传统乳制品中-产细菌素乳酸乳球菌的筛选

采用平板挖井扩散法对从内蒙古传统乳制品中分离鉴定的34株乳酸菌的细菌素产生特性进行研究。在排除有机酸和过氧化氢的干扰后发现，一株乳酸乳球菌CB20—2的发酵上清液对革兰氏阳性60乳酸菌和非乳酸菌显示出抑菌活性，但对革兰氏阴性菌无抑菌作用。其蛋白特性及广谱抑菌性表明乳酸乳球菌CB20—2产生的抗菌物质是一种细菌素。     

枯草芽孢杆菌MA139类细菌素抑菌活性的研究

为测定枯草芽孢杆菌MA139产生的类细菌素的抑菌活性。本试验采用管碟法对枯草芽孢杆菌MA139产生的类细菌素对多株革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的抑菌活性进行测定。结果表明:类细菌素不但对芽孢杆菌属的其他菌种有抗菌活性,对病原菌和霉菌也有拮抗作用;不同指示菌对类细菌素的敏感性不一样,其中金黄色葡萄球菌对其最敏感。该类细菌素具有广谱抗菌作用,有作为畜禽饲料添加剂的潜力。     

植物乳杆菌抑菌蛋白的分离鉴定及抑菌特性研究

【目的】筛选新型广谱有效的抑菌蛋白,为全面解析植物乳杆菌抑菌机制和开发新型抗菌制剂奠定基础。【方法】以植物乳杆菌GX20200417-1为研究对象,采用牛津杯法测定其抑菌活性,以低温离心和超滤法初步分离获得胞外蛋白并测定其抑菌活性,对胞外蛋白进行不同温度、pH及蛋白酶处理,研究抑菌蛋白理化特性,利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进一步分析鉴定植物乳杆菌代谢产物中的抑菌成分。【结果】植物乳杆菌GX20200417-1对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抑菌作用;发酵上清液在发酵24 h的抑菌能力最强;胞外蛋白的抑菌能力与发酵上清液相近;植物乳杆菌抑菌蛋白具有较好的耐热特性,与对照组相比,在20~80 ℃时抑菌活性均无显著变化(P＜0.05),在pH 6.0~8.0时抑菌活性最佳,对蛋白酶敏感;经LC-MS/MS鉴定分析,检测出5种可信度较高且与抑菌作用相关的蛋白质,分别是片球菌素pediocin PA-1、溶菌素(lysin)、聚酮合酶(polyketide synthase)、辅助蛋白(accessory protein)和LysM peptidoglycan-binding domain-containing protein,分子质量分别为5.348、7.348、8.348、6.348和19.662 ku;蛋白质功能分析结果表明,片球菌素pediocin PA-1与溶菌素主要通过破坏细菌细胞壁与细胞膜,从而达到抑菌效果。LysM peptidoglycan-binding domain-containing protein可识别含有N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基的肽聚糖,上调抗菌肽的表达;辅助蛋白主要参与细菌素的合成,聚酮合酶主要参与抗生素的合成,二者通过参与抑菌物质的合成间接发挥抑菌作用。【结论】本研究成功分离并鉴定植物乳杆菌GX20200417-1的5种抑菌蛋白;植物乳杆菌GX20200417-1可能通过其代谢产物中的多种抑菌蛋白协同发挥抗菌作用。     

鸡源乳酸菌细菌素的分离筛选及鉴定

为了分离鉴定产乳酸菌细菌素,采用双层琼脂扩散法,对从健康鸡肠道内容物分离到的68株乳酸菌进行筛选,获得对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门菌均有抑制作用的17株乳酸菌,在排除酸、过氧化氢等因素作用后仍具有较强抑菌活性,表明发酵液中还有其他抑菌活性物质的存在,用蛋白酶处理上清液后有6株菌的抑菌效果消失,表明抑菌物质具有蛋白质性质,是一种细菌素类物质。筛选出的菌株所产抑菌物质是一种广谱细菌素,它们对革兰阳性菌和革兰阴性菌均具有较强抑制效果。结合形态鉴定、生理生化特性试验以及16S rRNA序列同源性分析鉴定菌株LABJN02、LABJN05、LABJN06和LABJN14分离菌为唾液乳杆菌,LABJN16为约氏乳杆菌,LABJN31为卷曲乳杆菌。细菌素作为潜在的抑菌物质,与其产生菌一起在平衡肠道菌群中具有重要意义。     

喷雾干燥细菌素的生物学活性研究

为了初步研究前期试验筛选获得的枯草芽孢杆菌产细菌素的生物学活性,本试验采用杯碟扩散法绘制出硫酸黏杆菌素和杆菌肽锌两种抗生素的抑菌效价标准曲线,用抗生素效价当量来评价细菌素的活性,并在不同温度处理下测定其抗菌活性和热稳定性。结果表明,125 mg/mL细菌素溶液抑菌效价与26 mg/mL硫酸黏杆菌素或11.9 mg/mL杆菌肽锌溶液相当。此外,该细菌素在高温条件下(60~80 ℃)处理15 min仍能维持较高抑菌活性。综上所述,本试验在细菌素和抗生素的抑菌活力之间建立了更直观的联系,并证明了该细菌素具有较好的热稳定特性,为其产业化推广提供了理论支持和技术借鉴。     

羊肠道益生芽孢细菌的筛选及D-4-1菌株胃肠道耐受

为了筛选具有肠道益生特性的芽孢细菌,进一步开发益生菌资源,该研究采用肠道病原菌拮抗试验,从羊的肠道内容物中筛选对大肠杆菌具有显著拮抗作用的芽孢细菌。通过梯度稀释平板试验及发酵液拮抗活性,分离纯化出1株抑菌活性较强的菌株D-4-1,经测定抑菌圈直径在18.7 mm;通过16S rDNA鉴定和菌株系统发育树分析,并结合生理生化结果,鉴定D-4-1为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。经胆酸盐耐受和人工胃肠道环境试验,该菌株可耐受0.3%的胆酸盐浓度,在pH4的人工胃液和pH6的人工肠液中能很好的生存。结果表明,D-4-1菌株具有较强的益生特性,可作为功能益生菌进行开发利用。     

奶牛阴道乳杆菌抗菌物质的体外特性

采用牛津杯法测定4株乳杆菌(罗伊乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌和唾液乳杆菌)对致病菌的抑菌活性,使用含有3,3,5,5-四甲基联苯胺和辣根过氧化物酶的MRS琼脂培养基测定乳杆菌产过氧化氢能力,最后通过蛋白类排除试验、抑菌物质热稳定性试验、有机酸排除试验和过氧化氢(H_2O_2)排除试验分析4株乳杆菌主要的抗菌物质。结果显示:4株菌株均具有良好的抗菌活性,约氏乳杆菌和唾液乳杆菌能够产生H_2O_2;约氏乳杆菌主要的抗菌物质为有机酸,罗伊乳杆菌、格氏乳杆菌和唾液乳杆菌主要抗菌物质除了有机酸外,仍可以产生细菌素。结果表明:罗伊乳杆菌、格氏乳杆菌和唾液乳杆菌可以作为防治奶牛子宫内膜炎的益生菌使用。     

牛类芽孢杆菌BD3526发酵液中抗菌物质的特性及初步分离

牛类芽孢杆菌BD3526在组合培养基中培养发酵48 h,对发酵液中的抗菌物质进行特性研究及初步分离。蛋白酶处理结果表明,牛类芽孢杆菌BD3526发酵上清液含有肽类抗菌活性物质,且具有良好的热稳定性、耐酸碱性。通过对抗菌物质特性的研究发现,其对选取的革兰氏阳性菌具有较强的抑菌活性,而对选取的革兰氏阴性菌没有抑菌活性。通过Sephadex LH-20凝胶柱层析初步分离纯化发现,牛类芽孢杆菌BD3526产生的抗菌物质与麸皮发酵液中产生的抗菌物质有所不同,表明可能有新的抗菌物质产生。     

罗伊氏乳杆菌所产细菌素的研究

试验对罗伊氏乳杆菌6126的发酵上清液进行了系统研究。结果表明:罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液可以产生细菌素,并研究了6126发酵上清液中细菌素的部分特性。该细菌素抑菌谱广,可以抑制多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,对热(100℃,30min)和pH(2.0～10.0)稳定,胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K等多种蛋白酶可使其部分失活。     

酸马奶提取植物乳杆菌DSM20174细菌素的理化特性研究

为研究从酸马奶中提取的植物乳杆菌DSM20174细菌素的理化特性,本试验提纯植物乳杆菌DSM20174细菌素,经过硫酸铵沉淀、透析后得到细菌素粗提液,再利用SephadexG-100凝胶柱层析进行纯化后,细菌素的比活力明显增加,达到154.70 AU/mL,得率为43.5%.采用牛津杯法测定纯化的植物乳杆菌DSM20174细菌素在3种不同方式处理下对牛源野生致病性大肠杆菌O78抑菌效果的影响.结果显示:①植物乳杆菌DSM20174细菌素在5组温度处理下,随着温度的升高抑菌作用降低,各组抑菌作用差异显著(P<0.05).即使121 ℃处理30 min后,抑菌直径仍达14.90 mm.②植物乳杆菌DSM20174细菌素在pH 2.0~12.0由低到高的11组酸碱处理下,pH越大抑菌直径越小,且除了pH 9.0和pH 10.0之间差异不显著(P>0.05)外,其余各组抑菌作用均差异显著(P<0.05). ③植物乳杆菌DSM20174细菌素经胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶3种酶处理后抑菌直径变化明显,处理前后抑菌作用均差异显著(P<0.05).结果表明植物乳杆菌DSM20174细菌素是较好的抑菌活性物质,但不是热稳定性物质;具有较广泛的pH适用范围,且pH越小时其抑菌活性越强,在最适生长pH时抑菌活性有所增强;不是蛋白酶稳定性物质.     

鸡肠道内乳酸菌的分离鉴定及体外抑菌试验

为获得鸡肠道内抑菌效果好、适应性强的乳酸菌,从健康鸡小肠内容物中分离乳酸杆菌,并对其进行生化鉴定。结果成功从鸡小肠中分离出6株细菌。通过革兰氏染色和生化鉴定,发现这6株细菌分别是微小乳酸菌(L.minor)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、肠乳杆菌(L.intestinalis)、嗜酸乳杆菌(L.acidlophilus)、植物乳杆菌(L.plantarum)。对分离到的6株乳酸菌进行体外抑菌试验,结果表明肠乳杆菌(L.intestinalis)对大肠杆菌有一定的抑菌作用。该研究为后期开发益生菌制剂奠定了一定的基础。     

抑制奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌的乳酸菌的筛选

为获得抑制奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌(S. aureus)的乳酸菌(LAB),本研究从新疆巴音布鲁克牧区鲜牛乳和哈萨克族乳制品奶疙瘩样品中分离培养LAB,通过传统的分离鉴定与16S rDNA基因序列测序相结合的方法鉴定LAB种类,同时以临床奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌S. aureus N2为指示菌,采用双层琼脂扩散法检测分离株的抑菌能力。通过测定生长曲线确定分离株的生长稳定期,进而利用硫酸铵沉淀法透析提取稳定期内分离株的细菌素,并检测其细菌素抑菌效价。结果显示:从样品中筛选获得5株能够抑制指示菌生长的LAB,分别为希氏乳杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌、戊糖片球菌和乳酸乳球菌亚种。生长规律曲线表明20 h^30 h为5株LAB的稳定期,此期培养液pH值维持在3.8~4.5。从培养20 h的5株LAB上清液中提取到了细菌素,经检测其具有抑菌活性,抑菌效价分别为457 IU/mL、1 023 IU/mL、676 IU/mL、1 862 IU/mL和1 023 IU/mL。本研究结果表明5株LAB通过在生长稳定期内维持较低酸性环境(pH<4.5),代谢产生细菌素对乳房炎源S. aureus发挥抑制生长作用。本研究为S. aureus性奶牛乳房炎的生物防治提供了实验依据。     

粪肠球菌产伏尔加霉素E5的生物学特性研究

为了确定分离自健康猪胃肠道粪肠球菌产生的细菌素伏尔加霉素E5(enterocin E5)的生物学特性,本研究检测了该细菌素对热、酸碱、酶类的耐受性及其抗菌谱,enterocin E5经过121℃高压处理10min对指示菌抑菌活性没有影响;细菌素于pH 2～12作用后,对大肠埃希菌仍有抑菌活性,最强的pH抑菌活性范围为pH 4～6;enterocin E5对胰蛋白酶和蛋白酶K处理敏感,过氧化氢酶、脂肪酶和淀粉酶对其抑菌活性没有影响;enterocin E5对21株动物源病原微生物具有抑制作用,革兰阴性病原菌包括大肠埃希菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、多杀性巴氏杆菌等,特别对产生多重抗药性的3株鸡伤寒沙门菌具有明显的抑菌活性。抑制革兰阳性金黄色葡萄球菌、马腺疫链球菌、猪链球菌,对炭疽芽胞杆菌弱毒株和蜡样芽胞杆菌产生显著的抑菌活性。结果表明,enterocin E5对酸碱是比较稳定的,具有很宽泛的pH耐受范围,属于热稳定IIa亚型细菌素,能够作为一种抗菌物质防控动物源细菌病。     

肉鸡肠源产细菌素乳酸菌的分离和鉴定

研究旨在从肉鸡肠道中筛选具有良好抑菌效果的产细菌素乳酸菌,并对其生物学特性和抑菌特性进行初步研究。试验采用牛津杯法,以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌为指示菌,从饲喂菌丝霉素的肉鸡肠道分离筛选具有抑菌功能的乳酸菌。利用形态学、生理生化鉴定及16S rD-NA序列同源性分析进行菌种鉴定,通过热处理、过氧化氢酶、蛋白酶K处理确定抑菌活性物质,并绘制乳酸菌生长曲线及抑菌活性曲线。分离筛选到两株对大肠杆菌、沙门氏菌和金色葡萄球菌均具有较强抑菌活性的乳酸菌LAB12和LAB19,经鉴定菌株LAB12为乳酸片球菌,菌株LAB19为植物乳杆菌。过氧化氢酶处理不影响LAB12和LAB19抑菌活性,加热处理和蛋白酶K处理后抑菌活性减小。乳酸片球菌LAB12接种后2 h进入对数生长期,18 h左右进入稳定期,随着菌体数量增加发酵液上清抑菌作用增强,22 h抑菌活性达到最大且趋于稳定;植物乳杆菌LAB19在发酵2 h进入对数生长期,经约10 h快速生长后,生长速度趋于稳定,抑菌活性也基本保持不变。研究从饲喂菌丝霉素的肉鸡肠道中分离筛选到两株具有良好抑菌功能的乳酸菌,分别为乳酸片球菌LAB12和植物乳杆菌LAB19,初步鉴定这两株菌抑菌活性物质为细菌素。     

犊牛瘤胃内黏膜乳杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

利用厌氧菌分离技术从犊牛瘤胃中分离出1株细菌,通过对其形态、生理生化特性、16S rRNA基因序列测定与同源性分析,表明分离株为黏膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae),是瘤胃内分离到的1株新菌种,并对其进行了高温耐受试验、耐酸性试验、安全性检测、抑菌试验等生物学特性研究。黏膜乳杆菌的分离鉴定及生物学特性研究为以后克隆耐酸基因,研制瘤胃微生态制剂及调控瘤胃微生物发酵奠定了基础。     

一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及抑菌活性分析

为了对兔源枯草芽孢杆菌进行生化特性及抑菌活性的分析鉴定,试验将1株枯草芽孢杆菌进行扩大培养后,革兰氏染色,镜检,利用PCR技术扩增16S rRNA序列;测序后构建系统进化树,分析遗传变异特性,借助生化管分析生理生化特性,并进行体外抑菌活性分析。结果表明:该菌株为产芽孢的革兰氏阳性菌,在系统进化树中与枯草芽孢杆菌聚为一簇,同源性高达99%,对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有一定抑菌活性。     

嗜酸乳杆菌P302所产类细菌素的生物学特性及菌株耐药性分析

对嗜酸乳杆菌P302所产的类细菌素进行生物学特性的研究结果表明,类细菌素对动物肠道内革兰氏阴性和革兰氏阳性致病菌均有抑菌作用,PH值仅在3.0和4.0有抑菌活性,在121℃处理20min后活性略有下降,用蛋白酶处理后抑菌活性降低.嗜酸乳杆菌P302对83种抗生素的耐药性结果表明,嗜酸乳杆菌P302对其中的19种抗生素有耐药性.     

不同乳酸菌分离株抗菌物质及其抗菌活性的体外检测及鉴定

为检测及鉴定乳酸菌分离株的抗菌物质,本研究采用牛津杯法测定乳酸菌的抗菌活性,通过上清液煮沸、过氧化氢排除试验、蛋白类排除试验、有机酸排除试验检测并鉴定了本实验室前期从健康奶牛阴道内分离获得的5株酸菌的抗菌物质。结果显示,这5株乳酸菌对指示菌均具有良好的抗菌活性。坚强乳杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌和巴黎链球菌的主要抗菌物质为有机酸,黏膜乳杆菌的抗菌物质为过氧化氢、蛋白和有机酸。本研究表明黏膜乳杆菌可以初步作为防治奶牛子宫内膜炎的潜在益生菌使用。     

一株桑树内生拮抗细菌的分离鉴定与抑菌活性

以大肠杆菌为指示菌,从野生型鲁桑(Morus multicaulis Perr.)桑树枝条韧皮部组织中分离得到具有抑菌活性的内生细菌ME1。形态与生理生化特性鉴定ME1菌株为有芽孢和鞭毛的革兰阳性菌,细胞呈杆状,大小为0.6～0.7μm×1.8～1.9μm;能够利用葡萄糖、蔗糖和乳糖等碳水化合物,所产淀粉酶活力可达4 182.60 U/g;耐盐性较高,可耐受100 g/L NaCl。进一步通过16S rDNA序列及其系统进化分析,初步鉴定ME1菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。抑菌试验表明ME1菌株的代谢产物具有广谱抗菌活性,对大肠杆菌(Escherichia coli)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)和白僵菌(Beauveria bassiana)的体外抑制率分别为59.92%、75.70%、51.60%、87.25%和69.81%,该菌株产生的抗菌活性物质具有潜在的医用开发价值。     

抗奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌-细菌素的筛选及特性研究

奶牛乳房炎时常危害奶牛群，给奶牛养殖业造成严重的经济损失。在所有细菌性乳房炎中，金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎占比极高。本研究以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用琼脂扩散法进行抑菌试验，从内蒙古手工奶酪中筛选到一株产细菌素的乳酸菌作为研究对象。根据形态特征，结合16S rRNA序列结果分析，鉴定菌株为Lacticaseibacillus saniviri，命名为LS-1。通过酶稳定性试验、酸碱稳定性试验、热稳定性试验，确定菌株LS-1的细菌素生物学特性。LS-1细菌素对木瓜蛋白酶、胃蛋白酶较敏感，经100℃水浴处理具有良好抑菌活性。LS-1细菌素经p H处理，p H为11.0时抑菌活性丧失。本研究所筛选的LS-1，丰富了产细菌素的菌种资源，其所产细菌素具有作为治疗奶牛乳房炎替抗产品的潜力。