链MLC3b基因cDNA序列,该基因cDNA序列为453bp,编码150个氨基酸残基,通过PROSITE tools软件预测显示,该轻链具有两个保守的EF-手相结构和一个C-末端保守序列,且该MLC3轻链N端没有高等脊椎动物特有标志序列。MLC3b基因cDNA序列与MLC3a编码区的同源性达97.7%。本研究结果将为名贵鱼类肉质结构基因及功能的研究提供分子生物学基础。     

玉米Ubi-1启动子驱动挪威鼠热激蛋白4基因（Hspa4）植物表达载体的构建

挪威鼠热激70 kD蛋白4(Rattus norvegicus heat shock protein 4,Hspa4)是哺乳动物细胞内重要的一种分子伴侣,通过参与热激响应、未折叠蛋白应答等来保护机体免受损伤,在适应外界应答时是一种关键性的蛋白质(Kang et al.,2002;Zhao et al.,2007),有阻止蛋白质变性的功能.本研究选用在单子叶植物中活性极强的玉米Ubi-1启动子,构建了可持续、高效表达挪威鼠Hspa4基因的组成型单子叶植物表达载体pCAMBIA1301-Ubi-Hspa4(p13UH),为利用Hspa4提高植物的抗逆性提供资料.     

白菜类富含亮氨酸重复（LRR）抗病蛋白基因BcLRR cDNA克隆及其介导的植物软腐病抗性分析

利用前期构建的软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)菌株BC1侵染诱导表达的大白莱(Brassica campestris subsp.pekinensis)SSH cDNA文库和cDNA芯片.在芯片分析的基础上,选取一个与拟南芥(Arabidopsis thaliana)类富含亮氨酸重复(LRR)抗病蛋白Cf-5高度同源的EST序列(GenBank登录号:DN962361)进行进一步分析.用5'-和3'-RACE方法克隆了该基因全长1 286 bp的cDNA序列,包含一个完整ORF和3'UTR,并具有Poly(A)加尾信号,将其命名为BcLRR基因(GenBank登录号:EU424347).BcLRR推导蛋白序列由327个氨基酸组成,除N端跨膜螺旋结构域外,大部分为LRR结构域,包含8个胞外LRR重复单元,由7个规范的LXXLXLXN结构和1个不规范LXXLXXXN组成.氨基酸序列比对分析发现,BeLRR蛋白与拟南芥类LRR抗病蛋白Cf-5同源性高达96.6%,与棉花(Gossypium hirsutum L.)类LRR抗病蛋白GhLRR同源性为82.3%,它们之间大部分变异限定在N端信号肽区.系统发育关系表明,在三种植物中功能均未知的这一蛋白属于一个新的胞外LRR蛋白类型,在结构上不同于其它抗性已知的胞外型LRR蛋白.将受CaMV 35S启动子驱动的BcLRR基因完整ORF序列转化拟南芥Col-0,PCR鉴定、Southern杂交和RT-PCR分析表明,BcLRR基因已整合到拟南芥基因组中,并在拟南芥中获得了转录.软腐病病情指数分析表明,转BcLRR植株提高了对软腐欧文氏菌的抗性.