猪δ冠状病毒M基因RT-PCR检测方法的建立及应用

猪δ冠状病毒(PDCo V)是2014年在美国最新检测出的一种猪源冠状病毒。为评估PDCo V在我国的感染和流行情况,根据Gen Bank中登陆的PDCo V M基因核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,建立了一种基于M基因的猪δ冠状病毒RT-PCR检测方法。研究结果表明,该方法特异性较好,仅对PDCo V有特异性的扩增,对其它主要猪病病毒核酸扩增均呈阴性;敏感性较高,最低检测限可达6.33×104拷贝/μL。运用该方法对我国华东地区猪场2014~2015年间的492份临床样品进行检测结果显示,PDCo V总阳性率为2.85%(14/492),其中腹泻样品中阳性率为18.60%(8/43),表明本研究建立的RT-PCR方法可以对临床样品进行有效检测。     

猪嵴病毒和猪星状病毒双重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪嵴病毒(PKV)和猪星状病毒(Ast V)的检测方法,本研究根据PKV 3D基因和Ast V ORF2基因设计了两对特异性引物,通过优化反应条件,首次建立了PKV和Ast V双重RT-PCR检测方法。该方法可以同时扩增出PKV的358 bp和Ast V的938 bp特异性片段,而对猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒及大肠杆菌等病原核酸扩增结果均为阴性,具有较强的特异性;对PKV和Ast V的最低检出量分别为1.51×106拷贝/μL和1.19×106拷贝/μL;利用该方法和单项RT-PCR方法对35份来自四川省部分猪场的仔猪腹泻病料样品进行检测。结果显示,PKV和Ast V的阳性检出率分别为80%和31.4%,两者符合率为100%。本研究建立的方法对PKV和Ast V的鉴别诊断和混合感染检测具有重要的应用价值。     

猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR方法的建立

本研究根据GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物,通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验,建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测技术。利用建立的CSFV-PEDV双重RT-PCR核酸检测技术,对某规模化猪场病料进行检测,结果表明,扩增出大小约311 bp和501 bp大小的特异性条带,为猪瘟与猪流行性腹泻病毒混合感染。建立的CSFVPEDV双重RT-PCR核酸检测技术具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,该方法的建立为CSFV和PEDV的快速诊断、疫情监测及流行病学研究奠定了基础。     

猪嵴病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中猪嵴病毒(porcine kobuvirus) 3D-RNA聚合酶基因序列设计并合成了1对特异性引物,建立了一种猪嵴病毒RT-PCR检测方法.反应产物测序结果与GenBank中猪嵴病毒SH-W-CHN/2010/China株比较,基因序列同源性为93％.利用该方法对猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、链球菌、猪巴氏杆菌和大肠杆菌等病原核酸进行扩增,均无条带出现,表明该方法具有较高的特异性;敏感性试验表明,该方法最低能检测到的病毒核酸含量为1 pg.利用所建立的RT-PCR方法检测采集自我国四川地区123份临床样品,结果阳性率为59.3％,表明猪嵴病毒在四川地区猪群中流行率较高.     

猪博卡病毒1型/2型PCR检测方法的建立

猪博卡病毒(PBo V)是2009年新发现的一种DNA病毒,常于腹泻仔猪体内检测到该病毒。为建立该病毒的检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的PBo V 1/2型的高度同源保守序列设计一对特异性引物,经PCR扩增条件优化,建立了PBo V 1/2型的PCR检测方法。特异性试验结果显示,该PCR方法仅从PBo V 1或2型的阳性病料样品中特异性的扩增出751 bp的目的片段,而对猪伪狂犬病毒、圆环病毒、大肠杆菌、沙门氏菌的核酸样品的扩增结果均为阴性。敏感性试验显示,该PCR方法对PBo V 1/2重组质粒标准品的最低检测量为34.8拷贝/μL。对来自河南中牟、开封、兰考、濮阳、洛阳等地猪场发生腹泻疫情的70份猪病料样品,采用该方法进行检测,其中10份样品呈PBo V 1/2型阳性,阳性率为14.29%。该PCR检测方法的建立为PBo V1/2型的诊断和监测提供技术支持。     

猪德尔塔冠状病毒纳米PCR检测方法的建立

根据Gen Bank登录的猪德尔塔冠状病毒(PDCo V)毒株M基因设计特异性引物,建立了PDCo V纳米PCR检测方法并进行了临床样品检测。结果显示:该方法对标准品检测的最低浓度可达102 copies/μL,与其他几种常见猪病病毒无交叉反应;用该方法检测国内猪场62份腹泻粪便样品,相比常规PCR方法,该纳米PCR方法的检出率更高,而两种方法对268份进境活猪粪拭子样品检测均为阴性。结果表明,本研究所建立的纳米PCR检测方法适用于国内猪场的PDCo V检测和进境活猪的监控检测,可作为PDCo V实验室检测的有力技术手段。     

猪环曲病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中猪环曲病毒N基因设计合成2对特异性扩增引物,成功建立了猪环曲病毒的套式RT-PCR快速检测方法。为验证本方法的特异性,以猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、A群猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪嵴病毒、沙门菌及大肠杆菌作为阴性对照,结果显示只有在猪环曲病毒的核酸作为模板时才能扩增出预期的258bp和198bp 2条片段。敏感性试验显示,该方法能检测到的最低核酸含量为1pg。结果表明,建立的RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,可用于猪环曲病毒的临床检测和流行病学调查。利用本方法对采集自四川省部分地区的50份临床样品进行检测,猪环曲病毒阳性率为30%。     

猪博卡病毒PCR检测方法的建立及其初步流行病学调查

猪博卡病毒(PBoV)是一种新出现的病毒,可以导致仔猪急性腹泻。为建立该病毒的检测方法,本实验根据PBoV的NS1基因序列设计一对引物,建立了PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法能够从PBoV阳性样品中特异性的扩增出482 bp的片段,而对猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、沙门氏菌、大肠杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌的核酸样品均无非特异性扩增反应。敏感性试验显示,该PCR方法对PBoV的最低检测量为213.6拷贝。此外,应用该方法对湖北、湖南、河南省的各大猪场进行了流行病学调查,在79个规模化猪场采集的248份病料样品中有172份样品为PBoV阳性。其中,对4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样调查,结果显示PBoV在腹泻猪群中的阳性率达到73.95%,并显著高于非腹泻猪群(47.83%)。本研究调查结果显示PBoV在国内猪群中流行广泛而且感染率高。     

2018年江西及福建省新现猪急性腹泻冠状病毒的分子流行病学调查

猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus,SADS-CoV)是2017年在我国广东首次发现的一种可导致新生仔猪急性水样腹泻及死亡的新型冠状病毒。为调查2018年江西及福建猪群中该病毒的感染情况,试验建立了一种SADS-CoV套式RT-PCR检测方法,并调查2018年江西及福建腹泻猪只样本中SADS-CoV的流行情况。根据GenBank数据库中SADS-CoV GDS04毒株(登录号MF167434)的核衣壳蛋白(N)基因核酸序列,设计了两对特异性套式引物。以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒等病毒的基因组为模板检测引物的特异性。通过优化反应条件建立了检测SADS-CoV的套式PCR方法,用建立的套式PCR方法对2018年从江西和福建两省8个猪场采集的492份腹泻样品进行检测。应用设计的两对套式引物扩增出了650 bp和291 bp两个特异性片段。试验建立的套式PCR检测方法特异性好,只能扩增SADS-CoV,其最低检测限度为102拷贝/μL。利用所建立的方法对来自江西和福建省的492份腹泻猪临床样品进行检测,从福建猪群样品中检出了2份SADS-CoV感染,未从江西临床样品中检出SADS-CoV。试验将为SADS-CoV的临床检测提供一种套式PCR检测方法,结果表明该病毒在福建猪群而未在江西腹泻猪群中流行,将对SADS-CoV的临床诊断等具有应用价值。     

猪流行性腹泻病毒野毒株及弱毒疫苗株RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV野毒株及弱毒疫苗株的ORF3基因序列,在缺失区的两端设计合成1对特异性扩增引物,用以特异性的扩增PEDV ORF3基因片段,根据目的片段大小判断PEDV的毒株类型;通过退火温度等反应条件优化,建立了区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR鉴别检测方法。结果显示:所建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株;PEDV野毒株扩增出234 bp目的片段,PEDV弱毒疫苗株扩增出185 bp目的片段;与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、A群猪轮状病毒(PRo VA)、猪嵴病毒(PKV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪细小病毒(PPV)均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到病毒滴度为1.3×10~3TCID_(50)/mL。利用该方法对采集自广西部分地区93份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV野毒株阳性率为61.29%(57/93),弱毒株阳性率为5.38%(5/93)。结果表明:该RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便,能快速、准确地区分PEDV自然感染野毒株和弱毒疫苗毒株,为猪流行性腹泻的快速诊断及病原分子鉴别检测研究提供了可供借鉴的技术手段。     

新发猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

猪Delta冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)是一种新发现的仔猪腹泻类冠状病毒,感染仔猪主要表现出水样腹泻、呕吐和脱水等临床症状,和猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)临床症状极其类似,且临床上混合感染病例较多,单靠临床症状和剖检变化很难辨别这2种疾病,因此建立同时检测且能区分PDCoV和PEDV的检测方法具有重要意义。参照GenBank登录的PDCoV M基因和PEDV ORF3基因特异性序列设计引物,扩增相应的基因片段,克隆构建重组质粒pMD-18T-PDCoV-M与pMD-18T-PEDV-ORF3,测序验证后,分别以此重组质粒为标准品,建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR方法,并对其扩增体系和扩增条件等进行了优化,同时对所建立的双重荧光RT-PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行了检测。结果显示,该试验成功建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR方法,最低能检测到PDCoV和PEDV分别是28.6拷贝/μL和99.6拷贝/μL的质粒浓度,显示出较好的敏感性;在同样扩增条件下该方法具有较好的重复性;特异性试验表明,该方法仅能检测出PEDV和PDCoV,而对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)等均不产生特异性扩增曲线。将所建立的双重荧光RT-PCR方法以及单重荧光定量RT-PCR方法分别对198份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV和PDCoV检测,结果显示,PDCoV阳性样品41份,阳性率为20.7%;PEDV阳性样品59份,阳性率为29.8%;同时感染这2种病毒的样品17份,阳性率为8.6%。与单重荧光定量RT-PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一样,符合率100.0%。本研究成功建立了PDCoV和PEDV的双重荧光RT-PCR方法,能同时准确地检测PDCoV和PEDV,这为PDCoV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定基础。     

猪腺病毒血清3型PCR检测方法的建立及其初步流行病学调查

为建立一种猪腺病毒3型(PADV-3)的检测方法,本研究根据PADV-3 E1B基因保守序列设计一对引物,建立了PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法仅对PADV-3扩增出247 bp的目的片段,而对猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪博卡病毒、猪传染性胃肠炎、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、大肠杆菌、猪链球菌均无特异性扩增;敏感性试验结果显示,该方法对PADV-3最低检测量为3.7×10~5拷贝/μL。应用该方法对我国四川省23个规模化猪场进行流行病学调查,结果显示PADV-3阳性率达到14.72%,在腹泻猪群中阳性率为17.34%,并且显著高于非腹泻猪群(6.41%),PADV-3在保育猪群中感染率最高(26.32%),表明PADV-3在我国四川省猪群中广泛流行。本研究建立的PCR检测方法特异性强、灵敏度高,可以应用于猪群中PADV-3的流行性调查。     

猪博卡病毒PCR检测方法的建立及初步应用

为建立能够检测猪博卡病毒(PBoV)所有基因型的检测方法,本研究根据PBoV每个基因群(G1、G2和G3)的保守区域设计特异性引物,建立了检测PB V的PCR方法。特异性试验结果显示除PBoV外,其它猪病病原核酸扩增均呈阴性,具有较强的特异性;对pMD-GD6、pMD-GD18和pMD-GD4的最低检测限分别为4.64×10~3拷贝/μL、5.29×10~3拷贝/μL和1.16×10~3拷贝/μL,敏感性较高;采用该方法对39头份猪的肝脏、肺脏、脾脏和小肠内容物进行检测,阳性率为74.4%(29/39)。其中G1群PBoV的检出率最高,G2群检出率最低;G1群和G3群在4种样品中均有检出,G2群只在小肠内容物中有检出;同时本研究首次在肝脏中检出该病毒。本研究结果表明,PBoV感染情况复杂,存在多基因型的混合感染。本研究为进一步对病毒进行基因分型和致病性研究提供检测依据。     

TGEV-PEDV二重RT-PCR检测方法的建立及应用

本试验旨在建立能同时检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的二重RT-PCR检测方法。首先根据Gen Bank收录的TGEV和PEDV的基因序列,设计扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的特异性引物,然后通过优化二重PCR的体系建立一个二重RT-PCR检测方法。用该方法对临床收集的10份粪便样品进行检测,初步表明本研究建立的二重PCR方法具有良好的特异性和灵敏度,能用于临床诊断及流行病学调查。     

猪流行性腹泻病毒与猪伪狂犬病病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）与猪伪狂犬病病毒（PRV）的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank已登录的PEDV膜蛋白M基因和PRV gE基因保守区域序列设计了2对特异性引物,以PRV和PEDV混合总RNA为反转录模板,初步建立了PRV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性验证和临床应用检测。结果显示,该方法对两种病毒的最低检测限均为10 TCID₅₀/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增PEDV和PRV细胞培养物,但对其他7种病原对照扩增不出任何条带,对26份临床疑似PEDV和PRV感染样品检测结果与测序鉴定结果完全一致。本研究成功建立了PEDV和PRV的二重RT-PCR检测方法,为临床上猪流行性腹泻和猪伪狂犬病的快速鉴别诊断提供了方法。     

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒一步法双重RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究旨在建立一种用于临床腹泻病例中猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）快速检测的一步法双重RT-PCR方法。根据GenBank中收录的PEDV和TGEV的基因序列,分别设计两对特性引物,经最佳反应条件的优化和选择,结果显示,该一步法双重RT-PCR检测方法能同时特异性扩增PEDV和TGEV,该方法可检测到稀释度1×10^-5的疫苗毒。应用本方法检测2015年度实验室收集的疑似样品,PEDV阳性率为100%。本研究建立的方法快速、敏感性高、特异性强,可用于临床PEDV和TGEV的快速检测及流行病学调查。     

猪博卡病毒1/2型NS1基因与3/4/5型VP1基因的双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测不同基因型猪博卡病毒(PBo V)的PCR方法,本研究参考Gen Bank中登录的5种基因型PBo V1、PBo V2、PBo V3、PBo V4及PBo V5,设计了2对引物,通过对扩增条件进行优化,建立了PBo V1/2和PBo V3/4/5的双重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法可以同时扩增PBo V样品327 bp(PBo V1/2)和209 bp(PBo V3/4/5)的特异性片段,而对猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒等其他病原核酸扩增均为阴性。敏感性试验显示,该PCR方法对PBo V1/2和PBo V3/4/5的最低检出量分别为100拷贝/μL和1 000拷贝/μL。重复性试验显示该双重PCR检测方法具有良好的可重复性。应用该方法和单项PCR对30份临床样品进行检测,结果显示,同时感染PBo V1/2和PBo V3/4/5的阳性率为10%,并且两种方法符合率为100%。本研究建立的方法适合对PBo V1/2和PBo V3/4/5的联合检测。     

猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及其应用

根据Gen Bank登录的猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)全基因组序列设计并合成了一对特异性引物,经条件优化,建立了检测PCV3的PCR方法,扩增片段大小为932 bp;最低的质粒检测浓度为10 copy/μL;对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒的核酸进行扩增,均无PCV3目的条带出现;随机抽取扩增的16份临床病猪样品目的条带进行TA克隆后测序,结果显示均为PCV3特异性目的片段,16株PCV3江苏毒株扩增序列与已报道的PCV3/US/SD2016和PCV3/CN/Hubei-618基因序列同源性分别为98.4%~99.6%、99.0%~99.8%,而16个毒株之间的同源性为98.3%~100%。利用所建立的PCR方法检测了2014~2017年间收集的江苏省临床病猪样品938份、健康猪样品500份,PCV3的阳性检出率分别为6.93%和0.6%;其中,2014年病猪样品中的阳性率为1.92%,后呈逐渐上升的趋势,2017年达到12.67%。本研究表明,建立的PCR方法特异、敏感,可以用于临床PCV3的检测;PCV3在江苏省猪群2014年已有感染,并呈逐年升高的趋势,应予以重视。     

猪环曲病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

为了解四川地区猪环曲病毒(PToV)的发病状况,针对PToV的保守区域S基因设计了一对特异性引物,建立检测PToV的RT-PCR方法,并对其敏感性、特异性和重复性进行了检测。结果显示,仅猪环曲病毒阳性模板可扩增得到约569bp大小的目的条带。敏感性试验显示,该方法能检测到的最低核酸含量为15pg。对采集于12个猪场27个腹泻样本和29个临床健康的样品进行了检测。结果显示,腹泻样本中检出率为33.3%(9/27),而在健康样本中检出率为6.9%(2/29)。以上结果表明本研究成功建立了一种敏感度高、特异性强、重复性良好的用于PToV的RT-PCR方法。     

江西省规模化猪场公猪精液中5种病毒RT-PCR/PCR检测与分析

为了了解公猪精液是否携带病毒,试验采用PCR/RT-PCR技术对采自江西省3个规模化猪场的111份公猪精液的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪丁型冠状病毒(PDCo V)进行了检测。结果表明:3个规模化猪场的公猪精液都有不同程度的带毒情况,A猪场和B猪场均检出了PRRSV、PRV和PCV-2三种病毒,C猪场检出了PRRSV和PCV-2两种病毒,所有猪场均未检出PEDV和PDCo V。在111份样品中,PCV-2的阳性率最高,为74.77%;其次是PRV,阳性率为15.32%;PRRSV的阳性率为9.91%;同时还发现存在PRRSV+PCV-2和PCV-2+PRV混合感染的情况,其混合感染率分别为9.01%和13.51%。说明公猪精液也能作为多种病毒,特别是影响猪只健康的重要病毒的传播媒介,从而给猪群的健康带来潜在威胁。