鹅细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

利用已经分离得到的小鹅瘟病毒GPVSP株,设计合成1对特异性的引物和TaqMan探针,通过特异性试验、敏感性试验建立了GPVTaqMan荧光定量PCR检测方法。同时饲养产蛋种鹅,接种小鹅瘟病毒,在不同的时间段采取病料,并且利用荧光定量PCR检测病毒的存在与含量,得到了小鹅瘟病毒在产蛋种鹅体内的定植规律。     

实时荧光定量PCR检测猪细小病毒

根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了引物和探针,从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中提取DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌JM109,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行PCR和测序鉴定,表明目的片段已经成功克隆.将104～108拷贝反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度为102拷贝.本方法的建立为猪细小病毒感染的早期诊断奠定了基础.     

鹅细小病毒、番鸭细小病毒及鸭圆环病毒多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与临床应用

为建立鉴别检测鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)及鸭圆环病毒(DuCV)的方法,本研究分别针对GPV、MDPV NS基因与Du CV Rep基因,设计特异性引物和Taq Man探针,经优化反应条件,建立了同一体系中同时鉴别检测GPV、MDPV及Du CV的Taq Man荧光定量PCR方法。利用该方法检测GPV、MDPV、Du CV及禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、减蛋综合征病毒、鸭坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒等主要水禽源病毒,结果显示,该方法仅能扩增出GPV、MDPV及Du CV,与其他主要水禽源病毒均无交叉反应,特异性强;利用该方法检测等体积混合后的GPV、MDPV及Du CV质粒标准品混合物,结果显示,该方法对3种质粒标准品的检测限均为7.5×10¹拷贝/μL,普通单一PCR对上述3种质粒标准品混合物的检测限均为7.5×10³拷贝/μL,表明本研究建立方法的敏感性高于普通PCR;该方法组内与组间重复性试验的变异系数均小于2.0%,重复性好。利用该方法与MDPV和GPV双重荧光定量PCR方法及Du CV荧光定量PCR方法同时检测...     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测猪细小病毒方法的建立及初步应用

根据GenBank登录的猪细小病毒株NADL-2(NC001718)的VP2基因序列设计1对特异性引物,经PCR扩增出431bp的目的片段。回收产物与pMD18-T vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为标准模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,R2=0.997 6,产物Tm为82.3～82.9℃,检测灵敏度为72.1拷贝/μL,特异性和重复性良好。本试验所建立的检测PPV VP2基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法,为该病毒的致病机制研究、临床早期诊断及定量分析PPV感染程度奠定了基础。     

鹅圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹅圆环病毒(GoCV)快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的GoCV全长基因组序列,在其保守基因区设计并合成1对引物,采用荧光嵌合法(SYBR GreenⅠ)建立检测GoCV的实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法。以本实验室构建的含有GoCV永康株(GoCV-yk01)全长基因组的重组质粒为标准模板,经退火温度、循环次数等反应条件的优化,绘制GoCV real-time PCR的标准曲线,并进行融解曲线分析。试验结果表明:建立的GoCV real-time PCR方法特异性强,检测范围广(Ct值范围12～32),最低检出病毒拷贝数为1.46×102。该方法能够对组织中病毒进行定量检测,为快速检测GoCV提供了有效的技术手段。     

犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立与评价

通过序列比对和Blast分析,选定犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)VP2蛋白保守区基因为检测的目的基因,引物采用Primer Premier 5.0软件设计。利用灵敏度较高的TaqMan探针法建立CPV核酸检测方法。通过对标准品的扩增、测序及对标准扩增曲线的绘制,建立CPV核酸检测方法。同时对建立的检测方法进行了检测特异性、灵敏度和重复性分析。将阳性对照标准品进行10倍梯度稀释后可检测到102拷贝/μL样品,表明该检测体系具有较高的检测灵敏度。通过分析表明,本检测方法在用空白对照及类似的猪细小病毒、猪圆环病毒作为扩增对照时,没有发现非特异性产物的产生,表明该体系对于CPV的检测是特异的。通过6次批间重复检测,体系的变异系数小于3%,表明该检测体系具有良好的重复性。     

鹅细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为探讨鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)在鹅胚上皮细胞(goose embryo epithelial cells, GEEC)中的增殖规律,研究采用荧光染料SYBR GreenⅠ渗入法,建立了检测GPV的荧光定量PCR方法,并用该方法分析了GPV在GEEC中的生长情况,绘制了生长曲线。结果显示,鹅细小病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法建立的标准曲线具有良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。在线性浓度范围内,随着模板量的减少,其对应的Ct值相应增大,得到的标准曲线方程为y=-3.341 2x+38.494,相关系数R²为0.998。特异性试验结果显示检测新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)、鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus, DHAV)、禽腺病毒(Avian adenovirus, FAdV)均为阴性。敏感性试验结果显示最低检测限为100拷贝/反应,而普通PCR的最低检测限为1 000拷贝/反应,熔解曲线为单一特征峰型,熔解温度为80℃±0.5℃。病毒生...     

犬细小病毒Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

根据GenBank中CPV VP2蛋白基因序列,选择CPV VP2基因保守序列,分别设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立了CPV Taq Man荧光定量PCR检测方法。对CPV Taq Man荧光定量PCR的反应体系和反应条件进行优化,并对其特异性和敏感性进行了测定,建立标准曲线。结果,CPV Taq Man荧光定量PCR对CPV检测阳性,并能对10拷贝/μL的CPV模板检测阳性,标准曲线的相关系数为0.9992,但对非CPV模板检测阴性。结果表明,所建立的CPV Taq Man荧光定量PCR具有很好的特异性和敏感性,标准曲线具有很强的实用性。同时对CPV Taq Man荧光定量PCR与CPV PCR进行了比较试验,结果前者比后者的敏感性高100倍。采用CPVHA、CPV PCR与CPV Taq Man荧光定量PCR对55份临床样品进行检测,CPV HA对30份样品检测阳性,CPVPCR对40份样品检测阳性,CPV Taq Man荧光定量PCR对47份样品检测阳性。这表明,CPV Taq Man荧光定量PCR对样品的检出率最高,具有特异、敏感、快速的特点,适用临床样品的检测。     

番鸭细小病毒荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测番鸭细小病毒(MDPV)的方法,本研究根据GenBank中MDPV的REP基因序列,设计一对特异性引物和一条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了检测MDPV的荧光定量PCR方法。检测结果表明,该方法检测敏感性达到20 copies,比常规PCR灵敏度高100倍;而且该方法对鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副粘病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等的检测均为阴性,具有良好的特异性;该方法的批内和批间的检测变异系数均小于2%。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,其MDPV阳性率为11.02%。结果提示广西地区的鸭群中MDPV的感染比较普遍,建立的荧光定量PCR方法可以用于MDPV的临床快速检测。     

猪细小病毒7型荧光定量PCR检测方法的建立与应用

猪细小病毒7型(PPV7)是近年来新发现的一种新型PPV。目前,缺乏更为高效的针对PPV7的检测方法,为了建立能够快速检测PPV7的方法,本研究根据PPV7 NS1基因的保守区序列,设计1对特异性引物及TaqMan探针。经过各反应条件的优化,初步建立了一种便捷、灵敏、能够快速准确检测PPV7的荧光定量PCR(qPCR)方法,并对其特异性、敏感性、稳定性以及与SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的符合率进行检测与对比。结果显示,该方法除对PPV7的基因组DNA有特异性扩增,对猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及PPV1核酸均无交叉反应,特异性较强。该方法对重组质粒标准品检测限为1.76拷贝/μL,而常规PCR方法检测限为1.76×10²拷贝/μL,表明本研究建立的方法敏感性较高。该方法对不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验变异系数均小于1.7%,重复性较好。利用本研究建立的qPCR方法和SYBR Green Ⅰ qPCR方法对采自福建地区的150份样品进行检测,结果显示,两种检...     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、快速及量化的猪瘟病毒(CSFV)检测方法,设计扩增CSFV E2基因的特异性引物,建立Eva Green染料的RT-qPCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性测试,并检测疑似猪瘟病毒感染的临床样品.结果显示,所建立的RT-qPCR检测方法标准曲线的线性相关系数R2=1.000,具有良好的线性关系...     

鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中鸭圆环病毒(DuCV)基因序列,在保守区设计了1对引物,建立了SYBER GreenⅠ荧光定量PCR检测鸭圆环病毒的方法。结果:该方法可检测到每个反应相当于1×102个拷贝的标准品DNA。与H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎病毒等不发生交叉反应,且具有良好的重复性。表明建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上DuCV感染的检测。     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ模式实时定量PCR检测方法的建立

根据GenBank猪细小病毒(PPV)的NS1基因序列,设计一对特异性引物,采用SYBR Green Ⅰ随机结合渗入法,建立实时定量PCR检测方法,构建了检测PPV的标准DNA模版,循环阈值(Ct)与标准质粒DNA模板在7.8×101～7.8×108拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997。该方法用于猪细小病毒的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于猪细小病毒的快速检测。     

鹅圆环病毒TB Green实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

鹅圆环病毒主要感染宿主的淋巴细胞,导致其免疫功能下降,造成继发感染和共感染。为建立鹅圆环病毒分子检测方法,本研究根据NCBI数据库中GoCV基因特征,设计特异性引物,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法。结果显示,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法,灵敏度高,最低检测限为54.10拷贝/μL;特异性好,与水禽常见传染病病原均无交叉反应,扩增产物的熔解曲线仅GoCV出现1个特异性单峰,Tm值为（84.46±0.09）℃;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.26%～0.55%和0.23%～0.87%。利用建立的TB Green实时荧光定量PCR方法和常规PCR方法同时对64份临床样品进行GoCV感染的检测,结果显示,常规PCR方法检出阳性样品15份,阳性率为23.44%;TB Green实时荧光定量PCR方法检出阳性样品18份,阳性率28.13%,且15份PCR阳性样品经TB Green实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究为后续开展GoCV感染的分子流行病学调查和致病机理研究提供技术支撑。     

一种塞内卡病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种塞内卡病毒实时荧光定量PCR方法,研究针对塞内卡病毒3C基因保守区域设计了一对引物和探针,将3C基因克隆到pCR-4 TOPO载体中,以重组质粒为标准品,通过优化PCR反应条件,建立了一种检测SVA的实时荧光定量PCR方法。结果表明,该检测方法的敏感性达到2.5×10 copies/μL,灵敏度高于普通PCR;与其他相关病毒及细菌均不发生交叉反应,批内和批间试验重复性的变异系数(CV)均小于4%,具有良好的稳定性。研究建立的一种塞内卡病毒实时荧光定量PCR方法可以检测SVA的定性和定量,对SVA快速诊断检测具有重要意义。     

犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

犬圆环病毒(DogCV)是圆环病毒科新发现的圆环病毒,旨在建立犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法。试验用PCR方法克隆犬圆环病毒ORF2基因保守区域,构建标准阳性质粒pClon007-ORF2。以标准阳性质粒pClon007-ORF2为模板对荧光定量PCR反应体系进行优化。结果表明,所建立的方法 Ct值与标准品在4.67×10~9 copies/μL~4.67×10~3 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.445。该方法检测灵敏度为4.67×10~1copies/μL。该方法对狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型等犬常见病原的检测均无交叉反应;所有稀释度标准品模板均在83.35℃出现窄的特异性熔解峰。临床样品检测表明,所建立的实时荧光定量PCR对犬圆环病毒的阳性检测率为12.50%(4/32)。     

犬圆环病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

建立了犬圆环病毒(canine circovirus, CanineCV)EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法。用PCR方法克隆CanineCV Rep基因中的高保守区,扩增的目的片段大小为217 bp,将其克隆至pMD18-T载体上,构建PCR检测阳性参考质粒,并用阳性参考质粒,进行各项反应条件优化。建立的标准曲线呈现出较高拟合性的线性回归,R²值为0.999 5;该方法检测灵敏度为3.88×10¹ copies/μL;在重复性试验中,组内和组间重复变异系数均小于2%,表明该方法具有良好的重复性;该方法对犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬流感病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型、犬冠状病毒等犬常见病原的检测均无交叉反应;临床样本检测表明,所建立的EvaGreen实时荧光定量PCR对CanineCV的阳性检出率为2.82%(5/177),高于普通PCR检测的CanineCV阳性率1.13%(2/177)。本研究成功建立了一种用于快速检测CanineCV的EvaGreen qPCR方法,该方法安全且具有较好的特异性、敏感性和重复性,可作为Canine...     

鸭甲肝病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

研究利用全基因合成技术合成DHAV-2全基因组序列,并以此为标准品建立检测DHAV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明:建立的方法敏感性高,最低检测限仅为33.7拷贝/μL;特异性强,对鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,N-DRV)、鸭源禽Ⅰ型副黏病毒(Duck-origin avian paramyxovirus type 1,APMV-1)和禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)均无交叉扩增;重复性佳,组内和组间变异系数最高分别为1.68%和2.19%。对2018年福建地区临床收集的128份鸭源病料进行检测,结果未检测DHAV-2感染阳性。研究结果为DHAV-2的快速检测试剂盒研究及储备DHAV-2检测技术奠定了基础。     

猪细小病毒7型Taqman实时荧光PCR检测方法的建立与应用

猪细小病毒7型(Porcine parvovirus 7,PPV-7)是近年新发现的一种细小病毒亚型。为建立PPV-7快速准确的检测方法,以PPV-7病毒全基因组为模板,设计合成1对引物和1条Taqman探针,建立了PPV-7Taqman实时荧光定量PCR检测方法。本方法的标准曲线分析显示,其常数为0.999 2,敏感性可以达到46个病毒拷贝/μL,批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。用猪圆环病毒2型、3型,猪细小病毒1型,猪伪狂犬病病毒等病原进行特异性试验,证实本方法不能从这些病毒中检测出特异性条带,表明本研究建立的PPV-7实时荧光PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点。用临床样品对该方法进行了应用性评价,从96份样品中检出52份PPV-7阳性样品,证实了本方法在生产实际应用的可行性。