表达EGFP重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建与鉴定

RT-PCR获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)XZ06a株基因组,在基因组5'末端、3'末端分别添加锤头样核酶、丁型肝炎病毒核酶序列,并插入改造的pCAGEN表达载体中,构建DNA-launched感染性克隆,然后在病毒基因组ORF1b与ORF2间引入ORF6 TRS序列、酶切位点及EGFP基因,转染Marc-145细胞拯救表达EGFP的重组病毒并噬斑克隆纯化,Western blot检测EGFP表达并对获得的表达EGFP的重组病毒进行TCID_(50)测定与分析。结果显示:PRRSV基因组大小为15 145 nt,转染后5～7 d即可观察到重组病毒所致特异性病变灶,经过噬斑纯化,能够观察到携带EGFP基因的重组病毒在对应病变灶均有绿色荧光,最终获得稳定表达EGFP的重组病毒,且重组病毒感染16 h时即可检测EGFP表达;与亲本病毒相比,表达EGFP重组病毒致细胞出现病变时间有所延长,增殖滴度有所降低。本研究成功构建了表达EGFP的重组PRRSV,为开展PRRSV病毒复制机制、感染特性、致病机制、疫苗开发等研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

采集临床疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料,经处理后进行细胞培养、电镜观察、半数细胞感染量测定、间接免疫荧光试验、动物回归试验以及RT-PCR检测,分离到1株病毒。分离株在Marc-145细胞上连续4代后出现特异性细胞病变;电镜观察到直径50~80 nm的病毒粒子,有囊膜;TC ID50为10-4.7/0.1 mL;与美洲型PRRSV阳性血清进行间接免疫荧光试验可见特征性荧光;RT-PCR检测结果为阳性;回归40日龄血清阴性仔猪可出现PRRSV感染的典型临床症状和病理变化,并且可检测到血清中的特异性抗体。结果表明分离株为PRRSV,命名为PRRSV-SCH07。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

从广东地区发病猪场的病料中,分离到1株致Marc-145细胞病变的病毒ShB6。扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要结构蛋白基因ORF2-ORF7并进行序列分析,结果表明,该分离株与国内PRRSV分离株HB-1(sh)/2002的同源性为96.9%;与ATCC VR-2332株的同源性为91%;而与Lelystad株的同源性仅为59.8%;用美洲型PRRSV单抗进行免疫组化染色,结果显示在细胞病变处呈现明显的阳性着色(为棕黄色)。综合可见,所分离的病毒为美洲型PRRSV。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

从辽宁某猪场采取病料,经处理后接种Marc-145细胞进行PRRSV分离,结果有2份病料在该细胞上盲传后可见典型的CPE,经测定其毒价为10^-6.5TCID₅₀/mL。间接免疫荧光试验可见黄色荧光,用电镜对纯化的病毒进行观察,可见有囊膜包裹的圆形病毒粒子,直径约为50~70 nm。该病毒对氯仿、紫外线、酸碱度变化和热敏感。对有CPE的细胞培养物进行RT-PCR,结果为阳性。接种试验动物出现典型的PRRS临床症状和死亡。结果表明,成功分离到一株PRRSV。     

山羊痘病毒非必需基因区gp024基因的鉴定

为筛选山羊痘病毒(GTPV)的外源基因插入区,本研究以GTPV Pellor株为模板,设计2对引物,PCR扩增AV 41株GTPV_gp024基因相邻上下游长度约1.1 kb的同源重组片段,分别插入质粒pGPT-EGFP中.插入部位在痘病毒双向启动子p11～p7.5启动的报告基因EGFP-GPT上下游,构建转移载体pEG024,并转染已感染GTPV Av 41病毒的LT细胞,经GPT加压筛选7代后得到重组病毒.结果显示,重组病毒稳定表达报告基因EGFP,从而表明GTPV_gp024基因能够作为外源基因的插入区.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的严重繁殖障碍和呼吸道疾病。PRRSV为动脉炎病毒属的不分节段的单股正链RNA病毒,含有8个开放阅读框(ORFs),其中ORF6编码的非糖基化膜蛋白(M)为其优势结构蛋白,是PRRSV中较保守的蛋白,具有良好的免疫原性,可作为疫苗候选基因研究和建立诊断方法。论文阐述了PRRSV M基因的研究进展,并对基于M基因工程疫苗和检测技术等进行综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为重组表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白,本研究将RT-PCR获得的PRRSV CH-1a株M蛋白基因,克隆于pMD18-T载体中,经测序鉴定正确后,亚克隆至牛痘病毒重组转移质粒pSC11中,构建了转移重组质粒pSC11-PRRSV-M。将pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,在含有X-gal的琼脂培养基上通过蓝斑筛选含有PRRSV M基因的重组病毒rWR-PRRSV-M。Western blot与IFA检测表明,重组病毒成功表达了PRRSV M蛋白,而且所表达的蛋白保持了良好的免疫原性。动物实验表明,rWR-PRRSV-M所表达的PRRSV M蛋白在免疫小鼠体内诱生了抗PRRSV的抗体。rWR-PRRSV-M的构建,为进一步探讨PRRSV M蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与初步鉴定

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与初步鉴定杨汉春管山红＊尹晓敏＊甘孟侯（中国农业大学动物医学院，北京海淀１０００９４）猪繁殖与呼吸综合征（ＰＲＲＳ）是猪的一种新病毒性传染病，首先在北美洲和欧洲发现，曾有“蓝耳病”、“神秘病”等之称［１，２］。该病现已遍布...     

我国猪繁殖和呼吸综合征病毒基因型鉴定

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从我国东北和华北地区分离的２个猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）毒株中扩增获得部分核衣壳蛋白基因。该基因片段长度与美洲型野毒株ＶＲ２３３２ＲＴ－ＰＣＲ扩增片段相同,均为４３３ｂｐ,长于欧洲型Ｌｅｌｙｓｔａｄ毒株扩增片段长度（３９５ｂｐ）。此外,用另１对引物,从这２个分离毒株及ＶＲ２３３２毒株扩增获得部分ＧＰ５蛋白基因,其限制性酶切片段长度多态性分析结果相同或相似。该结果表明,我国不同地区流行的ＰＲＲＳＶ可能属于同一毒株,并且来源于美洲。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的高度接触性传染病。主要引起母猪繁殖障碍,表现为妊娠后期流产,死胎,木乃伊胎及弱仔;各日龄段的猪特别是仔猪感染PRRSV引起呼吸道疾病,以间质性肺炎为特征,论文主要从近几年研究的PRRSV的非结构蛋白特性、免疫学功能、非结构蛋白基因的变异等方面进行分析,阐述非结构蛋白在病毒的增殖、致病力产生的影响,从而为进一步的研究提供一定的理论基础。     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

从蓝耳病疑似患猪病料中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒。试验采用细胞培养、RT-PCR、免疫荧光技术等进行病毒的分离和鉴定。结果表明:Marc145细胞接种出现典型的细胞病变,毒价为5.5×105 TCID50/m L,RT-PCR扩增出特异性长度为559bp的DNA片段,用PRRSV N蛋白单克隆抗体为一抗,羊抗小鼠Ig G-FITC为二抗进行免疫荧光检测,检测到接种病毒的Marc145细胞中特异性荧光信号。说明该分离株为猪繁殖与呼吸综合征病毒。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是一种遍布于全世界的高度传染性疾病,其病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）。感染PRRSV后,最先在机体内进行表达的是非结构蛋白（nonstructural proteins, NSPs）,PRRSV基因组编码区经翻译后至少产生14种NSPs（NSP1α、NSP1β、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6、NSP7a、NSP7b、NSP8、NSP9、NSP10、NSP11、NSP12）,这些NSPs在病毒增殖、病毒毒力、免疫学特性等方面都发挥着重要作用。作者就NSPs的研究进展进行简要概述,以期为PRRS疫苗研发及技术防控奠定基础。     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

在对东北某猪场新引入的处于隔离期的种公猪群进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)及猪伪狂犬病毒(PRV)的本底调查时,应用RT-PCR从一头表观正常的种公猪体内检测到PRRSV,分离此株病毒并对其重要结构蛋白基因GP5进行克隆测序、系统进化树分析。结果显示,此株病毒属于美洲型PRRSV,其与高致病性PRRSV代表株(HEB1、HUB2、JXA1)的同源性分别为99%,99%和99.2%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以纯化的PRRSV全病毒抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体,并测定其免疫球蛋白亚类、效价和特异性。结果成功获得2株能稳定分泌抗PRRSVM蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞,命名为3C3、3D2,经鉴定亚类均为IgG2a、kappa链。2株单克隆抗体腹水ELISA效价达105～107,IPMA效价达1:2560～1:10240,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒等无交叉反应。结论获得特异性针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体,为研究该病的快速诊断技术奠定基础。     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

为了对从湖南某发病猪场送检的血清中分离到的1株蓝耳病病毒进行鉴定,试验通过接种Marc-145细胞传代后产生明显而稳定的细胞病变,又经过RT-PCR及间接免疫荧光(IFA)检测成功验证;通过对分离株的ORF5基因的测序结果表明,ORF5核苷酸序列与欧洲型代表株LV株及北美经典毒株VR-2332、国内经典美洲株CH-1a的相似性分别为64.5%、87.4%、93.0%,说明其属于美洲型;而将NSP2高变区的测序结果与JXA1等高致病性变异株的Nsp2比较后发现,都在同一位置不连续缺失30个氨基酸。说明成功分离到1株北美型变异株,最终将其命名为PRRSV CZ-HN株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒概述

##正##猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸衰竭为主要症状的一种传染病[1]。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的接触性传染病,主要引起怀孕母猪后期流产、早产、死胎和木乃伊胎增多,仔猪出现呼吸道症状和断奶前死亡率增高。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展

<正>猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),又称蓝耳病,主要会导致母猪早产、流产、产死胎或木乃伊胎,仔猪和育成猪出现呼吸道疾病,且死亡率高。该病最初于20世纪80年代在美国被首先报道,2006年起在我国大面积爆发。PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)     

1株重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组特征

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）不断发生变异,其防控难度也逐渐增加。为了及时监测PRRSV在自然感染背景下的遗传进化特点,本研究从上海某发病猪场的临床样品中分离获得1株PRRSV毒株,命名为SHpd1/2018株,并对其生物学特性和基因组序列进行分析。结果表明,该毒株基因组全长为15 018 bp（不含poly A）,不能被针对HP-PRRSV强毒HuN4株的Nsp2的单抗所识别,但其增殖特性与强毒HuN4株相似。序列分析表明,SHpd1/2018株与HP-PRRSV强毒株的相似性最高（与HuN4相似性为94.3%）。重组分析结果显示,SHpd1/2018株是以HP-PRRSV-like为主要亲本毒株,NADC30-like为次要亲本毒株的重组病毒,两个重组断点nt 2002和nt 3205均位于Nsp2基因的高变区。研究证实SHpd1/2018株是1株发生变异重组的PRRSV分离株,该毒株是上海某猪场保育猪发病的主要原因。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒安徽株的分离与鉴定

从安徽地区的发病猪场的病料中,分离到3株致Marc-145细胞病变的病毒（命名为AH1、AH2、AH3）,负染电镜观察结果可见直径约50 nm的有囊膜的球形病毒粒子,细胞超薄切片可见病毒粒子分散在细胞浆内,直径为40～80 nm。理化特性研究结果表明,3株分离毒均对氯仿、乙醚、甲醛、温度(56 ℃)敏感;间接免疫荧光试验结果显示,分离株与美洲型PRRS阳性血清反应,发出强特异性荧光;对分离毒株Nsp2基因序列分析发现：安徽分离毒株Nsp2基因存在两处共90个碱基缺失现象,与JXA1 PRRSV变异株亲缘性最近。初步鉴定该分离株为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。