猪肠道菌氨基糖苷类药物耐药基因分析

为调查和分析猪肠道菌的氨基糖苷类药物耐药机制,用PCR及序列分析方法检测鉴定2个猪肠道菌中4种16S rRNA甲基化酶耐药基因rmtA、rmtB、rmtC和armA和10种氨基糖苷钝化酶基因,用接合试验研究rmtB基因和10种氨基糖苷钝化酶基因的水平转移机制,用微量稀释法测定携带rmtB基因的分离菌及其接合子对20种抗菌药物的敏感性.结果,从分离的152株猪肠道菌中共检测到49株(32.3%)rmtB阳性菌,其中48株为大肠埃希氏菌,1株为阴沟肠杆菌,未检出其它16S rRNA甲基化酶编码基因.49株rmtB阳性菌中检测到7种氨基糖苷类钝化酶基因,检出率从高到低依次是aac(3)-Ⅱ(87.8%)、aph(3′)-Ⅶ(79.6%)、aph(3′)一Ⅱ(77.6%)、aadAJ(34.7%)、aacc(6′).-Ⅰb(14.3%)、aac(3)-Ⅳ(10.2%)和aph(4)-Ⅰ(8.2%).46株rmtB阳性菌可以通过接合试验将rmtB、aac(3)-Ⅱ、aph(3′)-Ⅶ、aph(3′)-Ⅱ和aadA基因传递给受体菌E.coli C600和E coli 488 Rifr,接合率从3.0×10-6～4.6×10-13不等.所有rmtB阳性菌株及其接合子对卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、西梭米星、萘替米星、庆大霉素6种氨基糖苷类抗生素均高度耐药(MIC≥512 Pg·mL-1).研究结果表明,rmtB基因和氨基糖苷钝化酶基因广泛存在于两猪场,它们共同介导猪源肠道菌对庆大霉素、阿米卡星等氨基糖苷类药物的高度耐药.rmtB基因与aac(3)-Ⅱ·aph(3′)一Ⅶ、aph(3′)-Ⅱ和aadA基因位于同一接合性质粒上,共同传播氨基糖苷类的耐药性.     

鼠伤寒沙门氏菌双组分系统arcB基因缺失株的构建及药物敏感性分析

为探究双组分系统arcB基因对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响,本研究利用Red同源重组系统构建arcB基因缺失株和arcB基因回复株以及通过无缝克隆和重组技术构建3株arcB基因关键位点点突变株。采用微量稀释法测定亲本株、arcB缺失株、回复株及点突变株药物敏感性和体外生长速率,初步分析双组分系统arcB基因对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响。结果显示,经PCR测序鉴定结果表明构建了鼠伤寒沙门氏菌CVCC541ΔarcB缺失株及其回复株、arcB基因点突变株(arcB~(His-292-Ala)、arcB~(Asp-576-Ala)、arcB~(His-717-Ala))。生长曲线测定结果显示:缺失株、点突变株和亲本株相比生长速率降低,回复株生长速率回复,与亲本株生长曲线一致;MIC测定结果显示:与亲本株相比,arcB基因缺失株对β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类抗生素的敏感性无变化,但对氨基糖苷类的链霉素、阿米卡星、庆大霉素的耐药性分别增加16、8、4倍;基于该结果测定的各菌株对氨基糖苷类抗生素的MIC结果显示:与亲本株相比,arcB基因缺失株对链霉素、妥布霉素、庆大霉素的耐药性增加8倍,对阿米卡星、新霉素、奈替米星、卡那霉素的耐药性增加4倍,对大观霉素的敏感性未发生变化;而回复株与亲本株药物敏感性相似;arcB基因关键位点突变株的药物敏感性与arcB基因缺失株一致。以上结果表明,arcB基因参与鼠伤寒沙门氏菌对氨基糖苷类抗生素耐药性的调控。上述实验结果为深入研究双组分系统对鼠伤寒沙门氏菌的耐药机制提供实验依据。     

鸡源铜绿假单胞菌氨基糖苷类耐药特性研究

为了解铜绿假单胞菌(PA)的氨基糖苷类耐药机制,用纸片扩散法检测分离自鸡场的50株PA对6种氨基糖苷类药物的敏感性,用PCR法检测7种氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因和5种16 S rRNA甲基化酶基因。结果显示:50株PA中45株对氨基糖苷类药物耐药,36株表现出多种氨基糖苷类药物耐药。50株菌中共有45株检测到耐氨基糖苷类药物基因,总检出率为90.0%。AMEs基因aac(3)-Ⅱ、ant(3′′)-Ⅰ、aph(3′′)-Ⅰb、aph(6′)-Ⅰd、aac(6′)-Ⅰb、ant(2′′)-Ⅰ的阳性率分别为88.0%、50.0%、44.0%、24.0%、20.0%、4.0%,16 S rRNA甲基化酶armA基因的阳性率为2.0%,其余5种基因均未检出。提示PA对氨基糖苷类耐药与产AMEs和16 S rRNA甲基化酶有关。     

猪源大肠埃希菌药敏试验及耐药基因检测

为调查云南省某规模化猪场大肠埃希菌(E.coli)对氨基糖苷类药物的耐药性及耐药基因aadA1和aph(3′)的携带情况,采用K-B(Kirby-Bauer)法检测51株E.coli对6种氨基糖苷类抗生素的耐药性,同时对2个目的基因片段aph(3′)和aadA1进行PCR扩增。结果显示,51株猪E.coli对链霉素、新霉素、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素的耐药率分别为49.0%、35.3%、47.1%、43.1%、15.7%及70.6%;利用PCR技术检测氨基糖苷类药物的相关耐药基因,其阳性检出率依次为aph(3′)(86.27%)和aadA1(54.90%)。结果表明,云南楚雄某猪场撒坝猪E.coli耐药性普遍存在,对氨基糖苷类抗生素存在多重耐药,其中以二重耐药为主,2个耐药基因检出率偏高。因此,猪场应该针对性选择用药,规范使用抗生素,从而延缓和减少耐药性的产生,促进社会公共卫生的发展。     

猪源大肠杆菌氨基糖苷类药物敏感性测定及rmtB耐药基因流行性分析

为了解闽西地区规模化猪场大肠杆菌对临床常见氨基糖苷类药物的敏感性及rmt B耐药基因流行情况,试验对从11个规模化猪场采集的237份猪肛门拭子进行菌株分离与鉴定,采用琼脂二倍稀释法测定分离得到的菌株对氨基糖苷类药物的最低抑菌浓度(MIC),并通过PCR方法检测rmt B耐药基因流行情况。结果表明:通过分离培养得到230株大肠杆菌,经生化鉴定和16S rRNA分析符合大肠杆菌特征;分离菌株对链霉素的耐药率最高为61.3%(141/230),阿米卡星耐药率最低为22.2%(51/230),庆大霉素和卡那霉素的耐药率分别为56.1%(129/230)和42.6%(98/230);PCR检测显示,有36株大肠杆菌携带rmt B耐药基因,检出率为15.7%(36/230)。说明闽西地区大肠杆菌对氨基糖苷类药物耐药性较为严重,rmt B基因在菌群中流行较广。     

贵州省猪源大肠杆菌16SrRNA甲基化酶基因调查与转移情况的研究

对贵州省规模化养猪场的167株大肠杆菌进行16SrRNA甲基化酶基因的流行及转移情况研究,为氨基糖类药物在兽医临床上的合理使用提供理论参考。采用微量肉汤稀释法测定药物敏感性,聚合酶链反应(PCR,Polymerase Chain Reaction)方法检测16SrRNA甲基化酶基因的携带和转移。结果显示,阿米卡星、卡那霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素的平均耐药率分别为17.5%、67.8%、80.9%、77.67%和75.33%。检测到rmt B 8株,检测率为4.8%,未检测到arm A。由此可知,rmt B基因可转移至沙门氏菌和大肠杆菌,转移之后的菌株对大部分抗菌药物耐药水平大幅提高。     

猪场环境大肠杆菌qnrA和aac(6’)-Ib基因检测

为了解质粒介导的喹诺酮类抗生素耐药基因qnrA、aac(6’)-Ib-cr在猪场环境大肠杆菌的流行分布及变异情况,从贵州省规模养猪场空气、污水、粪便和土壤样本中分离、鉴定大肠杆菌57株,PCR检测qnrA和aac(6’)-Ib基因,测序分析aac(6’)-Ib-cr基因变异体,并用药敏纸片琼脂扩散法测其对喹诺酮类和氨基糖苷类的耐药性。结果表明:57株大肠杆菌均未携带qnrA基因;8株检出aac(6’)-Ib基因,分别来自污水、粪便和土壤样本,且介导对喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素的广泛耐药性。E.coli3和E.coli4在第75(A)、76(G)或488位(A)碱基缺失;E.coli5在第222位(A→T)变异,E.coli1、E.coli2、E.coli3、E.coli4、E.coli5、E.coli7和E.coli8在223位(T→C)和454位(G→T)变异;E.coli3、E.coli4在第492位有A、C碱基增添。说明贵州省规模养猪场肠杆菌科细菌qnrA基因携带率较低,但存在aac(6’)-Ib-cr基因。     

云南撒坝猪致病性大肠杆菌OmpF基因缺失株与β-内酰胺类抗生素耐药性关系的研究

通过测定大肠杆菌OmpF基因缺失株与亲本株的生长曲线,以及运用药敏实验和MIC实验比较大肠杆菌基因OmpF缺失株与亲本株对β-内酰胺类中几种抗生素的耐药性,从而了解OmpF基因缺失对菌株生长的影响及与β-内酰胺类抗生素耐药关系。结果表明:在同样的正常培养条件下,基因缺失株F-M-2/OmpF~Δ相对于亲本株F-M-2生长较缓慢,稳定期OD_(600)值相对于亲本株较低。对于β-内酰胺类中几种抗生素,基因缺失株相对于亲本株耐药性明显增强。     

16S rRNA甲基化酶rmtB在猪肠道菌中的传播方式分析

为研究16S rRNA甲基化酶rmtB在猪肠道菌中的传播方式,用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分别对来源于A、B猪场的48株rmtB阳性大肠埃希氏菌进行基因分型;用膜接合试验研究rmtB基因的水平传播方式;用微量稀释法对rmtB阳性菌及其接合子进行药敏试验。有45株rmtB阳性大肠埃希氏菌(45/48)能进行PFGE分型,可分为28种不同的PFGE基因型。其中来源于A猪场的20株菌可分为12种基因型,来源于B猪场的25株菌可分为16种基因型;46株rmtB阳性菌可以通过接合试验将rmtB基因及其介导的耐药性传递给受体菌E.coliC600和E.coli488 Rifr,接合频率从4.6×10-13~3.0×10-6不等,接合子对卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、西梭米星、萘替米星、庆大霉素6种二脱氧链霉胺类抗生素均高度耐药(MIC≥512μg/mL)。结果表明,rmtB基因位于接合性质粒上,该基因在两猪场的大肠埃希氏菌中既存在克隆传播,又存在水平传播,以水平传播为主。     

获得性16S rRNA甲基化酶的研究进展

外源获得性16S rRNA甲基化酶基因广泛分布于革兰阴性细菌中，介导对多种氨基糖苷类药物的高水平耐药。该酶能将S-腺苷-L-甲硫氨酸的甲基添加到16S rRNA氨酰tRNA识别位点的特异性核苷酸上，从而干扰氨基糖苷类药物与靶位点的结合。16S rRNA甲基化酶基因通常由转座子等活动性遗传元件介导并嵌入到可转移的质粒或染色体中，从而导致耐药基因广泛而迅速地传播。更令人担忧的是，16S rRNA甲基化酶基因经常与bla_NDM-1、bla_CTX-M和qnrB1等其他耐药基因偶联，介导对β-内酰胺类药物和氟喹诺酮类药物的多重耐药。对于多重耐药16S rRNA甲基化酶阳性菌引发的感染，治疗方法非常有限。迄今为止，至少已有30个国家和地区对16S rRNA甲基化酶进行了相关报道，由此可见，16S rRNA甲基化酶基因的全球传播正成为一个全球重大公共卫生问题。     

40株动物源性大肠杆菌耐药性分析及氨基糖苷修饰酶耐药基因的检测

为调查动物源性致病性大肠杆菌氨基糖苷修饰酶耐药基因的携带情况,探讨耐药基因与氨基糖苷类抗生素表型的相关性,对40株源于畜禽的大肠杆菌常用氨基糖苷类抗生素进行药敏试验,用PCR法检测耐药基因aac(3)-Ⅱ、arm A、aac(6')-Ⅰb。结果表明:40株大肠杆菌在所用氨基糖苷类药物中对卡那霉素的耐药率最高,达57.5%(23/40),其次是链霉素与庆大霉素,耐药率分别为45.0%(18/40)和40.0%(16/40);耐药基因aac(3)-Ⅱ的检出率为17.5%(7/40),其中有6株的耐药表型都为对庆大霉素耐药,arm A的检出率为0,aac(6')-Ⅰb的检出率为2.5%(1/40)。     

临床16S rRNA甲基化酶的研究新进展

16SrRNA甲基化酶是近年来出现于临床的一种新耐药决定因子,介导细菌对多种氨基糖苷类高水平耐药,最初发现于肠杆菌科中,目前在革兰阴性菌中已发现至少由12种等位基因编码的10种16SrRNA甲基化酶。由于大多编码16SrRNA甲基化酶的基因常位于可动遗传因子如接合型质粒、整合子、转座子、插入序列共同区上,易引起耐药性和耐药基因的传播,导致临床抗感染治疗的失败。本文综述了临床16SrRNA甲基化酶的新发现,其介导的耐药性、作用机制、临床流行特点、传播特点及分子遗传背景、来源及进化,为临床合理应用氨基糖苷类抗生素、开发16SrRNA甲基化酶抑制剂奠定基础。     

临床16S rRNA甲基化酶的研究新进展

16SrRNA甲基化酶是近年来出现于临床的一种新耐药决定因子,介导细菌对多种氨基糖苷类高水平耐药,最初发现于肠杆菌科中,目前在革兰阴性菌中已发现至少由12种等位基因编码的10种16SrRNA甲基化酶。由于大多编码16SrRNA甲基化酶的基因常位于可动遗传因子如接合型质粒、整合子、转座子、插入序列共同区上,易引起耐药性和耐药基因的传播,导致临床抗感染治疗的失败。本文综述了临床16SrRNA甲基化酶的新发现,其介导的耐药性、作用机制、临床流行特点、传播特点及分子遗传背景、来源及进化,为临床合理应用氨基糖苷类抗生素、开发16SrRNA甲基化酶抑制剂奠定基础。     

猪源大肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性以及耐药基因的检测

为指导临床合理用药,根据耐药表型和基因型研究耐氨基糖苷类药物猪源大肠杆菌的流行情况,采用K—B法检测大肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性,同时用PCR技术扩增氨基糖苷类药物的耐药基因以明确其基因型。结果显示,60株临床分离菌中,耐氨基糖苷类抗生素菌株54株,耐药率为90％;aac（3）-Ⅰ基因PCR扩增均为阴性;aac（3）-Ⅱ基因检出阳性28例,阳性率为46．7％;aac（6’）-Ⅰ基因检出阳性54例,阳性率为90％。结果表明,耐氨基糖苷类药物的大肠杆菌比较普遍,氨基糖苷类耐药基因以aac（3）-Ⅱ和aac（6’）-Ⅰ为主。     

动物源性大肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性及其耐药基因的检测

旨在调查大肠杆菌3种氨基糖苷类耐药基因aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰb和arm A的携带情况,探究耐药基因与氨基糖苷类药物耐药表型的相关性。采用K-B纸片法探究70株大肠杆菌对6种氨基糖苷类药物的耐药性;采用PCR法检测全部菌株氨基糖苷类钝化酶基因aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰb及16S rRNA甲基化酶基因arm A。结果显示:70株大肠杆菌中对链霉素、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、新霉素的耐药率依次是62.9%、42.9%、37.1%、35.7%和21.4%,耐药率最低的是阿米卡星为15.7%。70株大肠杆菌中检测出携带1个或多个耐药基因的菌株占总菌株数的32.9%,钝化酶基因aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰb的检出率分别是18.6%和15.7%,介导高水平耐药的16S rRNA甲基化酶基因arm A的检出率为4.3%,有1株大肠杆菌同时携带3种耐药基因。研究表明江苏南京、扬州、镇江、泰州、盐城等地区的大肠杆菌具有很严重的耐药性,其相关的耐药基因检出率与其所具有的耐药性呈正相关,部分耐药严重的菌株未检测到这3种耐药基因,提示可能存在其他耐药机制。     

山东地区禽源致病性大肠杆菌氨基糖苷类药物耐药性及耐药基因的检测

采用K-B纸片法对224株大肠杆菌进行5种氨基糖苷类药物的药敏试验,采用微量肉汤稀释法进行庆大霉素和阿米卡星最低抑菌浓度（MIC）的测定,三重PCR法检测全部菌株氨基糖苷类钝化酶基因ant（3’’）-Ia、aac（6’）-Ib和aph（3’）-Ⅱa,普通PCR法检测16S甲基化酶基因。结果显示：山东省禽源大肠杆菌对链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素和阿米卡星的耐药率分别为84.4%、57.1%、55.8%、46.9%和40.2%;3种钝化酶基因ant（3’’）-Ia、aac（6’）和Ib、aph（3’）-Ⅱa的检出率依次为49.6%、25.0%和22.8%,介导高水平耐药的16S甲基化酶基因RmtB的检出率为11.6%（26/224）,只有1株大肠杆菌检测到armA基因,没有检测到rmtA,且3种甲基化酶基因在低度耐药菌中检出率均为0;所检大肠杆菌中携带2种及2种以上耐药基因的菌株占33.5%（75/224）,有1株大肠杆菌同时携带4种耐药基因。结果表明,氨基糖苷类钝化酶及16S甲基化酶广泛存在于禽源大肠杆菌菌中,其耐药性与相关耐药基因的检出率基本呈正相关,部分菌株的耐药性与耐药基因的检出率不一致,表明还存在其他耐药机制。     

肉鸡源致病性大肠埃希菌中β-内酰胺类抗生素耐药基因的检测

为了解大型肉鸡养殖场致病性大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)对β-内酰胺类抗生素中的头孢菌素类抗生素的耐药性变化,以及β-内酰胺酶耐药基因的携带情况及耐药基因与耐药性的相关性,从陕西省的部分规模化养鸡场的病、死鸡中分离鉴定并保存108株致病性E.coli。采用K-B药敏纸片法检测致病性E.coli分离株对7种β-内酰胺类药物的药敏性,PCR方法检测3种β-内酰胺酶耐药基因,用DNA Star软件对获得的耐药基因序列与GenBank中的相关序列进行比对。结果显示,鸡源致病性E.coli分离株对头孢派酮、头孢他啶、头孢噻肟、头孢唑啉、头孢曲松、头孢呋肟、头孢噻吩的耐药率分别为83.3%、18.5%、72.2%、92.6%、88.9%、90.1%和95.7%。三重以上耐药菌株占88.9%。β-内酰胺酶基因tem和ctx-m的检出率分别为98.1%和74.1%,未检测到shv基因。结果表明,快大型肉鸡致病性E.coli对β-内酰胺类抗生素的耐药性普遍存在,以多重耐药为主。耐药基因tem和ctx-m的检出率与其耐药性呈正相关。     

禽源沙门菌氨基糖苷类耐药表型及耐药基因研究

为调查禽源沙门菌临床分离株对耐药基因的携带情况,探讨氨基糖苷类药物的耐药表型与耐药基因的相关性。试验选用氨基糖苷类代表药物阿米卡星等7种抗菌药物采用K-B法对135株沙门菌进行药敏试验,应用PCR技术进行了7种代表性耐药性基因的检测。结果显示:135株分离株对链霉素、阿米卡星、新霉素、卡那霉素、庆大霉素、大观霉素、妥布霉素的耐药率分别为88.9%、83.0%、54.8%、74.8%、78.6%、66.7%、65.9%;共检测出6中耐药基因,add A1、aph(3′)-Ⅱa、aac C2、ant(3′′)-Ⅰa、arm A、rmt B,阳性率分别为57.8%、17.0%、45.2%、31.9%、16.3%、30.4%;所检沙门菌携带2种或2种以上的菌株占63.7%(86/135),有2株同时携带6种耐药基因;耐药性与耐药基因的检出率基本一致,但无绝对相关性。结果表明江苏地区沙门菌对氨基糖苷类药物耐药现象非常严重,且耐药基因广泛存在。     

鸭疫里默氏杆菌氨基糖苷类药物的耐药性分析

为了调查鸭疫里默氏杆菌3种氨基糖苷类耐药基因aac (3)-Ⅱ、aadA、aac (6′)-Ⅱ的携带情况,探讨耐药基因与氨基糖苷类药物表型的相关性,试验选用常用氨基糖苷类抗生素对20株来自扬州、苏州、滁州、泰兴、淮安、南京地区的鸭疫里默氏杆菌进行药敏试验,用PCR法检测耐药基因aac (3)-Ⅱ、aadA、aac(6′)-Ⅱ,结晶紫染色法检测生物被膜形成能力。结果表明:20株鸭疫里默氏杆菌对氨基糖苷类药物中的妥布霉素耐药率最高,其次是多黏菌素B、庆大霉素和诺氟沙星,最后是丁胺卡那和链霉素;耐药基因aac (3)-Ⅱ、aadA与aac(6′)-Ⅱ的检出率均为0;20株鸭疫里默氏杆菌均能形成生物被膜,但OD_(595)值均在0.31～1.00之间,为弱生物被膜。说明鸭疫里默氏杆菌对氨基糖苷类药物具有强耐药性,且应少用妥布霉素等氨基糖苷类药物。     

鱼源温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素的耐药性分析

为探究温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素的耐药性,试验采用PCR法检测10株来源不同的鱼源温和气单胞菌对氨基糖苷类抗生素的4种耐药基因(aph(3′)-Ⅱa、ant(3″)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb、aac(3)-Ⅱa)及四环素类抗生素的3种耐药基因(tetA、tetC、tetM)的表达情况,并利用K-B纸片扩散法对6种抗生素进行耐药表型分析。结果显示,10株温和气单胞菌对氨基糖苷类耐药基因aph(3′)-Ⅱa、ant(3″)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb的检出率分别为20%、30%、20%,未检测出aac(3)-Ⅱa基因;对四环素类的耐药基因tetA、tetC、tetM的检出率分别为70%、20%、60%。K-B纸片扩散法结果显示,10株菌对四环素耐药率最高,对链霉素敏感,对庆大霉素、卡那霉素、多西环素、米诺环素高度敏感。结果表明,本次分离的温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素具有一定的耐药性,为深入了解温和气单胞菌的耐药机制提供参考。