云南省2株鹿流行性出血热病毒的分离鉴定

为了监测云南省反刍动物鹿流行性出血热病毒(epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)的感染情况,本试验在云南省师宗县设立了监控点,筛选出EHDV抗体阴性的10头牛和5只羊作为哨兵动物,每年的5～10月份每周采血1次,11月到次年4月份每月采血1次,通过酶联免疫吸附试验监测其抗体转阳情况,用转阳牛的红细胞接种BHK以分离病毒,用病毒RT-PCR和中和试验鉴定病毒。结果显示,从2头转阳牛的抗凝血中分离到2株EHDV,其TCID₅₀分别为10^-2.5/0.1 mL和10^-3.44/0.1 mL,血清型均为EHDV-5型。本试验在云南省分离到EHDV,明确了云南省反刍动物存在EHDV感染,为我国监控EHDV流行情况及疫病风险防范提供了重要借鉴意义。     

流行性出血病病毒(EHDV)血清7型毒株在中国的首次分离与鉴定

流行性出血病(EHD)是由流行性出血病病毒(EHDV)感染反刍动物引起的一种虫媒病毒病,为了解中国云南EHDV的感染情况和病毒遗传特征,笔者课题组在云南省师宗县以EHDV血清学和核酸阴性的牛、羊为哨兵动物,拟对流行于云南省的EHDV进行分离与鉴定。将采集于哨兵动物的EHDV核酸阳性血液接种BHK-21细胞进行病毒分离;通过血清中和试验与病毒Seg-2、Seg-3 ORF区的序列分析,确定病毒的血清型与遗传特征;采用C-ELISA和qRT-PCR方法对EHDV感染动物血液中的抗体水平与病毒核酸进行监测。结果如下:从2013年8月采集自云南师宗县哨兵牛的血样中分离出一株EHDV(毒株号YNSZ/V269/2013),血清中和试验结果表明分离的病毒为血清型7型(EHDV-7);Seg-2、Seg-3序列分析表明分离的病毒属EHDV-7 Eastern型,与日本毒株和澳大利亚EHDV-7型毒株具有最近的亲缘关系。哨兵动物病毒核酸转阳后,血清抗体迅速上升,3周后达最高点并能在该水平持续较长时间,而病毒核酸含量却迅速下降,7周后已经检测不到。本研究首次报道了EHDV-7型毒株在中国的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性。研究结果可为进一步开展中国EHDV-7型病毒的全基因组测序、流行病学调查、诊断方法的建立和致病性等相关研究提供基础。     

云南边境地区流行性出血热病毒血清学监测及血清型鉴定

为了解近几年云南边境地区牛、羊流行性出血热病毒（EHDV）的感染和流行情况,本研究从2014年起连续3年在与老挝、越南接壤的江城县设置EHDV监测点,每年选择投放EHDV抗体阴性的10头牛和5只山羊作为哨兵动物进行跟踪监测。每年5~10月份对哨兵动物采血,每周1次,11、12月每月采集一次,进行EHDV抗体、抗原监测和病毒分离。针对致细胞病变的样品,采用EHDV群特异性S7基因片段引物进行RT-PCR方法检测,同时利用EHDV-1、-5、-6、-7、-10标准阳性血清对分离到的病毒进行中和试验鉴定。结果显示,2014－2016年江城县牛EHDV抗体阳性率分别为41.9%、58.6%和75.4%;3年期间共监测到15头EHDV抗体阳性黄牛,并从中分离到20个可致细胞病变样品,经RT-PCR确认为EHDV,遗传进化分析发现有11个毒株与1997和2003年日本分离的EHDV毒株亲缘关系较近,9个毒株与1977和1981年澳大利亚分离的EHDV毒株亲缘关系较近,5个毒株与2015年广西分离株的亲缘关系较近;3年期间在山羊体内未检测出抗体,未发现抗原阳性动物;经中和试验血清型鉴定,确定20株毒株包括EHDV-5、-6、-7、-10型4种血清型,感染时间均在5~9月之间。本研究发现,江城县长期存在多种血清型EHDV同时流行,2014－2016年EHDV抗体阳性率逐年增加,亟需加强对EHDV感染情况及活动规律的持续研究,提高流行性出血热的防控效率。     

云南边境地区流行性出血热病毒血清学监测及血清型鉴定

为了解近几年云南边境地区牛、羊流行性出血热病毒(EHDV)的感染和流行情况,本研究从2014年起连续3年在与老挝、越南接壤的江城县设置EHDV监测点,每年选择投放EHDV抗体阴性的10头牛和5只山羊作为哨兵动物进行跟踪监测。每年5～10月份对哨兵动物采血,每周1次,11、12月每月采集一次,进行EHDV抗体、抗原监测和病毒分离。针对致细胞病变的样品,采用EHDV群特异性S7基因片段引物进行RT-PCR方法检测,同时利用EHDV-1、-5、-6、-7、-10标准阳性血清对分离到的病毒进行中和试验鉴定。结果显示,2014-2016年江城县牛EHDV抗体阳性率分别为41.9%、58.6%和75.4%;3年期间共监测到15头EHDV抗体阳性黄牛,并从中分离到20个可致细胞病变样品,经RT-PCR确认为EHDV,遗传进化分析发现有11个毒株与1997和2003年日本分离的EHDV毒株亲缘关系较近,9个毒株与1977和1981年澳大利亚分离的EHDV毒株亲缘关系较近,5个毒株与2015年广西分离株的亲缘关系较近;3年期间在山羊体内未检测出抗体,未发现抗原阳性动物;经中和试验血清型鉴定,确定20株毒株包括EHDV-5、-6、-7、-10型4种血清型,感染时间均在5～9月之间。本研究发现,江城县长期存在多种血清型EHDV同时流行,2014-2016年EHDV抗体阳性率逐年增加,亟需加强对EHDV感染情况及活动规律的持续研究,提高流行性出血热的防控效率。     

2013—2016年云南省江城县牛羊蓝舌病血清流行病学调查

为了解近年来云南省江城县蓝舌病病毒（BTV）的感染和流行情况,从2013年5月至2016年4月连续3年在江城县设立监控动物群,每年选择BTV病原及抗体检测阴性牛10头、羊5只作为哨兵动物,用于BTV抗体监测和病毒分离。应用BTV C-ELISA抗体检测试剂盒,对哨兵动物进行血清抗体检测,应用鸡胚、C6/36细胞和BHK-21细胞进行病毒分离。结果显示：连续3年的哨兵动物BTV抗体阳性率分别为40.35%、44.08%、50.65%; 3年内共分离到45株BTV,包括1~5型、15~16型、21型和24型共9种血清型。结果表明,江城县蓝舌病流行有逐年加重趋势,且呈现多种血清型毒株交叉感染状况,亟需加大BTV监测力度,及时发现毒株变化。     

广东一株牛源流行性出血病病毒的分离鉴定

为了解广东反刍动物流行性出血病(EHD)的感染情况,本研究对采集的牛血液样品进行EHD病毒(EHDV)的RT-PCR检测,对核酸检测为阳性的样品进行病毒分离鉴定。将阳性样品接种BHK-21细胞连续传3代时出现细胞病变,扩增出了VP7基因,进行BLAST序列比对,结果表明该分离株与国内外EHDV分离株的同源性达98%~100%,TCID_(50)为10~(-6.5)/50μL,不能凝集鸡红细胞,表明该分离株为EHDV,命名为GD-N133。根据VP2基因序列的分析和微量中和试验结果,确定该病毒株为EHDV-1型。     

2019年云南省景洪市哨兵动物多种虫媒病毒的分离鉴定

本研究旨在了解云南省景洪市虫媒病毒的流行情况。2019年在景洪市勐罕镇设立了3头哨兵动物牛,定期采血进行虫媒病毒的分离与鉴定,共获得7株病毒分离物。经病毒核酸的RT-PCR鉴定,分离到2株血清型分别为6型和7型流行性出血热病毒（epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV）,2株血清型分别为4型和5型的蓝舌病病毒（bluetongue virus,BTV）,1株帕利亚血清群病毒（palyam serogroup virus,PALV）中的D’Aguilar virus（DAV）血清型病毒和2株未鉴定出的环状病毒。经病毒Seg-2、Seg-3序列ORF区的比对和进化分析显示,7株病毒的地域型均为Eastern型,与日本、澳大利亚和印度毒株具有最近的亲缘关系。3头哨兵动物的血液和血清,经病毒核酸及血清中和试验检测,证明3头动物均被相应的病毒感染。动物感染病毒后,血清中的特异性抗体迅速上升,3~4周后达最高点并能够在该水平维持较长时间,而血液中病毒核酸含量2~4周到达最高点后则呈迅速下降趋势。本研究报道了景洪虫媒病毒的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性,研究结果为进一步了解当地的牛虫媒病毒提供数据支撑,同时3头牛分离获得7株病毒,提示当地可能还存在更多种类的虫媒病毒。     

阿卡斑病毒在云南省哨兵山羊的分离鉴定及其感染回溯分析

为了解云南省山羊中阿卡斑病毒(AKAV)的分子遗传特征及自然感染规律,本研究于2019年在云南省师宗县设立哨兵羊,定期采集血液样品,将核酸检测为AKAV阳性的样品接种BHK-21细胞进行病毒的分离,结果显示,从哨兵羊分离出3株AKAV(V287/YNSZ/2019、V288/YNSZ/2019和V289/YNSZ/2019),分离株可致BHK-21细胞出现圆缩、裂解的细胞病变(CPE)。对分离株经电镜观察可见病毒粒子呈球形,直径在100 nm～130 nm,表面有纤维状突起。通过PCR扩增其S、M与L基因,并测序与序列分析后分别构建S、M与L基因的进化树。结果显示分离的3株AKAV的S、M与L基因序列之间高度同源;系统发育分析结果显示,分离株与中国株亲缘关系最近,与其他亚洲株的亲缘关系次之,与澳大利亚及非洲株的亲缘关系最远;分离株的S及M基因归属于AKAV基因Ia型,L基因则与中国株共同形成"中国支系"。对定期采集的AKAV感染山羊血液中的病毒核酸及抗体进行动态监测,结果显示,AKAV核酸在感染动物血液中仅存在一周,而AKAV特异性抗体则可持续9周以上。本研究首次在中国云南山羊中分离到AKAV,并证实从感染动物血液中分离AKAV的最佳窗口期为病毒感染后的第1周,对有效开展AKAV的分离工作具有一定的指导意义。     

中国蓝舌病病毒血清2型病毒株的分离与鉴定

为了解我国云南省蓝舌病病毒(BTV)的流行情况和基因分型,本研究在云南师宗、江城、芒市分别设立监控点,通过对哨兵动物定期采血监控其血清学转阳情况,采用"鸡胚-C6/36细胞-BHK-21细胞"接种方式分离病毒,利用qRT-PCR及中和试验鉴定病毒,通过特异性引物对分离株Seg-2及Seg-7序列的ORF区进行RT-PCR扩增与克隆测序。结果显示,从2017年6月师宗县牛的抗凝血中分离到一株BTV,鉴定为BTV-2型,TCID_(50)为10~(-4.88)/50μL。分离株Seg-2及Seg-7序列的系统发生树显示其Seg-2序列和日本以及台湾BTV-2株的Seg-2序列相似度较高,同为BTV-2型,而Seg-7序列和台湾BTV-2株以及日本BTV-21株亲缘关系最近,同为Eastern 2型。本研究分离鉴定了BTV-2型病毒株YN/SZ/22457,并掌握了分离株Seg-2及Seg-7序列的遗传特性,明确了云南省存在BTV-2的流行。本研究为进一步开展BTV-2型的流行病学、感染特性研究奠定了基础。     

云南省中山病毒的分离鉴定

为掌握云南省虫媒病毒的流行情况及基因分型,本试验在云南省师宗、江城和芒市设立监控点,对哨兵动物定期采血来监测其血清转阳情况,将阳性样品在BHK上传代以分离病毒,用RT-PCR及MNT鉴定病毒,通过特异性引物扩增分离毒株的Segment2 (Seg-2)及Segment7(Seg-7)基因片段来分析其遗传特性。结果显示,在2014年从师宗监控点分离得到4株帕利亚姆病毒(PALV),经鉴定均为中山病毒(Chuzan virus,CHUV),并掌握了分离株Seg-2及Seg-7基因片段的遗传特征。本试验确认了CHUV在云南省的分离,为进一步掌握CHUV在中国的流行病学、致病性以及疫苗研究奠定良好基础。     

蓝舌病病毒血清9型毒株在我国的首次分离

旨在分离流行于我国云南省的蓝舌病病毒(BTV),掌握分离BTV的遗传特征与感染特性。采用"鸡胚—C6/36细胞—BHK-21细胞"接种的方式,采集哨兵牛的BTV阳性血液进行病毒分离;采用血清中和试验以及Segment 2与Segment 6ORF区的克隆测序确定分离病毒的血清型;通过病毒噬斑形成和增殖曲线的测定,分析病毒在BHK-21细胞的增殖特性;通过qRT-PCR与血清中和试验分析BTV感染动物血液中病毒含量与中和抗体动态变化情况。结果显示:2013年8月,在云南芒市设定的哨兵牛中分离出一株BTV(毒株号V013/YN/2013),血清中和试验显示V013/YN/2013为BTV-9型病毒,Segment 2与Segment 6序列分析表明分离的病毒属BTV-9Eastern型,与日本毒株和澳大利亚BTV-9型毒株具有最近的亲缘关系。病毒噬斑与增殖曲线测定结果显示V013/YN/2013在BHK-21细胞上增殖能力明显强于BTV-9型参考毒株。自然感染V013/YN/2013的牛在连续5个月的监控期内未出现临床症状,感染动物虽产生了特异性中和抗体,但血液中始终能持续检测到病毒核酸。本研究首次报道了BTV-9Eastern型毒株V013/YN/2013在我国的分离,为进一步开展中国BTV-9型病毒的全基因组测序、诊断方法的建立、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。     

鹿流行性出血病病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了更好的研究鹿流行性出血病病毒(EHDV)的生物学特性和建立EHDV免疫学检测方法,本研究用纯化的EHDV免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,获得了2株(1A5和8H6)能够稳定分泌抗EHDV单抗的杂交瘤细胞株.其细胞培养上清效价分别为1∶256和1∶512,腹水效价分别为1∶1 024 000和1∶2 048 000;McAb 1A5和8H6 的相对亲和力分别为0.9 mg/L和0.7 mg/L.间接ELISA结果显示,2株单抗仅与EHDV反应,不与蓝舌病病毒、赤羽病病毒、水疱性口炎病毒、小反刍兽疫病毒和BHK细胞反应,表明2株单抗特异性良好.这2株单抗的获得为研究EHDV生物学特性和建立EHDV检测方法奠定了基础.     

一株新型牛源流行性出血病病毒的分离与鉴定

为分析云南省动物流行性出血病病毒(EHDV)的流行情况,本研究将2018年采集的280份牛EDTA抗凝血液样品通过EHDV群特异性qRT-PCR和血清型特异性qRT-PCR方法进行病毒核酸检测,利用竞争性ELISA(C-ELISA)检测牛常规血液样品中的抗体水平,将EHDV核酸阳性牛血液样品先接种白纹伊蚊(C6/36)...     

流行性出血热及其检测技术的研究进展

流行性出血热(epizootic hemorrhagic disease, EHD)是由节肢动物库蠓叮咬引起的一种在全世界野生及家饲有蹄动物中广泛分布的非接触性虫媒病毒病,目前至少有9种血清型,其中有7种在我国流行。流行性出血热病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus, EHDV)主要感染鹿和牛,羊和其他反刍动物为无症状感染,给养殖业造成了严重损失。检测EHDV的方法有很多,主要以分子生物学和血清学检测方法为主。文章就EHD的病原学、流行病学及检测方法等方面进行综述,重点总结了该病的检测方法,以期为相关研究提供参考。     

广西地区水牛E2型牛肠道病毒的分离和鉴定

为了解广西地区水牛感染中肠道病毒(BEV)的情况，本研究在广西南宁某水牛规模养殖场腹泻粪便样品中成功分离出2株BEV,分别命名为GXNN2106和GXNN2102。将2株病毒空斑纯化后测定GXNN2106毒株TCID₅₀为10^7.99/0.1 mL,GXNN2102毒株TCID₅₀为10^7.37/0.1 mL。多步生长曲线结果显示，GXNN2106毒株在MDBK细胞中复制增殖良好。经BEV VP1、5′UTR特异性引物逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定，2株病毒均属于E2型，与其他E2型BEV 5′UTR核苷酸同源性为75.7%～78.6%,VP1核苷酸同源性为87.1%～91.1%。本研究首次在广西地区水牛粪便中分离得到E2型BEV毒株，为广西水牛源牛肠道病毒的流行分布情况和疫苗的研发提供数据支持。     

云南黄牛血液中阿卡斑病毒的分离鉴定及S基因序列分析

为了解阿卡斑病毒在云南师宗的流行情况及病毒的遗传特征,本研究在云南师宗设立哨兵动物,2014年5～11月每周1次连续采集血清、血液样品,血清用做AKAV抗体检测,血液在C6/36、BHK-21、MDBK和Vero细胞上进行病毒分离工作,用S基因特异引物对阳性分离物进行鉴定及序列分析。结果显示,15头哨兵动物共采集到28批420份血清、420份血液样品,其中有3头牛和1只羊感染AKAV,从这些样品中分离获得2株AKAV(编号09312D和09312H),它们在BHK-21和MDBK细胞上48 h产生明显CPE。2株新分离AKAV的S片段序列核苷酸同源性为100%,氨基酸同源性为100%,与所引用的9株其他不同地区分离的AKAV的S片段序列核苷酸同源性在83.8%～97.7%之间,氨基酸同源性在90.6%～99.6%之间,且新分离毒株处于同一进化小分支,具有高度亲缘性,形成了一个独立的次级分支,同时与其他2株中国AKAV分离株处于同一进化簇。结果表明,云南省师宗县为AKAV流行地区,病毒在当地活动频繁,新分离得到的2株病毒与其他AKAV毒株具有较高的核苷酸同源性和氨基酸同源性,提示亚洲太平洋地区AKAV病毒长期流行且关系密切,同时其氨基酸同源性高于核苷酸同源性也提示了AKAV S片段良好的氨基酸遗传稳定性。     

流行性出血病多克隆抗体C-ELISA检测方法的建立

为能简便、快速地进行流行性出血病病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)抗体监测,采用纯化的6型EHDV抗原包被ELISA板,以豚鼠抗EHDV-2型多克隆抗体作为竞争抗体,建立了检测EHDV群特异性抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。结果显示:抗原最佳包被浓度为5.12μg·mL-1(1∶10 000),竞争抗体最佳稀释倍数为1∶10 000;通过对各270份阴性和阳性的牛、羊血清检测,确定该检测方法临界值为50%;特异性试验表明该ELISA方法仅能检测出不同血清型EHDV抗体,具有较好的群特异性;对已知抗体效价的阳性血清检测表明,建立的C-ELISA方法敏感性好于血清中和试验(SNT)和琼脂扩散试验(AGID);分别用C-ELISA、SNT、RTPCR和病毒分离试验对监控动物采集的血清和抗凝血样品进行检测,ELISA结果与其他3种方法检测结果对应一致。结果表明本研究建立的C-ELISA为EHDV抗体的检测提供了一种快速、敏感、稳定的方法。     

鸽新城疫病毒毒力致弱株的拯救及免疫原性分析

为快速获得鸽新城疫(ND)疫苗株,本研究构建了鸽NDV/Pi/CH/LHLJ/110822株反向遗传操作平台,拯救得到2株亲本病毒株r0822-21A、r0822-17A,以及1株F蛋白裂解位点突变为La Sota相应位点的病毒株r0822-FCS。HA/HI试验结果显示r0822-FCS毒力已致弱,将其灭活乳化后免疫SPF鸡可刺激其产生高滴度HI抗体。安全性评价试验结果显示其安全性良好,但接种14 d时SPF鸡的HI抗体滴度仅达3 log2,对基因Ⅶ型鸡源强毒CK/CH/HLJ/01/06攻毒保护率小于50%;免疫效力试验显示,r0822-FCS分别以10~5EID_(50)/0.1 mL、10~6EID_(50)/0.1 mL剂量接种14日龄SPF鸡,未检测到明显的抗体阳转。基因组测序分析结果显示,3株拯救病毒均在L基因的不同位置与新城疫病毒(NDV) V4株高度同源的外源基因片段重组,推测在实验条件下的细胞内拯救病毒过程中,病毒L基因与辅助质粒中的L基因发生了随机同源重组。综上所述,本研究获得的r0822-FCS株作为弱毒疫苗效果不佳,但可作为鸽ND灭活疫苗候选株。此外,本研究首次报道了反向遗传操作实验条件下,NDV基因组与V4株辅助质粒之间发生了基因重组,且L基因是决定病毒复制的关键基因。此次基因重组现象应为实验条件下的偶发事件,其机制和风险尚需后继实验研究分析。     

流行性出血病病毒VP7蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

研究旨在表达流行性出血病病毒（EHDV） VP7蛋白并制备其多克隆抗体，为EHDV检测方法的建立提供材料。试验通过大肠杆菌进行VP7重组蛋白的诱导表达，通过镍离子亲和层析与透析进行重组蛋白的纯化与复性并免疫家兔制备多克隆抗体，通过间接ELISA、Western blotting与间接免疫荧光试验（IFA）分析多克隆抗体的效价与反应原性。结果显示，在37℃与IPTG （0.1 mmol/L）的诱导下，VP7重组蛋白（分子质量46 ku）以包涵体形式高效表达，纯化与复性处理后的重组蛋白纯度达94.52%，可与不同血清型的EHDV阳性血清特异性结合。制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体效价达1∶24 000；以制备的多克隆抗体为一抗，通过IFA与Western blotting检测到EHDV感染细胞中VP7蛋白的表达。本研究在大肠杆菌中实现了EHDV VP7蛋白的高效表达，制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体具有良好的反应原性与特异性，为EHDV诊断抗原的制备与血清学检测方法的建立提供了试验材料。     

流行性出血病病毒抗原捕获ELISA方法的建立

为建立流行性出血病病毒(EHDV)病原学检测方法,本试验用纯化处理的4种血清型病毒(EHDV-2、5、6和8)混合免疫兔和豚鼠,制备高免血清。以兔抗EHDV为捕获抗体,豚鼠抗EHDV为检测抗体,羊抗豚鼠IgG-HRP为酶标抗体,建立了EHDV抗原捕获ELISA(antigen capture ELISA,AC-ELISA)方法。通过反应条件优化,获得最佳工作条件:5%马血清为稀释液,包被抗体1∶15 000稀释,检测抗体1∶20 000稀释,酶标抗体1∶15 000稀释。通过检测60份阴性样品确定临界值,P/N值≥2为阳性、P/N值1.5为阴性;特异性试验表明该方法仅能检测出各血清型EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、赤羽病病毒(AKAV)及中山病毒(CHUV)无交叉反应;敏感性试验表明该方法可以检出102.47±0.07 TCID50的病毒;批内和批间变异系数均10%;用RT-PCR与该方法同时对70份参考样品进行检测,符合率为92.86%。表明本试验建立的AC-ELISA方法为EHDV抗原检测提供了一种可靠实用的技术手段。