融合域点突变的埃博拉病毒GP蛋白重组新城疫病毒的构建与免疫评价

扎伊尔型埃博拉病毒(EBOV)的感染会引起人类以严重出血和发热为主要症状的传染病,死亡率高达90％,对公共卫生构成严重威胁.EBOV囊膜蛋白(GP)是病毒主要的免疫原性蛋白.本团队前期的研究表明,以新城疫病毒(NDV)为载体构建表达EBOV GP蛋白的重组病毒rLa-EBOVGP改变了NDV的侵入方式.为了研制出安全性...     

埃博拉和马尔堡病毒囊膜糖蛋白嵌合型重组水泡性口炎病毒的构建及鉴定

埃博拉病毒(EBOV)和马尔堡病毒(MARV)属于丝状病毒科,能够导致人和动物发生致命的埃博拉出血热和马尔堡出血热,这两种病是重要的尚未传入我国的烈性人兽共患病。为研制安全有效的储备疫苗,本研究利用水泡性口炎病毒(VSV)反向遗传操作技术,将VSV自身糖蛋白(GP)分别替换为EBOV或MARV的GP,构建了表达扎伊尔型EBOV、苏丹型EBOV及MARV GP的嵌合VSV重组病毒r VSV△G/ZEBOVGP、r VSV△G/SEBOVGP及r VSV△G/MARVGP。Western blot和间接免疫荧光试验表明这3种GP蛋白在重组病毒感染的细胞中均能够正确表达。电镜观察结果显示,3种重组病毒均与亲本病毒具有相同形态特征,表明这3种外源GP蛋白均能够嵌合在重组病毒粒子表面。本研究构建的这3种重组病毒为进一步的动物免疫试验并评价其免疫效果奠定了基础。     

反转录病毒介导的稳定表达HIV-1Gag蛋白和增强型绿色荧光蛋白细胞系的建立

本研究旨在建立中国流行株人免疫缺陷病毒(HIV-1)衣壳蛋白(Gag)哺乳动物稳定表达细胞系。将HIV-1核心蛋白基因gag和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP依次串联插入反转录病毒载体pFB-neo,构建重组反转录病毒载体pFB-gag-EGFP,并与含有辅助病毒gag-pol和env基因的质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK293T细胞,包装出的反转录病毒感染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白EGFP表达,验证HIV-1核心蛋白Gag表达,G418抗性筛选阳性细胞。结果表明,HIV-1核心蛋白Gag和增强型绿色荧光蛋白可在SP2/0细胞中稳定表达,HIV-1核心蛋白gag基因稳定表达细胞系成功建立,为抗AIDS治疗用基因工程制剂及靶向药物的活性检测提供了理想方法。     

绿色荧光示踪马传染性贫血病毒样颗粒在活细胞中的组装过程

马传染性贫血病毒(EIAV)gag基因编码的多聚Gag蛋白能够自动组装形成病毒样颗粒(VLPs)。为研究EIAV衣壳蛋白合成、组装及释放过程,本实验通过构建表达EIAV Gag-GFP融合蛋白重组质粒,并将其转染293T细胞,采用western blot检测不同时间点VLPs的产生及释放。并进一步通过活细胞和3D成像技术观察Gag-GFP在细胞中的表达动态及VLPs的组装过程。结果表明:Gag和GFP蛋白融合表达不影响VLPs的组装,转染约6 h后EIAV Gag蛋白进行合成并在细胞胞质聚集完成组装形成VLPs。该实验结果为进一步研究EIAV在细胞中的组装路线和机制奠定了重要基础。     

表达扎伊尔型埃博拉病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒的构建

埃博拉病毒(EBOV)能够引起一种人畜共患急性出血性传染病,即埃博拉出血热.研制安全、有效的抗病毒疫苗具有重要意义.本研究利用水泡性口炎病毒(VSV)印第安纳株反向遗传操作系统,构建并拯救得到表达扎伊尔型埃博拉病毒(ZEBOV)囊膜糖蛋白GP的重组VSV (rVSV-ZEBOV-GP),通过westemblot和免疫荧光试验证明在重组病毒中ZEBOV GP蛋白获得正确表达;动物试验显示重组病毒对小鼠高度安全;中和试验结果表明重组病毒能诱导小鼠产生针对ZEBOV囊膜糖蛋白GP嵌合VSV假病毒粒的特异性中和抗体.本研究表明rVSV-ZEBOV-GP作为防控ZEBOV的储备性疫苗具有潜在的应用价值.     

整合H1亚型流感病毒血凝素蛋白伪型病毒的构建

为构建包装含有H1亚型流感病毒HA蛋白的伪型病毒,本研究将人工合成的H1N1流感病毒(A/Califorma/04/2009株)血凝素(Hemagglutinin,HA)基因连接至真核表达载体pcDNA3.1,该重组质粒与表达逆转录病毒相关元件的骨架质粒pHIT111及pHIT60共转染人胚胎肾细胞293T,构建了以鼠白血病病毒为核心、包装含有HA蛋白的伪型病毒.通过对伪病毒感染细胞中LacZ报告基因表达产物的检测,证明伪病毒可以感染MDCK细胞;同时其感染过程可被流感病毒免疫后的小鼠阳性血清所阻断,表明该伪型病毒可模拟野生型病毒完成对宿主细胞的感染过程.本研究所构建的伪病毒系统为研究H1亚型流感病毒HA蛋白抗原特性及新型中和抗体检测方法的建立提供了理想的工具.     

稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163的HEK293细胞系的建立

为构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)受体CD163的HEK293细胞系,本研究采用RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞(PAM)总RNA中扩增CD163基因并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒pc DNA-CD163。将该重组质粒转染HEK293细胞,并利用G418筛选、纯化,获得了稳定表达CD163受体蛋白的HEK293CD163细胞系。RT-PCR、流式细胞术及western blot检测结果表明,该细胞系在传代至15代后,CD163在HEK293细胞中仍然能够稳定表达。在该细胞系中接种PRRSV后进行间接免疫荧光及噬斑试验检测表明,病毒能够通过CD163感染HEK293CD163细胞并在其中增殖。该细胞系的建立为进一步研究PRRSV的侵入细胞和致病机制提供了病毒在体外增殖的易感细胞系。     

用GFP基因标记梅花鹿生茸骨膜细胞

为了用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记梅花鹿生茸区骨膜(antlerogenic periosteum,AP)细胞,试验首先构建了含GFP基因的重组质粒pLNHX-GFP,将重组质粒与包装质粒VSV共转染包装细胞GP 2-293,获得复制缺陷型逆转录病毒上清液,感染培养的梅花鹿生茸区骨膜细胞,检测GFP在骨膜细胞中的表达情况,用G418对感染后的细胞进行筛选。结果表明:试验获得了能稳定地表达GFP的生茸骨膜细胞。     

利用假病毒技术筛选H5N1亚型禽流感病毒中和活性单克隆抗体

为筛选H5N1禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)特异性中和抗体,本研究构建了表达HA蛋白的重组质粒,利用该重组质粒及缺失表达人免疫缺陷病病毒1型(HIV-1)囊膜蛋白基因的骨架质粒,构建了表面整合有H5亚型AIV HA蛋白的HIV假病毒。利用该假病毒系统,筛选得到一株具有中和活性的单克隆抗体(MAb)。经测定,该MAb与纯化的全病毒具有较好的反应性,其对HIV-H5HA假病毒的中和效价为64。中和试验表明该MAb能够有效阻断野生型病毒对鸡胚的感染。本研究结果为开发H5N1 AIV的被动免疫治疗方法奠定了基础,同时对亚单位疫苗的研制也具有一定的意义。     

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的BHK细胞系的构建

猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M基因重组腺病毒的构建及表达

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒活载体疫苗,本研究将PRRSV GP5和M基因串联表达盒定向克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA多克隆位点处,获得重组穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-GP5-M,与骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染293AD细胞,包装出含有GP5和M基因的重组腺病毒rAd5-GP5-M。应用PCR技术、间接免疫荧光、Western blot分析,结果表明,GP5和M基因已经被成功整合到了腺病毒基因组上,且GP5和M蛋白在293AD细胞上均得到了表达;滴度测定表明,该重组腺病毒rAd5v-GP5-M的TCID50为10-6.5/mL;连续传代试验表明该重组腺病毒可在细胞内稳定繁殖,有效地转录并表达GP5和M蛋白,具有较高的遗传稳定性。该研究为PRRSV重组腺病毒疫苗的研制打下了基础。     

表达西尼罗病毒E蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

为构建表达西尼罗病毒(WNV)E蛋白的重组腺病毒,本实验将WNV的E基因克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,经Pme Ⅰ酶切线性化后电转化于含有人5型缺陷腺病毒的骨架的BJ5183感受态大肠杆菌中进行同源重组,构建重组质粒pAd-WNV-E;将其经Pac Ⅰ酶切线性化后通过脂质体介导转染于人胚肾细胞Ad-293细胞,制备重组腺病毒rAd-WNV-E;经western blot以及间接免疫荧光鉴定表明WNVE蛋白在Ad-293细胞中获得有效表达.病毒滴度测定试验结果显示,该重组腺病毒与野毒型腺病毒复制能力相近.该重组腺病毒的构建为进一步研制表达WNVE蛋白的重组腺病毒的疫苗奠定了基础.     

表达绿色荧光蛋白的复制缺陷型西尼罗病毒的构建

为构建表达绿色荧光蛋白(GFP)的复制缺陷型西尼罗病毒(WNV),本研究参考NY99株WNV基因组序列,分段合成除结构蛋白基因外的其它基因组序列,以及插入缺失的结构蛋白基因位置的gfp报告基因序列,并按WNV基因组顺序克隆于pCI-neo载体中,构建含有GFP基因的WNV复制子重组质粒pWNVrep-GFP;同时构建表达WNVC蛋白的重组质粒pCAG-WNV-C。将pWNVrep-GFP和pCAG-WNV-C共转染稳定表达WNVprM-E蛋白的W-92细胞系进行WNV粒子包装及病毒粒子拯救。结果显示转染细胞能够表达GFP,将转染细胞培养液接种BHK-21细胞后,能感染细胞并且表达GFP,westernblot可以检测到分子质量为42ku的NS1蛋白条带。然而,感染BHK-21细胞的培养液不能再感染BHK-21细胞,表明拯救的病毒只具有一次感染能力,为复制缺陷型病毒。WNV阳性血清能中和拯救病毒对BHK-21细胞的感染,该复制缺陷型病毒为WNV中和抗体检测和疫苗评价提供了相关的技术平台。     

重组山羊痘病毒通用转移载体的构建

为了便于山羊痘病毒(goat pox virus,GPV)活载体疫苗的研究,本试验拟构建能够用于GPV重组的通用转移载体。用DNA合成和PCR方法构建含有启动子p7.5和p11的质粒pTKpp,以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)为报告基因,构建含有p7.5/p11-GFP表达盒的重组质粒pTKpp-GFP和通用转移质粒pTKpgigp,转染已感染GPV的羔羊睾丸(lamb testis,LT)细胞,观察GFP的表达情况;同时在pTKpgigp中插入外源基因FMDVVP1,构建重组转移质粒pTKpgigp-VP1,与GPV共转染LT细胞,产生并筛选重组GPV,验证外源基因的表达情况。结果显示,重组质粒中的启动子p7.5和p11能够启动GFP的表达;以重组转移质粒pTKpgigp-VP1进行的GPV重组成功获得了rGPV。最终证明通用转移载体pTKpgigp构建成功,能够用于重组GPV的相关研究。     

重组猪瘟病毒E2基因逆转录病毒载体的构建及其表达活性

从实验感染兔脾组织中提取总RNA，应用RT—PCR得到了CSFVC-株结构蛋白E2基因，定向克隆于逆转录病毒载体pBABEpuro，经PCR、酶切和序列分析鉴定，获取阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载pVSV—G共转染GP2—293细胞，收获假型病毒，并在Polybrene的介导下感染PK15细胞，嘌呤霉素筛选表达猪瘟E2基因的细胞株。通过细胞传代并结合PCR、免疫荧光及ELISA检测表明，所筛的细胞细胞系能稳定表达猪瘟E2基因，而且表达产物具有良好的生物学活性。     

表达鸭坦布苏病毒衣壳蛋白的重组腺病毒载体构建与鉴定

为构建鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体的重组腺病毒,研究通过一步克隆技术将DTMUV Capsid基因插入到含有结核分枝杆菌的热休克蛋白70(mHsp70)为佐剂的pShuttle-CMV-Hsp70质粒中,构建能够表达DTMUV Capsid和mHsp70蛋白的重组穿梭质粒pShuttle-DTMUV Capsid,并与含有pAdEasy-1腺病毒骨架载体的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-DTMUV Capsid。载体质粒经Pac I酶切线性化后转染至HEK 293A细胞,包装重组腺病毒rAdv-DTMUV Capsid。结果显示,rAdv-DTMUV Capsid在病毒传代过程中目的基因稳定存在,且病毒滴度可达2.3×10⁸ PFU/mL。Western blot等结果表明rAdv-DTMUV Capsid在HEK 293A细胞中表达了DTMUV特异性蛋白Capsid。DEF细胞感染试验证明rAdv-DTMUV Capsid可感染鸭源细胞,且诱...     

可诱导表达小反刍兽疫病毒P蛋白细胞系的建立

为研究小反刍兽疫病毒(PPRV)磷蛋白(P)的生化功能,本研究通过PCR将PPRV p全长基因扩增后克隆至真核表达载体pcDNA4/TO中,构建了重组质粒pcDNA4/TO-PPRVP。将该质粒转染至已稳定转入pcDNA6/TR质粒的T-REx293细胞中,并用博来霉素和稻瘟菌素筛选存活克隆。将强力霉素添加至存活细胞克隆中诱导P蛋白表达,Western blot及间接免疫荧光试验鉴定出可诱导表达P蛋白的细胞克隆,扩增阳性克隆获得能够稳定表达P蛋白的细胞系。Western blot显示该细胞系表达的P蛋白能够与山羊PPRV阳性血清反应,并能够有效抑制聚肌胞苷酸诱导的STAT1磷酸化,表明该细胞系表达的重组PPRV P蛋白具有与野生型P蛋白类似的生物活性。本研究利用Tet on系统建立了表达PPRV P蛋白的真核细胞系,为深入研究PPRV的致病机制奠定了基础。     

RCAS(J)-Luciferase重组病毒拯救及其相关生物学功能鉴定

RCAS载体系列是基于A型罗斯肉瘤病毒(RSV-A)所改造而成的反转录病毒感染性克隆,转染易感细胞后,能够产生高滴度的RSV-A病毒。同时,RCAS载体可携带外源基因进入靶细胞,从而进行蛋白的高效表达。为了获取滴度高且易于检测的RSV,进行ALV-J受体方面的研究,本研究将RCAS(A)-GFP载体中RSV-A的囊膜蛋白基因替换为ALV-J的囊膜蛋白基因,并将绿色荧光蛋白报告基因(gfp)替换为海参荧光素酶(luciferase)报告基因,构建带有luciferase报告基因的囊膜蛋白为ALV-J囊膜蛋白的RSV重组病毒。经验证,本研究所构建的重组病毒,与传统的ALV-J株相比,具有复制能力强,病毒滴度高等优点,而且能够通过ALV-J特异性受体ch NHE1感染ALV-J非允许细胞系,有利于病毒感染初期的检测和定量,为病毒与其受体之间相互作用的研究奠定了基础。     

稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系的建立

为建立稳定表达施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳(N)蛋白的BHK-21细胞系,本研究在SBV-N蛋白编码基因的C端加入6个组氨酸(6×His)标签,将其克隆至慢病毒载体p LV-EGFP-C中构建重组慢病毒质粒p LV-EGFP-SBV-N,将其与慢病毒包装质粒p Helper1.0和p Helper2.0共转染HEK-293T细胞,包装表达SBV-N蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染BHK-21细胞,采用嘌呤霉素(Puromycin)法和细胞有限稀释法筛选出一株稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系,命名为BHK-21-EGFP-SBV-N。间接免疫荧光试验进一步表明,该细胞系能够被SBV抗体阳性动物血清和特异性单克隆抗体2C8识别。稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系的建立,为SBV血清学检测方法的建立提供材料。     

稳定表达山羊SLAM受体的BHK-21细胞系的建立及应用

信号淋巴激活分子(SLAM)又称为CD150,是小反刍兽疫病毒(PPRV)和犬瘟热病毒(CDV)等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥重要作用。为建立稳定表达山羊SLAM(g SLAM)的真核细胞系,本研究将人工合成的g SLAM基因克隆至真核表达质粒p IRESpuro3中,并在该基因的3'端引入Flag标签序列作为分子标记,构建了重组质粒p IRES3-g SLAM。将该重组质粒转染BHK-21细胞,经嘌呤霉素加压筛选及采用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组PPRV病毒(r PPRV/GFP)感染鉴定后,筛选到稳定表达g SLAM基因的细胞系。r PPRV/GFP感染和western blot鉴定表明,无论是否有嘌呤霉素压力的存在,该细胞系在传代至第20代,仍能稳定表达g SLAM蛋白。由于g SLAM氨基酸序列与犬的同源性较高,以表达GFP重组CDV强毒株(r CDV/GFP)感染该细胞系,病毒可以感染且能形成明显的细胞病变,表明该细胞系可用于CDV强毒分离和致弱机制等相关研究。