H3N2亚型犬流感病毒重组HA1蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种H3N2亚型犬流感病-毒(CIV)血清学检测方法,本研究利用CIV重组HA1蛋白作为检测抗原,建立H3N2亚型CIV抗体的间接ELISA检测方法,并优化反应条件.通过检测阴性血清样本30份确定其临界值为0.228.该方法与抗猪流感病毒H1N1、H1N2、H6N6、H9N2的阳性血清和犬瘟热病、犬细小病、犬副流感的阳性血清均无交叉反应.变异系数在1.01％～7.52％之间,具有较好的重复性.通过对150份临床样品进行检测并与血凝抑制试验检测结果比较,总符合率为98.6％.本研究为CIV流行病学调查提供了一种快速、方便、敏感的抗体检测方法.     

H3N2亚型犬流感病毒血凝及血凝抑制试验的研究

为优化H3N2亚型犬流感病毒(CIV)的血凝抑制(HI)试验方法,本研究应用不同种类红细胞进行CIV的血凝(HA)试验,应用不同种类红细胞和不同血清处理方法进行CIV的HI试验,评价其对HA和HI试验的影响。结果表明,H3N2亚型CIV对鸡和犬红细胞的凝集性最好,对小鼠、猪和牛红细胞的凝集性较差。HI试验应用鸡红细胞悬液效果最好,受体破坏酶(RDE)和高碘酸钾处理可以有效去除犬血清中非特异血凝抑制素,但高碘酸钾对血清特异性抗体有损耗。本研究筛选出H3N2亚型CIV HI试验的最佳方法,为犬流感的血清学诊断提供技术支持。     

检测禽流感病毒抗体的重组核蛋白间接ELISA方法的建立

以大肠杆菌系统表达的H9N2亚型禽流感病毒（AIV）核蛋白（NP）为抗原，建立了禽流感间接酶联免疫吸附试验抗体检测技术（NP—ELISA）。对263份待检血清（包括临床收集的243份血清和20份H9N2亚型AIV免疫鸡阳性血清）进行检测，NP—ELISA与琼脂免疫扩散试验（AGP）的总符合率为83．3％，与血凝抑制试验（HI）的总符合率为92％。特异性试验表明，NP—ELISA方法可以检测H5、H7和H9亚型AIV特异性抗体，检测为阳性的血清样品能够被阳性鸡胚尿囊液阻断。敏感性试验证实，NP—ELISA最早可以检测鸡感染后7d的血清样品，并于感染后10d确定100％血清阳性，而AGP检测直到首免后21～28d才出现部分血清阳性，HI检测直到10～14d才出现部分血清阳性，并且NP-ELISA要比HI敏感4～40倍。试验证明，NP—ELISA是检测AIV血清型特异性抗体的一种特异、敏感、快速、经济的血清学检测技术。     

一株H3N2亚型犬流感病毒的分离鉴定

从北京市延庆区某疑似发生犬流感的德国牧羊犬采集犬鼻拭子,采用鸡胚接种、传代、HI试验、HA和NA基因扩增和序列同源性分析及比格犬回归试验等方法对病毒进行分离鉴定。结果表明,分离的病毒具有HA活性,且HA活性可被H3亚型禽流感病毒阳性血清所抑制(HI抗体效价为1∶160),与H1、H5、H7亚型禽流感病毒阳性血清和犬流感阴性血清HI试验均为阴性反应(HI抗体效价1∶10)。分离病毒HA基因、NA基因与A/canine/Georgia/89750.1/2017(H3N2)毒株HA、NA基因的同源性均为99.8%。攻毒后第4天开始,2只犬均出现体温升高、咳嗽、流鼻和精神沉郁等临床症状,并从鼻拭子中分离到病毒,该病毒是一株H3N2亚型的犬流感病毒,将其命名为A/canine/China/Huabei-170607/2017(H3N2)。     

犬流感(H3N2亚型)血清学调查

为了解广东地区犬流感(CI)流行情况,以期为犬流感的预防提供参考依据,本研究采用ELSIA方法及血凝抑制试验(HI),对广东省内6地市的1440份犬血清样品进行抗体检测。结果显示,1440份犬血清中犬流感抗体平均阳性率为7.92%(ELISA)和6.25%(HI)。其中广州、深圳和惠州地区的犬流感抗体阳性率较高。1～3岁犬的犬流感抗体阳性率高于其他年龄段犬,雄性犬犬流感抗体阳性率高于雌性。结果表明,H3N2亚型犬流感病毒在广东局部地区流行。鉴于当前在部分地区CIV阳性率较高,结合CIV在犬群中迅速传播的流行特点,要避免CIV暴发流行及对人类的健康造成威胁,对于CIV的防制应结合当地实际情况,制定切实有效的防制措施。     

中国畜牧兽医2013年第40卷第2期犬流感(H3N2亚型)血清学调查

为了解广东地区犬流感(CI)流行情况,以期为犬流感的预防提供参考依据,本研究采用ELSIA方法及血凝抑制试验(HI),对广东省内6地市的1440份犬血清样品进行抗体检测。结果显示,1440份犬血清中犬流感抗体平均阳性率为7.92%(ELISA)和6.25%(HI)。其中广州、深圳和惠州地区的犬流感抗体阳性率较高。1～3岁犬的犬流感抗体阳性率高于其他年龄段犬,雄性犬犬流感抗体阳性率高于雌性。结果表明,H3N2亚型犬流感病毒在广东局部地区流行。鉴于当前在部分地区CIV阳性率较高,结合CIV在犬群中迅速传播的流行特点,要避免CIV暴发流行及对人类的健康造成威胁,对于CIV的防制应结合当地实际情况,制定切实有效的防制措施。     

Re-8株H5亚型禽流感灭活疫苗对野鸟源H5N8流感病毒的免疫保护性研究

为评估当前应用的Re-8株种毒相关禽流感灭活疫苗对野鸟源H5N8流感病毒的免疫预防效果,本研究将重组禽流感病毒(AIV)H5亚型Re-8株灭活疫苗(H5N1亚型,Re-8株)和重组AIV(H5+H7)灭活疫苗(H5N1Re-8株+H7N9 H7 Re-1株)分别以0.3 m L/只的剂量接种3周龄SPF鸡,免疫3周时进行HI抗体检测和攻毒试验。结果显示,上述2种疫苗免疫的SPF鸡血清中针对H5亚型Re-8株抗原的HI抗体均在8 log2以上,以105EID50的剂量、鼻腔感染途径攻击野鸟源H5N8病毒BHG/QH/2/16和BHG/Tibet/3/16后,所有免疫组鸡在14 d观察期内均全部健活,不排毒,而对照组鸡在攻毒后4 d内全部发病、死亡、排毒。现地免疫重组AIV H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)的商品蛋鸡直接进行HI抗体检测和攻毒试验,结果显示,免疫蛋鸡血清中针对Re-8株抗原的HI抗体平均滴度为8.3 log2,以相同攻毒方式和剂量分别攻击2株H5N8病毒后,免疫鸡也获得完全免疫保护,不发病、不死亡、不排毒。本研究结果表明,含有重组AIV H5 Re-8株抗原的灭活疫苗可有效防控野鸟源H5N8流感病毒,为我国及其他国家H5N8亚型禽流感免疫防控提供了科学依据。     

H3N2亚型犬流感病毒NP蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

将分离的H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)株的核蛋白(NP)基因克隆至原核表达载体p ET28a(+)中,构建重组表达质粒p ET-NP,然后转化大肠杆菌E.coli Rosetta(DE)感受态细胞,经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果显示,大肠杆菌表达的重组NP蛋白的分子量约为61 k Da,与预期相符,并能与犬CIV阳性血清发生特异性反应。将表达的重组NP蛋白进行纯化后,免疫大白兔制备抗NP蛋白多克隆抗体血清,Western blot检测该血清可与CIV的NP蛋白发生特异性反应,间接ELISA检测该多克隆抗体血清的效价达1:30 000,显示了较高的抗体效价。本研究为CIV快速检测方法的建立和流行病学调查奠定了科学依据。     

检测流感病毒H5亚型抗体竞争ELISA方法的建立及初步应用

本研究采用灭活的H5亚型禽流感纯化病毒包被ELISA反应板,以辣根过氧化物酶标记的HA蛋白单克隆抗体作为竞争检测抗体,建立了检测H5亚型流感病毒抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法.实验结果表明:抗原最佳包被浓度为8.27ug/mL(1:800),酶标抗体最佳稀释倍数为1:800,待检血清最佳稀释倍数为1:10.对已知阳性样品的检测结果表明,本研究中所建立的竞争ELISA方法的敏感性高于经典的血凝抑制方法(HI).特异性试验表明该ELISA方法仅能检测H5亚型流感病毒抗体,具有良好的特异性.对临床样品检测表明C-ELISA与HI 方法的符合率达到93%以上.该方法可以对不同种属动物血清H5亚型流感病毒抗体进行快速定量的检测,为H5亚型流感病毒流行病学调查与抗体的检测提供了一种快速、方便、敏感的方法.     

应用PPA-ELISA检测貉(犬、水貂)细小病毒性肠炎特异性抗体的研究

选用犬细小病毒(CPV)作抗原,酶联SPA作间接抗体,在对120例貉、犬及貂的已知各种血清样品和现地血清样品的各种试验数据考证下,建立了本方法。本方法与HI试验的符合率为88.4％,比HI多检出12例(11.5％);测出的阳性血清的最高滴度是HI的12.5倍。血清样品与血清干燥纸片样品的检出符合率为98％。本方法能检出貉细小病毒抗体,犬和水貂病毒性肠炎抗体,是一种特异、敏感,简易的诊断方法。     

供港猪群流感病毒的分离鉴定及流行病学调查

为了对供港猪群中的猪流感流行情况进行分析,从华南地区供港猪群中用无菌棉拭子采集鼻腔粘液样品,采用鸡胚接种方法,从供港猪群中分离出了2株不同亚型的猪流感病毒株,经国家流感中心鉴定分别为H1N1和H3N2亚型。本研究设计了猪流感常见亚型的HA和NA分型特异性引物,建立了猪流感型特异性RT-PCR检测方法;对分离鉴定的2株猪流感病毒和禽流感H5N1 HI检测抗原进行了RT-PCR检测,并对其部分HA和NA基因进行克隆测序分析。对供港猪群的血清检测结果表明:供港猪群中H1N1和H3N2亚型抗体阳性率分别为26.87%、38.26%,禽流感H5N1和H9N2亚型抗体阳性率均为0%。     

广东省部分地区规模化猪场猪流感病毒感染的血清学调查与分析

为了解广东省规模化猪场猪流感病毒(SIV)感染情况,本研究采用ELISA方法和血凝抑制试验(HI),对2011年～2012年采集的1 050份血清样品进行SIV血清学检测.两种检测方法结果显示1 050份血清样品中SIV抗体阳性率分别为50.4％(ELISA)和50.2％(HI).其中珠三角地区和粤东地区的感染率高于粤西地区.SIV亚型调查结果显示该地区流行的SIV主要为H1和H3亚型,抗体阳性率分别为39.2％和18.2％(ELISA).部分猪场存在H9亚型SIV抗体.部分猪群中同时存在H1和H3两种亚型SIV抗体,表明猪群中存在不同亚型SIV混合感染.本研究为广东省猪流感的预防提供参考依据.     

H3N2亚型犬流感病毒头部缺失血凝素蛋白的真核表达及抗原性研究

为获得一种针对不同亚型流感病毒的共同保护性抗原,本研究以H3N2亚型犬流感病毒(canine influenza virus, CIV)的主要抗原蛋白血凝素(HA)为靶标,以四甘氨酸接头肽替换HA头部结构域,将免疫反应定向至更保守的HA茎部区,同时在HA茎部添加T4折叠三聚体以保护蛋白天然构象,通过杆状病毒表达系统表达头部缺失HA蛋白,并验证其抗原性。结果表明,利用昆虫细胞表达的头部缺失,HA蛋白单一性较好,分子量为47 ku,与CIV全病毒血清抗体可发生特异性结合反应,且头部去除区HA蛋白血清抗体可抑制H1N1和H3N2亚型流感病毒感染所致的细胞病变效应,中和效价分别为1∶160和1∶320。研究结果为制备针对不同亚型流感病毒(如H1N1和H3N2)的广谱疫苗提供了可能。     

新疆哺乳动物流感病毒血清学监测与分析

为了解新疆地区哺乳动物流感病毒的感染流行情况,本研究于2009年～2011年对新疆6个地区的5种哺乳动物进行流感病毒部分亚型的血清学监测,采集猪血清样品1 519份、马血清样品1 095份、驴血清样品802份、狗血清样品130份和猫血清样品40份.用HI方法进行流感病毒血清学监测.结果表明,猪血清中流感病毒H1亚型抗体阳性率为0～31.5％,H3抗体阳性率为0.75％～5.32％,H5亚型抗体阳性率为0～2.7％,H9亚型抗体阳性率为0～10.19％;马血清和驴血清样品的流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亚型抗体均为阴性;狗血清流感病毒H9抗体阳性率为1.75％;猫血清样品流感病毒H1抗体阳性率为2.5％.     

遵义地区H3N2亚型犬流感病毒血清学调查

为了解遵义地区H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)感染情况,本研究采用酶联免疫吸附试验对遵义市区及周边农村收集的320份血清样本进行了抗体检测。结果显示,遵义地区H3N2亚型CIV抗体整体阳性率为8.44%(27/320);农村田园犬抗体阳性率(9.24%)高于市区宠物犬(7.96%),但差异不具有显著统计学意义(P0.05);雄性犬的抗体阳性率(8.79%)高于雌性(7.97%),差异不显著,不具有统计学意义(P0.05);1～3岁的青年犬抗体阳性率最高(9.63%),其次为幼犬(8.62%),3岁以上犬最低(6.25%),差异不显著,不具有统计学意义(P0.05)。结果表明,遵义地区存在H3N2亚型犬流感病毒感染,相关部门应加强防范。     

H3亚型猪流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法的建立

为快速检测H3亚型猪流感病毒(SIV),本研究将一株H3N2亚型SIV特异性单克隆抗体(MAb)进行纯化,建立了以多抗作为包被抗体,MAb作为检测抗体的H3亚型SIV抗原捕捉ELISA (AC-ELISA)方法.并对该方法的特异性和敏感性进行了分析,其敏感性是血凝试验的4倍,与猪繁殖与综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒以及H1、H5、H9亚型SIV均没有明显的交叉性反应,批间和批内重复试验变异系数均小于10％.应用建立的AC-ELISA方法对84份H3亚型SIV实验室感染样品进行检测与鸡胚滴定病毒结果符合率达90.47％.本实验建立的AC-ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,可用于H3亚型SIV的临床检测.     

禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测方法的建立

将禽流感病毒H7亚型标准抗原作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫合格的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合。通过血凝抑制试验,筛选得到12株杂交瘤细胞上清具有HI效价,且与禽流感病毒H7亚型阳性血清间具有较好的竞争效果。将竞争效果最好的1H11细胞扩大培养后制备腹水,获得的单克隆抗体具有效价高、特异性好等特点。使用H7标准抗原包被ELISA板,将HRP标记的单克隆抗体作为竞争抗体,建立了一种禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测方法。利用该方法对待检血清进行测试,与HI试验有99.3%的符合率,说明试制的禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒可以用来检测禽流感病毒H7亚型抗体,且操作简便快捷,可批量操作,大样本检测鸡群抗体水平。     

犬瘟热重组N蛋白抗原间接ELISA方法的建立及应用

本研究以纯化的犬瘟热病毒（CDV）重组N蛋白为诊断抗原,建立了犬瘟热病毒抗体检测的间接ELISA诊断方法,将其命名为rN-CDVELISA。确定最佳抗原包被量为0．167μg/孔,待检血清最佳稀释倍数为1：100,其作用时间为45min,羊抗犬酶标抗体稀释倍数为1：2000,作用时间为60min,S／P值≥0．208者判为阳性,S／P值≤0．16者判为阴性,介于两者之间者判为可疑。该抗原不与犬细小病毒、犬传染性肝炎、犬副粘病毒、犬波特氏杆菌等4种疾病的阳性血清反应,具有良好的特异性;批内、批间重复试验,变异系数均小于15％,具有良好的重复性;检测血清样品96份,与进口诊断试剂盒的符合率为97．1％。本研究为现地免疫犬群抗体检测和进行CDV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。     

广东1株H3N2亚型犬流感病毒的分离与鉴定

本试验采集一只具有流感临床症状的病犬鼻咽拭子经常规处理后接种SPF鸡胚,分离到一株流感病毒,并对其进行鉴定及生物学特性研究。结果表明,该毒株对1%鸡红细胞的血凝价为26,能被H3亚型流感病毒阳性血清中和,与H1、H5、H7、H9亚型阳性血清和阴性血清无交叉反应。序列分析显示,该毒株的HA和NA基因核苷酸序列分别与犬流感病毒(CIV)H3和N2亚型的病毒株同源性最高。确定该毒株为H3N2亚型CIV,并将其命名为A/canine/Guangdong/01/2011。     

2016年我国部分地区屠宰场猪流感血清学调查

目前,全球范围内流行的猪流感病毒亚型主要有3种:H1N1、H3N2、H1N2,此外,H1N7、H4N6、H9N2、H5N1、H3N3、H3N1和H2N3等亚型病毒也在猪体内分离到,但没有证据显示这些病毒在猪体内建立稳定的谱系。为了解我国屠宰场猪群中流感病毒的感染与流行情况,选取2009年甲型H1N1(pdm/09)、欧洲类禽H1N1(EA H1)、经典H1N1(经典H1)、新型三源重排H1N1(ReH1)、H3N2(H3)、H9N2(H9)流感病毒制备的血凝抑制(HI)标准抗原作为检测抗原,对全国25个屠宰场的猪血清进行了HI抗体的检测。结果显示,2016年我国屠宰场样品中,pdm/09、EA H1、经典H1、Re H1、H3、H9抗体阳性率分别为23.18%、28.12%、19.34%、24.97%、7%、7.41%;在所监测地区中,华南地区屠宰场猪流感血清平均抗体阳性率最高。结果表明,2016年我国屠宰场猪群中H1N1亚型猪流感病毒感染比较普遍,H3N2和H9N2亚型猪流感病毒抗体阳性率较低。