小鼠ERO1α基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定

针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10~7 TU/mL～10×10~7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%～90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。     

牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1慢病毒载体构建及其对卵泡GCs凋亡的影响

旨在构建牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒载体，并将其感染牦牛卵泡颗粒细胞(granulosa cells, GCs),了解它对细胞凋亡的影响。本研究提取牦牛卵泡RNA,以RT-PCR技术扩增lncRNA ENSBGRT00000000387.1全长序列，而后构建其重组质粒，并以慢病毒包装系统(pVSVG:pMDL:pRev)包装后利用qPCR法测定在293T细胞上的感染滴度，再感染分离培养的牦牛GCs,以qPCR检测GCs中lncRNA ENSBGRT00000000387.1的表达水平，并以流式细胞仪检测GCs的凋亡率，以Western blot和qPCR分别检测促凋亡基因CASPASE3、BAX和抑凋亡基因BCL-2的mRNA和蛋白表达水平。结果显示，由牦牛卵泡中成功扩增出lncRNA ENSBGRT00000000387.1的全长2 566 bp序列，将其与LV-EF1a-EGFP-2A载体同源区的片段同源重组，经酶切鉴定及测序验证表明成功构建了重组质粒，将之经慢病毒包装系统包装和浓缩后，在293T细胞的感染效率达(75.77±0.850)%...     

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组慢病毒载体构建和鉴定

为构建携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0基因的重组慢病毒质粒,并检测其在HEK-293T细胞中的表达,本研究通过合成BVDV E0基因序列(AJ133739.1),构建包含Ig K信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-Ig K-E0重组质粒和不含信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-E0重组质粒,将其采用PEI方法分别转染HEK-293T细胞包装慢病毒,并浓缩后测定滴度,收集转染后上清液进行western blot检测蛋白表达。通过酶切、PCR及测序鉴定表明E0基因正确整合至慢病毒载体中,western blot结果表明其能够在HEK-293T细胞中表达。本研究构建获得携带BVDV E0基因的重组慢病毒,为BVDV E0蛋白哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性研究奠定基础。     

比格犬ERβ_(1293)稳定细胞系的建立

为了建立ERβ1293的稳定表达细胞系,为ERβ1293的功能研究奠定基础。以重组质粒pEGFG-N1-ERβ1293为模板,扩增出全长ERβ1293,经胶回收纯化后连接到pMD18-T Vector,经测序鉴定后双酶切连接至Lenti-OE-Flag载体,重组质粒经PCR、双酶切、测序鉴定;使用HEK-293T包装细胞系,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液感染HEK293细胞,利用Puromycin加以筛选,获得稳定表达细胞系,并采用Western blot方法验证基因表达情况。结果获得了Lenti-OE-Flag-ERβ1293重组质粒,并成功包装成慢病毒。利用病毒感染HEK293细胞后获得了稳定表达细胞系,Western blot方法证实,稳定表达细胞系可以成功表达ERβ1293蛋白,为研究ERβ1293的功能奠定了基础。     

猪Utx慢病毒过表达/干扰载体的构建和病毒包装

UTX(ubiquitously transcribed TPR gene on the X chromosome)作为H3K27me2/3的去甲基酶,能够调控动物发育过程,并有着重要的生物学作用。根据猪Utx预测序列,扩增Utx的CDS区全长序列。利用Utx的CDS区序列信息,构建pCD513B-CMV-Utx过表达载体,设计并合成干扰shRNA和阴性对照寡核苷酸片段。其中干扰shRNA及阴性对照通过退火形成双链DNA,并插入pCD513B-U6慢病毒干扰载体。采用双酶切的方法和DNA测序鉴定重组载体。通过干扰和过表达载体质粒共转293T细胞,利用qRT-PCR筛选出最有效的干扰序列。重组质粒与其他3种慢病毒辅助包装质粒(pRsv-Rev、pGag-Pol、pVSV-G)共转染293T细胞包装慢病毒。结果表明,本试验成功扩增Utx基因的全长序列,且成功构建了Utx的过表达和干扰载体。qRT-PCR筛选出pCD513B-U6-Utx-shRNA-3干扰效率最显著,干扰效率为70%。本试验成功包装出慢病毒Lenti-Utx-shRNA、Lenti-NC和Lenti-Utx,测定的病毒滴度分别为6.1×107 TU/mL、4.8×107 TU/mL和3.9×105 TU/mL。此试验为进一步在猪源细胞中进行Utx基因的研究奠定基础。     

禽白血病病毒衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体的构建及其在鸡肝癌细胞系中的表达

构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞系(LMH)中的表达情况,以探讨p15基因对病毒复制、免疫信号通路的影响。以真核表达质粒pCAGGS-p15为模板扩增p15全长基因,经双酶切后克隆到慢病毒载体plvx-IRES-ZsGreen1上,构建成plvx-p15-Flag慢病毒表达质粒,将该质粒与辅助质粒共转染293T细胞产生慢病毒,将细胞上清中的病毒感染LMH细胞,检测p15蛋白表达情况。慢病毒载体在293T细胞上包装完成后,病毒滴度为2.25×10⁵ TU/mL。慢病毒感染LMH细胞,基因和蛋白水平检测结果表明,p15蛋白表达良好。表达ALV p15基因的慢病毒包装成功,并且能够感染鸡源LMH细胞。该载体的构建为进一步研究p15蛋白的生物学功能提供工具。     

抗禽流感病毒(H5N1)入胞单分子抗体过表达慢病毒载体的构建及其稳转细胞株的建立

构建过表达抗禽流感病毒(H5N1)M1蛋白入胞单分子抗体(TAT-ScFv-mFc)的慢病毒载体,筛选获得稳定表达TAT-ScFv-mFc的HEK293T稳转细胞株。PCR扩增目的基因,将其插入质粒pLVX-mCMV-ZsGreen1-Puro中,构建pLVX-TAT-ScFv-mFc-ZsGreen1-Puro慢病毒过表达质粒,对重组质粒进行慢病毒包装后使用转染试剂复合物转染HEK293T细胞系,并使用嘌呤霉素(Puro)筛选阳性表达细胞,经过扩大培养及裂解后,以ProteinG纯化目的蛋白并对蛋白纯品进行鉴定。Western blot检测结果显示,成功获得了稳定表达TAT-ScFv-mFc的HEK293T细胞株。ELISA、SDS-PAGE、BCA结果显示成功获得预期目的蛋白2 mL(0.39 g/L)。结果表明,本研究成功建立了稳定表达抗H5N1病毒抗体的293T细胞系,为进一步研究TAT-ScFv-mFc的功能结构奠定了基础,也同时为真核表达系统的抗体制备研究提供了参考依据。     

比格犬野生型ERβ稳定细胞系及其配体结合区(LBD)真核表达载体的构建

通过构建比格犬ERβ稳定细胞系及其配体结合区(LBD)的真核表达载体,为探讨ERβ的功能奠定基础。以重组质粒pEGFG-N1-ERβ为模板,扩增出全长ERβ以及ERβ-LBD基因片段,经胶回收纯化后连接到pMD18-T载体,经测序鉴定后再连接至Lenti-OE-Flag以及pFLAG-CMV4载体。使用HEK-293T包装细胞系,包装Lenti-OEFlag-ERβ产生慢病毒,并将所得病毒悬液感染HEK293细胞,利用Puromycin加以筛选,获得稳定表达细胞系。同时将pFLAG-CMV4-ERβ-LBD质粒瞬时转染293T细胞,采用Western blot方法验证ERβ以及ERβ-LBD蛋白的表达情况。结果表明,试验成功获得ERβ稳定表达细胞系和重组质粒pFLAG-CMV4-ERβ-LBD;Western blot方法证实,稳定表达细胞系可以成功表达ERβ蛋白,ERβ-LBD也可以瞬时成功表达。     

猪NMB基因过表达载体的构建及其在猪睾丸间质细胞中的表达

为了构建猪神经介素B(pNMB)基因慢病毒过表达载体,以及研究其在猪睾丸间质细胞中稳定表达情况,试验采用RT-PCR方法扩增获得pNMB基因的CDS序列,插入到pMD-19T载体中,构建pMD19-T-pNMB重组质粒,对该重组质粒和慢病毒过表达质粒pCD513B-1进行双酶切,以获得的线性化pCD513B-1和线性化pNMB质粒构建pCD513B-1-pNMB重组慢病毒过表达载体;将重组慢病毒过表达载体pCD513B-1-pNMB和辅助质粒(pGag/Pol、pRev和pVSV-G)共转染至HEK293T细胞中,包装获得pNMB过表达慢病毒,并用倍比稀释法测定病毒含量;用pNMB过表达慢病毒转染猪睾丸间质细胞,通过嘌呤霉素抗性筛选获得稳定表达的细胞,利用实时荧光定量PCR方法检测pNMB mRNA的表达情况。结果表明：RT-PCR扩增获得大小约为366 bp的目的片段,与GenBank中pNMB基因的CDS序列完全一致,RT-PCR扩增片段与目的片段序列完全相同;将pNMB基因克隆到pMD-19T载体中,成功构建出pMD19-T-pNMB重组质粒;XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒p...     

西农萨能羊乙酰/丙二酸单酰基转移酶基因重组腺病毒载体的构建

本研究旨在通过构建西农萨能羊脂肪酸合酶(FASN)基因乙酰/丙二酸单酰基转移酶(MAT)区域的重组腺病毒载体,为研究其在奶山羊乳腺上皮细胞中过表达以及功能和作用机制做准备。根据GenBank收录的西农萨能羊MAT序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上并线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasyⅠ的E.coli Bj5183感受态细胞进行同源重组,得到重组腺病毒质粒pAd-MAT-HIS,并用PacⅠ酶切鉴定,将经过PacⅠ线性化的pAd-MAT-HIS转染HEK 293细胞进行病毒包装和扩增,用LaSRT法测定病毒滴度。将本次克隆的MAT序列与GenBank收录的山羊序列对比发现,在601bp处碱基由G转变为A,导致氨基酸序列由丙氨酸(Ala)201转变为苏氨酸(Thr)201。酶切鉴定、绿色荧光蛋白观察、PCR及Western blot检测均证明,重组腺病毒质粒构建成功,病毒滴度为2×109 PFU.mL-1。本研究成功构建了重组腺病毒pAdEasy-MAT-HIS。     

Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型VP60蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒,为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP60基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进行重组,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建重组腺病毒穿梭质粒,并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定;采用Ad Max腺病毒包装系统,基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组,构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞,通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证;利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3 895和1 752 bp的条带,测序比对结果显示,其与GenBank中公布的相应序列相似性>99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带;Western blotting结果显示,大小约为60 ku的VP60...     

绵羊Myostatin基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

针对绵羊Myostatin基因特异性序列,设计4对shRNA,并合成高表达载体。将干扰质粒和高表达载体瞬时共转染HEK293细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率,将筛选到最有效的shRNA表达载体和pDONR221载体进行BP重组反应,以获得含干扰序列的入门载体。然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行LR重组反应,以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。qPCR检测病毒物理滴度。结果本试验成功构建绵羊Myostatin基因RNAi慢病毒载体,病毒的滴度为：9.3×109 TU/mL。为研究Myostatin基因对肌肉生长的影响提供了稳定感染细胞载体。     

A型禽流感病毒H7N9株NS1基因的克隆和真核表达

目的:构建H7N9亚型禽流感病毒NS1基因真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的蛋白。方法:提取H7N9亚型禽流感病毒分离株总RNA,RT-PCR扩增获得NS1的全长基因,克隆至真核表达载体pRK中构建pRK-FLAG-NS1,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到293T细胞中,Western blot技术鉴定NS1蛋白的表达。结果:成功克隆了NS1全长基因,构建了H7N9毒株的NS1蛋白真核表达载体pRK-FLAG-NS1并转染于293T细胞中。结论:Western blot分析表明,NS1蛋白得到成功表达,为开展流感病毒蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。     

表达猪H1N1亚型流感病毒三聚体HA的重组慢病毒包装

以RT—PCR扩增猪H1N1流感病毒HA基因,用GS-linker使HA与GCN4pⅡ连接。构建慢病毒蛋白表达系统。通过观察荧光、病毒转导效率、SDS—PAGE、Western blot验证重组慢病毒包装和HA—GCN4pⅡ融合蛋白表达情况。该系统能使外源基因得到持久和稳定的表达。结果,包装获得能够融合表达HA-GCN4pⅡ的重组慢病毒LV—HA-GCN4pⅡ,病毒滴度为1．1×10^6TU／mL;LV—HA—GCN4pⅡ能有效转导293T细胞。本试验成功构建了表达HA—GCN4PⅡ融合蛋白的慢病毒表达载体,获得的重组慢病毒不仅为后续动物试验测定其诱导的体液免疫和细胞免疫水平奠定了基础,同时也为研制猪H1N1亚型流感疫苗做出了有益尝试。     

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的BHK细胞系的构建

猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。     

SREBP-1c基因重组腺病毒的构建及其在犊牛原代肝细胞中的表达

将携带有化学合成的SREBP-1c基因的质粒先用Xba Ⅰ酶切,Klenow补平突出末端,纯化回收后再用Hind Ⅲ酶切,切胶回收目的基因片段;并将其克隆至用EcoR Ⅴ/HindⅢ酶切回收的pShuttle-EGFP-CMV(-)TEMP穿梭载体上.经酶切鉴定后,重组穿梭质粒和腺病毒pAdxsi质粒分别用I-Ceu Ⅰ+I-Sce Ⅰ双酶切处理,T4DNA连接酶连接,获得重组质粒pAdxsi-GFP-SREBP1c,酶切鉴定后经Pac Ⅰ酶切线性化转染HEK293细胞,经包装扩增后用TCID50测定病毒滴度.以重组腺病毒感染犊牛原代肝细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中SREBP1c mRNA和蛋白的表达量.结果显示,重组腺病毒酶切鉴定正确,滴度可达1.2×1010,腺病毒感染犊牛原代肝细胞中SREBP-1c mRNA和蛋白的表达显著升高.结果表明,本试验成功构建了SREBP-1c基因过表达重组腺病毒,且SREBP-1c在犊牛原代肝细胞中高度表达.     

表达靶向禽流感病毒多靶点miRNA重组慢病毒的制备及病毒感染效率检测

慢病毒介导的RNAi具有转移基因效率高,作用持久稳定等特点,成为基因治疗和基因功能研究的重要工具。本试验中将在细胞水平验证可以抑制禽流感病毒(AIV)PA、NP和PB2基因表达的miRNA克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体,构建多靶点miRNA表达载体(pcDNA6.2/PA+NP+PB2);鉴定正确后通过BP/LR重组反应将GFP和靶向AIV串联miRNA转座到慢病毒表达载体pLenti6/DEST,命名为pLenti6/PA+NP+PB2;鉴定正确后与辅助包装质粒共转染293FT,72h收集细胞上清进行病毒浓缩;采用梯度稀释法和real-timePCR法测定病毒滴度;通过感染MDCK细胞、CEF细胞及猪胎儿成纤维细胞,评价重组慢病毒的感染效率。结果,酶切和测序表明pcDNA6.2/PA+NP+PB2和pLenti6/PA+NP+PB2构建成功;浓缩后梯度稀释法检测病毒滴度为4×107TU/mL,real-timePCR法检测病毒滴度为1×108TU/mL;病毒感染MDCK细胞和猪胎儿成纤维细胞的感染效率显著高于CEF细胞的感染效率。结果表明,我们成功制备了表达靶向AIV多靶点miRNA重组慢病毒,并发现以VSVG替代了env囊膜后慢病毒对CEF细胞敏感性较低,为进一步研究AIV的防控和慢病毒介导的抗AIV转基因动物模型奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP1基因siRNA重组腺病毒的构建及其介导的RNAi抑制口蹄疫病毒复制的研究

本研究选择O型FMDV VP1基因上保守序列作为可能的干扰位点,合成了siRNA,将siRNA克隆到pSIREN-Shuttle中,获得siRNA重组表达载体pShuttle-VP1。用限制性内切酶PI-Sce I和I-Ceu I双酶切siRNA重组表达载体和腺病毒质粒载体pAdeno-X,利用体外连接法获得了重组质粒。经过PCR扩增、酶切鉴定及序列测定,证明成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-VP1。利用脂质体转染法,将Pac I线性化的重组腺病毒质粒pAdeno-VP1转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒rAdeno-VP1。经过PCR鉴定正确后大量增殖,增殖的重组腺病毒经过浓缩、纯化得到了高滴度的病毒。用终点稀释法测定病毒滴度为2.5×109PFU/mL。将rAdeno-VP1感染IBRS-2细胞后,12 h后再加入100TCID50的FMDV O/HKN/2003。结果显示,重组腺病毒能够抑制FMDV的复制。     

新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析

构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段.     

A型流感病毒H7N9株PA和PAX基因的克隆和真核表达

本试验旨在克隆A型流感病毒H7N9株的PA和PAX基因并构建真核表达载体对其进行真核表达。从苏州分离株的鸡胚尿囊液中提取禽流感病毒RNA,通过RT-PCR技术获取PA以及PAX全长基因,经琼脂糖凝胶电泳获得纯化的目的基因;构建目的基因重组真核表达质粒,并利用双酶切及测序鉴定重组质粒;质粒DNA转染293T细胞真核表达,让其表达的蛋白产物通过Western Blot鉴定。其结果成功地在293T细胞内表达了PA与PAX蛋白,为进一步研究A型流感病毒PA与PAX蛋白的功能奠定了基础。