布鲁菌疫苗株Rev.1全基因序列的测定与分析

为促进布鲁菌病Rev.1疫苗及相关疫苗的研发, 该研究提取Rev.1疫苗株核酸, 应用PacBio平台进行全基因序列测定与分析。结果表明, Rev.1疫苗株基因组大小约3 299 187 bp, G+C含量为57.2%, 组装为染色体1、染色体2两条环状基因组, 大小分别为2 121 370、1 177 817 bp, G+C含量分别为57.2%、57.3%。将其Ery、BLS和VirB10基因序列与9株GenBank上发表的布鲁菌参考菌株的Ery、BLS和VirB10基因序列进行比较分析, 存在不同程度的差异, 同源性为97.4%~100%。     

布鲁菌疫苗株A19全基因组测序及功能分析

采用Illumina Hiseq和PacBio测序技术对布鲁菌A19进行全基因组测序,并进行GO注释、VFDB注释、ARDB注释、CRISPR以及基因岛预测等生物信息学分析。结果显示:A19全基因组大小为3.28 Mb,GC含量分布未见异常,含1个CRISPR和16个基因岛,通过GO数据库注释发现,参与生物学途径的基因5 311个、细胞组份基因有3 350个、分子功能基因有3 078个;通过VFDB注释发现,与毒力相关的基因82个,主要包括脂多糖(LPS)、纤连结合蛋白、virB四型分泌系统等毒力相关因子;通过ARDB数据库注释发现,与耐药相关的基因1个,该基因的表达产物通过影响焦磷酸异构酶的表达,从而产生对抗生素的耐药。本试验通过A19全基因组测序,为布鲁菌病的治疗和致病机制的研究及疫苗的开发奠定了基础。     

布鲁菌疫苗株S2全基因组测序及功能分析

为找出布鲁菌疫苗株S2基因组分泌性蛋白、参与生物学途径基因、细胞组件基因、分子功能基因、毒力相关因子及耐药基因,对布鲁菌疫苗株S2全基因组测序并进行Ⅲ型分泌系统效应蛋白预测、GO注释、VFDB注释、ARDB注释。全基因组测序结果表明,S2基因组大小约为3.3 Mb,杂合度和重复度较低,GC含量分布未出现异常。通过Ⅲ型分泌系统效应蛋白预测未找出S2分泌性蛋白。通过GO数据库注释,发现参与生物学途径基因有3 823个、细胞组件基因有1 949个、分子功能基因有2 585个。通过VFDB数据库注释,找出S2基因组有79个毒力相关基因,其中最大基因为8 604bp,最小基因为180bp。通过ARDB数据库注释,找出S2基因组有13个耐药基因,最大基因为3 225bp,最小基因为333bp;其中功能注释的有GL002835基因,是枯草杆菌肽类基因,此基因耐受抗微生物类药物。本研究为进一步了解布鲁菌S2基因组基本功能奠定了基础。     

布鲁菌S2疫苗株的核酸探针检测方法的建立

为了鉴别布鲁菌疫苗免疫和自然感染,建立鉴别布鲁菌S2疫苗株与其他菌株的斑点杂交法。针对布鲁菌基因序列保守区S2疫苗株与其他菌株的差异设计探针,同时根据差异部分设计引物进行PCR扩增;PCR产物经过回收、纯化、变性后固定在NC膜上,与探针杂交、显色。结果显示,PCR引物能够对S2疫苗株扩增出约330bp的核酸片段,对其他布鲁菌扩增出约360bp的核酸片段;探针只能和S2疫苗株的PCR产物杂交,最低检测到10pg DNA,能够在10h内鉴别出布鲁菌S2疫苗株。     

布鲁菌基因缺失疫苗侯选株研究进展

布鲁菌病是由布鲁菌引起的人兽共患传染病,接种疫苗是预防和控制该病最有效的方法之一。目前国内外使用的疫苗主要是减毒活疫苗,这种活疫苗具有一定的毒力,但不能区分野毒感染与疫苗免疫产生的抗体,会干扰该病的检疫,国内外许多研究者致力于基因缺失标记疫苗。论文综述了近年来布鲁菌基因缺失疫苗株的研究及应用概况,以加深对布鲁菌病新型疫苗的认识。     

2株鸡新城疫病毒的F基因序列测定及其遗传变异分析

将内蒙古地区呼和浩特市和包头市获得的两株鸡新城疫病毒分离株纯化培养后,提取病毒RNA,用一步法RT—PCR扩增F基因,测出F基因的全部核苷酸序列为1662bp,编码554个氨基酸。与国内外发表的部分NDV病毒的核苷酸序列进行比较。结果表明,这两株分离株核苷酸同源性为97．5％,与标准毒株F48E9的同源性分别为86．8％和85．8％。与长春、广东、广西、山东、河北、浙江、韩国等地的NDV的同源性在96.3％-98．8％之间。并且这2株分离株F蛋白的裂解位点氨基酸组成为112R—R-Q—K—R—F117,具有典型的强毒株裂解位点的特点。     

中国牛种布鲁菌弱毒疫苗株A19 SNP位点的研究

为鉴别我国牛种布鲁菌弱毒疫苗株A19与野生菌株,运用生物信息学方法结合基因测序,对疫苗株A19基因组SNP位点分析筛选,选取其中部分SNP位点,通过与布鲁菌常见种、生物型标准参考菌株和弱毒疫苗株基因组SNP位置核苷酸测序比较,验证SNP位点的A19特异性。结果表明,共筛选获得A19基因组29个SNP位点,验证ClpX G825-C825、LysR A605-C605、Omp2b G503-A503这3个SNP位点为A19（或S19）特异,揭示了A19基因组SNP位点分布情况,为疫苗株 A19与野生菌株鉴别提供了分子依据。     

猪圆环病毒2型乌鲁木齐分离株全基因序列遗传变异分析

为分析乌鲁木齐市猪圆环病毒2型(PCV2)遗传变异情况,对疑似感染PCV2组织样品的全基因组进行PCR扩增、克隆和测序,并进行序列比对与遗传进化分析。结果表明,测序的5株PCV2基因组3株全长为1 766 bp,2株全长为1 767 bp,5株PCV2核苷酸序列同源性在96.1%~99.5%之间,与Gen Bank国内外已发表的17株PCV2基因核苷酸序列同源性在94.5%~99.7%之间;遗传进化树显示,3株属于新出现的PCV2d亚型毒株,2株属于国内优势流行的PCV2b亚型毒株。     

猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组的遗传变异分析

参照已发表的猪瘟病毒基因组序列设计了9对引物，用RT-PCR从猪瘟兔化弱毒疫苗株细胞培养物中扩增得到了覆盖猪瘟病毒基因组全长的9个cDNA片段，将所得cDNA片段分别克隆至pMD18-T载体中，经测序和拼接后，获得了猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全序列。序列分析表明，猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全长12310个碱基，其5’非编码区（5＇-NCR）和3＇-NCR分别由373和239个碱基组成，在3’末端有富含T的碱基插入，其间为1个大的开放阅读框架，编码3898个氨基酸残基的多聚蛋白，与国内外已发表的另外7个猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全序列相比，核苷酸同源性为98．7％～99．9％，氨基酸同源性为98．6％～99．9％。基因组全序列比较显示，猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组在遗传上相当稳定。     

布鲁菌S2疫苗株免疫牛与牛种、羊种布鲁菌自然感染牛ELISA鉴别诊断方法的建立

为建立区分猪种布鲁菌S2疫苗株接种奶牛与布鲁菌自然感染奶牛,BLAST比对分析羊种、牛种、猪种、犬种、沙林鼠种和绵羊种6种布鲁菌基因序列,发现repA—related基因是猪种布鲁菌与牛种及羊种布鲁菌的差异基因。设计引物PCR扩增获得repA-related基因片段,克隆并原核表达得到了布鲁菌repA—related融合蛋白,以repArelated蛋白建立间接EI．IsA检测方法。用repA—related蛋白间接ELISA检测猪种s2疫苗株接种动物血清为阳性,检测牛种和羊种布鲁菌自然感染动物血清为阴性。repA—related蛋白间接EusA能从试管凝聚实验（SAT）及常规ELIsA检测阳性的奶牛血清样本中,区分出s2疫苗接种牛与牛种布鲁菌感染牛。     

布鲁菌S2疫苗株免疫牛与牛种、羊种布鲁菌自然感染牛ELISA鉴别诊断方法的建立

为建立区分猪种布鲁菌S2疫苗株接种奶牛与布鲁菌自然感染奶牛,BLAST比对分析羊种、牛种、猪种、犬种、沙林鼠种和绵羊种6种布鲁菌基因序列,发现repA-related基因是猪种布鲁菌与牛种及羊种布鲁菌的差异基因。设计引物PCR扩增获得repA-related基因片段,克隆并原核表达得到了布鲁菌repA-related融合蛋白,以repA-related蛋白建立间接ELISA检测方法。用repA-related蛋白间接ELISA检测猪种S2疫苗株接种动物血清为阳性,检测牛种和羊种布鲁菌自然感染动物血清为阴性。repA-related蛋白间接ELISA能从试管凝聚实验(SAT)及常规ELISA检测阳性的奶牛血清样本中,区分出S2疫苗接种牛与牛种布鲁菌感染牛。     

小鼠阴道黏膜接种布鲁菌S_2疫苗株树突状细胞动力学变化

将25只小鼠随机分为5组,1~4组经阴道接种布鲁菌,第5组阴道滴注PBS(对照组),分别在处理后12、24、487、2 h摘取髂内淋巴结,用S-100抗体进行免疫组织化学染色,观察小鼠树突状细胞(Dendritic cells,DCs)在淋巴结的分布变化;同时收集外周血用ELISA法进行IFN-γ检测。用布鲁菌负载DCs,分别在2、4、6、8、10、12 h收集细胞悬液制备涂片,姬姆萨染色。结果显示:阴道接种布鲁氏菌疫苗12~48 h髂内淋巴结中DCs的数量明显增多,成群分布,呈现由浅层皮质向副皮质区迁移的趋势;72 h后大量DCs呈单在分布,分布范围增大;接种疫苗后血清中IFN-γ含量逐渐升高,至48 h,与对照组相比差异显著(P0.05),72 h后,血清中IFN-γ含量达到最大值,与对照组相比差异极显著(P0.01);布鲁菌负载DCs后,在4 h仅有少量DCs吞噬布鲁菌,至12 h吞噬布鲁菌的DCs数量明显增加。结果表明,DCs具有较强捕获布鲁菌的能力,并在抗原刺激下向引流淋巴结迁移,刺激淋巴结免疫细胞产生IFN-γ应答。     

布鲁菌分子标记菌壳株的构建与鉴定

旨在构建一种安全、高效的犬布鲁菌分子标记疫苗株。本试验将温控裂解部件(TLC)插入布鲁菌自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419中,构建温控裂解型自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419-TLC;通过电转化方式转入犬布鲁菌RM6/66感受态中,经卡那抗性和蔗糖培养基的正、负向筛选,将TLC片段定点插入布鲁菌B0419基因中,获得犬布鲁菌分子标记菌壳株。采用PCR法对连续30代次的菌株进行鉴定,结果显示裂解E基因和靶向插入位点区域(B0419基因)并未出现丢失和回复突变现象,表明该菌壳株具有良好的遗传稳定性。该菌壳株在培养至D_(600)值为0.6时,经42℃诱导60 h后,可获得裂解率达100%的犬布鲁菌菌壳;经超薄切片和染色处理后,在透射电镜观察下可见形态完整的空心结构,其内容物明显减少。本试验结合细菌菌壳技术与同源重组技术,成功构建了具有分子标记特征的犬布鲁菌菌壳株,为新型布鲁菌疫苗的研制提供策略。     

布鲁菌病防控技术

主要分析了布鲁菌病的病原、易感动物、传播途径等,同时提出了具体可行的防控措施,以期为临床有效防控布鲁菌病提供参考。     

布鲁菌病防控技术

主要分析了布鲁菌病的病原、易感动物、传播途径等,同时提出了具体可行的防控措施,以期为临床有效防控布鲁菌病提供参考。     

四川彭州猪流行性腹泻流行株全基因序列测定及其遗传变异分析

为了对四川省彭州某免疫过猪流行性腹泻病毒（PEDV）疫苗猪场猪感染的PEDV毒株基因组特征和遗传变异规律进行研究,本试验采用RT-PCR法筛选PEDV阳性样本,命名为SCXM株,对全基因组序列克隆测序获取全基因组序列,并对主要结构基因进行遗传变异分析和系统进化分析。结果显示,SCXM株的遗传变异主要集中在S基因,与71个毒株相比同源性为90.4%~99.2%,与猪场免疫疫苗株CV777相比同源性仅为93.8%。与国内常用疫苗毒株相比,在5个线性抗原表位（P1、S1P2、S1P3、SS5和SS6）和1个中和抗原表位（SID）均存在氨基酸位点突变。遗传进化分析表明,SCXM株属于G2b亚型PEDV,与湖北HBXY3株和越南毒株同在一个分支,表明这些地区流行毒株的演化过程存在相关性。另外对ORF3、M和N基因分析结果显示,SCXM与疫苗株相比均存在一定数量的氨基酸突变,但变异程度相对较小,且未引起抗原性预测值的变化。结果表明,PEDV SCXM株属新型变异毒株,其S基因发生较大程度的变异,S基因多个氨基酸突变和抗原性的变化可能是导致猪场疫苗免疫失败的原因之一。本研究丰富了PEDV基因学研究资料,探讨了SCXM株PEDV遗传变异和演化特征,为PEDV的分子演化研究奠定了基础。     

四川彭州猪流行性腹泻流行株全基因序列测定及其遗传变异分析

为了对四川省彭州某免疫过猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗猪场猪感染的PEDV毒株基因组特征和遗传变异规律进行研究,本试验采用RT-PCR法筛选PEDV阳性样本,命名为SCXM株,对全基因组序列克隆测序获取全基因组序列,并对主要结构基因进行遗传变异分析和系统进化分析。结果显示,SCXM株的遗传变异主要集中在S基因,与71个毒株相比同源性为90.4%～99.2%,与猪场免疫疫苗株CV777相比同源性仅为93.8%。与国内常用疫苗毒株相比,在5个线性抗原表位(P1、S1P2、S1P3、SS5和SS6)和1个中和抗原表位(SID)均存在氨基酸位点突变。遗传进化分析表明,SCXM株属于G2b亚型PEDV,与湖北HBXY3株和越南毒株同在一个分支,表明这些地区流行毒株的演化过程存在相关性。另外对ORF3、M和N基因分析结果显示,SCXM与疫苗株相比均存在一定数量的氨基酸突变,但变异程度相对较小,且未引起抗原性预测值的变化。结果表明,PEDV SCXM株属新型变异毒株,其S基因发生较大程度的变异,S基因多个氨基酸突变和抗原性的变化可能是导致猪场疫苗免疫失败的原因之一。本研究丰富了PEDV基因学研究资料,探讨了SCXM株PEDV遗传变异和演化特征,为PEDV的分子演化研究奠定了基础。     

一株鹿源牛种布鲁菌的鉴定及全基因组分析

本研究旨在对一株鹿源牛种布鲁菌(Brucella abortus)BJ1进行全面鉴定,为研究鹿的布鲁菌病提供参考。将B.abortus BJ1培养后,挑取单菌落分别接种到含硫堇或碱性品红的TSA培养基,观察其生长状态;将接种有B.abortus BJ1的TSA平板分别置于普通生化培养箱和CO_2培养箱37℃培养72 h,观察其对CO_2的依赖性;通过醋酸铅培养基测定B.abortus BJ1生长过程中是否产生H_2S;通过结晶紫染色和热凝集试验测定B.abortus BJ1的表型;通过平板凝集试验测定B.abortus BJ1单因子血清反应性;采用AMOS-PCR鉴定细菌种属;为测定其毒力,以1×10~9CFU感染豚鼠,14 d后测定豚鼠每克脾组织的含菌量。使用二代测序方法测其全基因组序列并对其进行分析和注释,将结果与B.abortus 2308比对,并通过Mauve软件进行系统进化分析。结果显示:B.abortus BJ1不依赖CO_2,产H_2S,可以在含硫堇和碱性品红的培养基上生长;表型为光滑型,与M因子血清发生凝集;豚鼠脾含菌量为1.17×10~6～2.05×10~6CFU·g~(-1);基因组大小为3 270 584 bp,在基因编码区内与B.abortus 2308株相比有46处Indel差异,进化树分析显示与B.abortus 8416有较高的同源性。通过全面鉴定,确定B.abortus BJ1为牛种9型,为更深入地了解我国布病发生情况和鹿的布病防控提供参考。     

山羊痘云南流行毒株及疫苗株P32基因序列分析

将本实验室分离到的山羊痘病毒云南流行毒株MYS、XW、XD及疫苗株VF4主要结构蛋白基因P32基因克隆到PMD18T载体后进行双向测序,所得序列与Genbank中羊痘病毒属成员:山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)、疙瘩皮肤病病毒(SLDV)参考毒株相应序列作对比分析(ByClustalWMethod),结果显示:(1)MYS、XD毒株P32基因全长969bp,疫苗株VF4为974bp,XW毒株为975bp。(2)XW、疫苗株VF4在100～105bp位置处均插入6个A,在947bp位置缺失一个T;SPPV参考毒株在169～171bp位置插入GAT。(3)由于疫苗株VF4P32基因核苷酸序列第414位置处发生了T/A突变,在该处形成一个新的终止密码子TAA,导致完整的开放读码框架(ORF)被打断,只表达第1～411bp(137个Aa)的基因片段,而不能表达出完整的P32蛋白。其余6株毒株的开放读码框架均很相似。(4)在所构建的系统发生树中,LSDV与SPPV参考毒株、MYS和XD株、VF4和XW株、GTPV参考毒株各被划分为一组。所有7个毒株P32基因核苷酸序列的同源性都很高,均在97%以上。其中疫苗株VF4与SPPV参考毒株的同源性最低,为97.6%。XD与XW毒株的同源性最高,为99.8%。(5)酶切位点分析结果显示,MYS、XW、XD、VF4及GTPV和SLDV参考毒株具有唯一的HinfI酶切位点,大约在第694bp位置。SPPV参考毒株具有2个HinfI酶切位点,分别在第391bp和691bp位置处,该酶切位点较适合用来鉴别山羊痘和绵羊痘病毒,而疙瘩皮肤病在临床上就很容易与山羊痘和绵羊痘鉴别开来。     

羊布鲁菌强毒株16M与疫苗株M5外膜蛋白蛋白质组学研究

通过比较蛋白质组学分析M5生存表型的改变所引起的蛋白图谱与强毒株的差异之处,根据这些差异表达蛋白的LC/MS-MS鉴定结果来分析疫苗株的致弱机制进而为寻找新的毒力相关分子、鉴别诊断分子以及揭示布鲁菌胞内寄生机制提供帮助。本研究利用比较蛋白质组学技术,对布鲁菌强毒株16 M和弱毒株M5的外膜蛋白进行了差异比较分析,结果共发现33个差异蛋白点,代表了26个开放阅读框,这些蛋白涉及了蛋白质的生物合成(5/26)、氨基酸合成(3/26),脂肪酸代谢(2/26)、能量代谢(5/26),以及细胞被膜生物合成(4/26)和一些调节系统(4/26)等多个生物过程。这些发现为研究外膜蛋白在布鲁菌毒力,胞内寄生等过程中发挥的重要作用提供了新依据。