快速检测鲤春病毒血症荧光RT-PCR方法的建立与应用

本文建立快速检测鲤春病毒血症的荧光RT-PCR方法.利用同一对引物和探针,以梯度稀释的方法测定荧光RT-PCR法针对SVCV的灵敏性、特异性及重现性.荧光RT-PCR方法能够检测出104倍稀释的SVCV,灵敏度性高.同时,该方法的特异性很强,对其他病毒,如传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血败血病毒(VHSV)均未有扩增反应.方法的重现性也较好.荧光RT-PCR具有较高的灵敏度特异性和重现性,在鱼类疫病的早期快速诊断方面具有重要作用.     

数字RT-PCR检测鲤春病毒血症的方法建立与应用

[目的]通过实时定量RT-PCR和数字RT-PCR两种方法的比对试验,建立快速检测鲤春病毒血症的数字RT-PCR方法。[方法]利用同一对引物和探针,以梯度稀释的方法测定两种方法针对SVCV的灵敏性、特异性及重现性。[结果]两种方法均能够检测出104倍稀释的SVCV,而数字RT-PCR可以检测出单个微滴中的SVCV,其灵敏度性高于实时定量RT-PCR。同时,两种方法的特异性都很强,对其他病毒,如传染性胰腺坏死病毒（IPNV）、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、病毒性出血败血病毒（VHSV）均未有扩增反应。两种方法的重现性也较好。[结论]数字RT-PCR方法比实时定量RT-PCR具有更高的灵敏度,在鲤春病毒血症的早期快速诊断方面具有重要作用。     

鲤春病毒血症病毒RT-RAA-LFD检测方法的建立

为建立一种可现场快速准确检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的方法，本研究结合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术，根据SVCV L基因保守区域设计引物及探针，通过优化反应时间和温度等条件，初步建立了可用于SVCV现场可视化检测的RT-RAA-LFD方法。优化后的检测方法在35℃水浴锅中恒温反应15 min即可实现对SVCV目的基因片段的有效扩增。结果显示，该方法可以特异性的检测SVCV，并且不与病毒性出血败血症病毒、传染性鲑鱼贫血症病毒、病毒性神经坏死病毒等其他常见鱼类病毒发生交叉反应；对SVCV重组质粒标准品的检测限为2.42×10²拷贝/μL，并具有较好的稳定性和重复性；采用该方法和病毒分离、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR、荧光定量RT-RAA共5种方法同时对45份临床样品检测，其中病毒分离、套式RT-PCR和荧光定量RT-PCR均检测到29份阳性样品，荧光定量RT-RAA和本研究建立的方法均检测到28份阳性样品，本研究与前3种方法的阳性符合率为97.8%，与荧光定量RT-RAA的阳性符合率为100%。上述结果表明，本研究建立的SVCV ...     

荧光环介导逆转录等温扩增（RT-LAMP）技术在病毒性出血性败血症（VHS）诊断中的应用

运用GenieII实时荧光等温扩增检测系统,以LAMP法荧光检测为基础,建立了对病毒性出血性败血症病毒进行荧光实时反转录环介导等温扩增检测方法.根据对VHSV病毒N基因序列的分析,针对病毒的高保守区域的6个特异性序列,设计了3对特异性引物,同时加入dsDNA混合染料,对核酸扩增过程进行实时荧光监控.该方法的特异性良好,与其他鱼类弹状病毒无交叉反应.敏感度高,检测限为20 fg RNA模板.实验结果表明该方法是一种操作简单、快速高效、高特异性高灵敏度的病毒检测方法.     

鲤春病毒血症病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立鲤春病毒血症病毒(SVCV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的SVCV N蛋白基因的保守性序列设计并合成特异性引物,建立了该病毒的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数为0.99,在102拷贝/μL~109拷贝/μL范围内具有良好的线性关系。该方法对传染性脾肾坏死病毒、草鱼呼肠孤病毒、传染性皮下及组织坏死病毒和白斑综合征病毒其他水生动物病毒核酸扩增结果均为阴性,特异性强;该方法对SVCV检测下限为100.76 TCID50/m L,比常规PCR灵敏100倍;批内和批间的变异系数均小于7.6%,重复性好。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好,对SVCV的快速检测及定量检测具有重要意义。     

病毒性出血性败血症病毒焦磷酸测序检测技术的建立

为建立病毒性出血性败血症病毒(VHSV)焦磷酸测序检测技术,本研究通过对VHSV靶基因特异性序列的同源性分析,设计出适合焦磷酸测序特异性扩增和测序的引物,对焦磷酸测序反应体系和反应程序进行优化,建立了VHSV焦磷酸测序检测方法。结果表明,该方法仅对目的病毒基因扩增,而对其它病毒检测为阴性,表明该方法特异性好;该方法最低检出核酸量为82拷贝/μL,灵敏度高。选取国内采集与进口的鱼类样本共计1924批次进行VHSV检测,结果显示,焦磷酸测序检测方法检测结果与常规RT-PCR一致,该方法的特异性和灵敏度可以满足水生动物疫病检测的需要。     

基于RPA的鲤春病毒血症病毒核酸检测技术的建立与评价

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)是近几年新发展并普及应用的一种核酸扩增技术,能够实现检测设备小型化,从而满足现场诊断(point-of-care testing,POCT)的需求。本研究以鲤春病毒血症病毒(springviraemiaofcarp virus,SVCV)为检测靶标,建立了SVCV的RPA检测技术,并分析了该方法的灵敏性、特异性和稳定性,评判了该技术应用于POCT的可能性。结果表明:基于RPA的检测方法灵敏度较高,检测下限可达4×10~3 PFU/mL,但比以Taq酶为基础的RT-PCR技术略低;特异性好,未发现对其他水生动物疫病病原,如传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)、传染性鲑鱼贫血病病毒(ISAV)等发生非特异性反应;稳定性良好,3次重复性试验的结果近乎一致。试验证明,该方法能够替代RT-PCR技术,应用于POCT的试剂和仪器设备研发。     

实时荧光定量PCR检测鸡传染性贫血病毒方法的建立

建立了Taqman实时荧光定量PCR方法检测鸡传染性贫血病毒(CAV)。选取CAV病毒的序列设计引物和探针。以梯度稀释的含有CAV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×105～2.0×102个拷贝,4个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为200个拷贝。根据病毒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒和马立克病毒核酸都没有扩增反应。采用实时荧光定量PCR方法检测试验感染鸡的肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊、泄殖腔棉拭子等样品,所有检测样品都有"S"型扩增曲线,且荧光信号值高。实时定量PCR检测CAV的方法,灵敏度高,特异性好,可以进行定量分析,在禽病的快速检测上具有重要意义。     

实时荧光定量RT-PCR检测禽白血病病毒方法的建立与应用

建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测禽白血病病毒(ALV)。选取ALV病毒的LTR序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有ALV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。阳性标准品在3.0×102~3.0×107个拷贝共6个数量级的范围内,定量PCR反应有"S"型扩增曲线,检测灵敏度最低为30个拷贝。根据病毒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性囊病病毒、鸡传染性贫血病毒和马立克病病毒核酸都没有扩增反应。实时定量PCR检测ALV的方法,灵敏度高,特异性好,可以进行定量分析,在禽病的快速检测上具有重要意义。     

鳜弹状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、准确检测鳜弹状病毒(SCRV)的TaqMan荧光定量PCR方法,本实验根据弹状病毒N基因中的保守序列,设计合成了一对特异性引物和TaqMan探针,以构建的标准质粒为模板,经条件优化后建立了SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验。结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法标准曲线的相关系数为0.999,质粒标准品在1×10~8拷贝/μL～1×10~1拷贝/μL范围内有较好的线性关系;该方法可以特异性检测SCRV,但对草鱼出血病病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、传染性脾肾坏死病(ISKNV)、神经坏死病毒(NNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)等7种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;最低可检测到的质粒标准品浓度为102拷贝/μL,比常规PCR方法灵敏100倍;该方法组内与组间变异系数均小于2%。采用该方法对35份临床样品进行检测,结果显示阳性检出率为31%,而普通PCR阳性检出率为14%,该方法检出率比常规PCR高。本研究建立的SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法为SCRV的快速检测提供了可行的技术手段。     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为检测牛传染性鼻气管炎病毒,通过设计针对gB基因的特异性引物扩增gB基因,构建阳性重组质粒。经过优化建立了牛传染性鼻气管炎病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测方法在阳性标准质粒拷贝数在5.474×10⁴～5.474×10⁹拷贝/μL时线性关系良好,线性相关系数R²=0.999 3。该方法最低检测限为5.747×10²拷贝/μL;可以特异性检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒(BPIV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)不发生交叉反应。病毒滴度与拷贝数的线性关系良好,线性相关系数R²=0.985 4。该方法为牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测提供了技术支持。     

猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×10⁸至2.0×10²拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为20个拷贝/μL。根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高、特异性好,可以进行定量分析,在猪流感的快速检测上具有重要意义。     

猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、特异、灵敏的猪圆环病毒3型(PCV3)实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3全基因组序列高度保守区域设计了一对特异性引物和探针,通过对反应体系和扩增条件进行优化,建立了能够特异性检测PCV3的荧光定量PCR方法.该方法对7.87×103～7.87×109拷贝/μL的PCV3标准质...     

鱼类病毒性出血性败血症病毒诊断胶体金免疫层析方法的建立

为建立一种快速检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(Viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以标记纯化的VHSV G蛋白单克隆抗体(MAb)10A7为捕捉抗体,将纯化的抗VHSV N蛋白的MAb 10EN单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带,经试验条件优化,组装形成胶体金免疫层析试纸条。用本试验研制的胶体金试纸条检测VHSV感染的CHSE细胞培养物。结果显示:在检测线和质控线均呈现红色条带,而健康的CHSE细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的病毒量最低限为10~(4.0) TCID_(50);随机挑取3个不同批次的试纸条,对阳性样品和阴性样品进行重复试验,未发现差异。特异性试验表明,该试纸条与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、牙鲆弹状病毒(HRV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)无交叉反应。将同一批次的试纸条在4℃条件下保存不同时间后进行检测,发现保存6个月的试纸条仍具有良好的稳定性。本试验研发的胶体金诊断试纸条具有良好的特异性、灵敏性和重复性,在快速辅助检测方面具有推广应用价值。     

环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒

为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验.结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green Ⅰ染色后仅肉眼观察即可判定结果.该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR.该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV.     

鸡减蛋综合征病毒Hexon基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

用PCR方法扩增出鸡减蛋综合征病毒（EDSV）Hexon基因保守片段,经琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析扩增产物的特异性。以构建的阳性重组质粒作为标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,并绘制标准曲线。结果表明,建立的EDSV荧光定量PCR标准曲线Ct值与1×10^1～1×10^6拷贝/μL的基因拷贝数呈现良好线性关系,灵敏度可达10拷贝,且特异性及重复性良好;说明本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于EDSV的诊断及病原的定量分析。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,采用RT-PCR扩增PRRSV N基因266bp片段,并克隆到pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立了PRRSV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.3×101拷贝/μL,与猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪日本脑炎病毒(JEV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明,建立的PRRSV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征病毒病(PRRS)的诊断。     

鸡传染性贫血病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)的实时荧光定量PCR检测方法,本试验通过CIAV基因组保守区域设计1对扩增片段大小为180bp的特异性引物,构建pGM-T-CIAV重组质粒,制备阳性标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果显示,CIAV的Ct阈值与标准品浓度在5.33×108至5.33×103拷贝/μL间呈良好的线性关系,相关系数R2=0.998,斜率为-3.443,产物Tm值在86℃左右。该方法与网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)J亚型、马立克氏病病毒(MDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组均无交叉反应,敏感性为5.33拷贝/μL,比普通PCR高1 000倍,批内和批间重复试验变异系数均小于3%。结果表明,本试验建立的CIAV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可实现对鸡传染性贫血病的早期诊断及感染程度的定量分析的检测。     

鲤浮肿病毒荧光RAA快速检测方法的建立

为建立一种简单、快速的鲤浮肿病毒(CEV)重组酶介导的链替换扩增(RAA)检测方法,本研究通过比较分析CEVP4a基因序列,设计引物与探针,经过筛选优化,建立了实时荧光RAA检测方法。结果显示,该方法在39℃恒温反应20min即可快速、特异性地检测出CEV,与常见的鱼类病毒不发生交叉反应,其对质粒标准品的检测下限为2.8×10^1拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于5%。利用本研究建立的方法对35份临床鲤科鱼类样品进行检测,检测结果与荧光定量PCR方法结果一致。本研究建立的检测方法操作简单,特异性强、敏感性高,结果可靠,不依赖于复杂的仪器,适用于现场对CEV的快速检测。