鸭瘟病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸭瘟病毒（DPV）快速、敏感的检测方法,本研究利用PCR技术扩增出DPV UL30基因中510bp的保守序列,并克隆到p MD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了DPV的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达5×101拷贝,与鸭细小病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭H9亚型流感病毒和鸭副粘病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床DPV的检测。     

猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、灵敏且特异的检测猪圆环病毒3型(porcine circovirus, PCV)的实时荧光定量PCR方法,本研究根据ORF2基因的保守序列设计一对特异性引物和TaqMan探针,通过构建标准品质粒来制作荧光定量PCR标准曲线,优化反应条件,验证敏感性、特异性及重复性,建立了检测PCV3的实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法可以特异性检测出PCV3,而对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒等检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。用构建的标准品质粒测得的灵敏度可以达到10 copies/μL,重复试验批内及批间变异系数均小于2%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。以上结果表明,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏性高、特异性强的优点,可为我国PCV3型的早期检测及相关研究工作提供可靠的技术支持。     

鸭甲型肝炎病毒3型和鸭圆环病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立同时检测鸭甲型肝炎病毒3型（DHAV-3）和鸭圆环病毒（DuCV）的双重荧光定量PCR方法，试验根据NCBI中收录的DHAV-3 VP1和DuCV cap基因序列，分别设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针，建立了同时检测DHAV-3和DuCV的双重荧光定量PCR，对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估，并采用该方法对临床样品进行检测。结果显示：建立的方法不与其他常见鸭病原发生交叉反应，对DHAV-3和DuCV的检测灵敏度分别为3.8 copies/μL和7.3 copies/μL，批内和批间变异系数均小于2%，从65份临床样品中分别检出DHAV-3和DuCV阳性样品11份和28份，与现有地方标准符合率分别为95.4%和90.8%。研究表明，建立的双重荧光定量PCR特异性强、敏感性高、重复性好，可用于DHAV-3和DuCV的快速检测。     

实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测鸭坦布苏病毒方法的建立及初步应用

研究旨在建立一种适用于鸭坦布苏病毒检测的荧光定量Taq Man RT-PCR技术。以JXSP株RNA为模板,建立检测鸭坦布苏病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。制备含有上述目的片段的RNA作为标准品,10倍比稀释后建立标准曲线,测定敏感性。同时采用标准品对该方法的批内和批间重复性进行检测,并与本实验室所保存的多种病毒进行特异性检测。结果:建立的荧光定量Taq Man RT-PCR方法能在鸭坦布苏病毒JXSP株RNA样本中检出荧光信号。最低检出量为2.06×10~1拷贝/反应;线性范围达9个数量级。该方法重复性良好,批内变异系数不足0.4%;批间变异系数不足2.2%。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,经体外感染细胞培养物及临床样品检测证实,该方法可实时反映病毒液中的病毒含量,可在获得样品后3 h以内得到检测结果,可用于临床样品中鸭坦布苏病毒的快速检测。     

火鸡疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

本研究针对火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)FC-126毒株sorf1基因序列,设计特异性的扩增引物和探针,建立了检测HVT的TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行检测。结果表明,建立的荧光定量PCR方法灵敏度高,最低可检测到1×10~2 copies/μL,比普通PCR灵敏10倍;对鸭瘟病毒、传染性喉气管炎病毒、鹅细小病毒、4型禽腺病毒和8型禽腺病毒均无特异性扩增,具有较好的特异性;组间和组内变异系数均小于1%,表明该方法重复性好。用建立的荧光定量PCR方法对82份HVT样品进行检测,结果43份为阳性,普通PCR只检测出30份阳性样品。结果表明本研究建立的HVT TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,重要性好,为监测HVT的病毒含量提供了一种有效的手段。     

实时荧光定量PCR检测鸡传染性贫血病毒方法的建立

建立了Taqman实时荧光定量PCR方法检测鸡传染性贫血病毒(CAV)。选取CAV病毒的序列设计引物和探针。以梯度稀释的含有CAV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×105～2.0×102个拷贝,4个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为200个拷贝。根据病毒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒和马立克病毒核酸都没有扩增反应。采用实时荧光定量PCR方法检测试验感染鸡的肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊、泄殖腔棉拭子等样品,所有检测样品都有"S"型扩增曲线,且荧光信号值高。实时定量PCR检测CAV的方法,灵敏度高,特异性好,可以进行定量分析,在禽病的快速检测上具有重要意义。     

马疱疹病毒1型QuantStudio~(TM)3D数字PCR检测方法的建立

试验旨在建立一种高灵敏性的马疱疹病毒1(EHV-1) 3D数字PCR(3D-dPCR)检测方法,对EHV-1病毒含量较低的样品能准确定量检出,实现马鼻肺炎早期诊断及预防。根据EHV-1糖蛋白B基因保守区域设计特异性引物和探针,优化3D-dPCR反应体系中引物探针浓度和退火温度,对该方法进行灵敏性、特异性、重复性分析,建立了EHV-1的3D-dPCR方法。本研究建立的3D-dPCR方法,引物和探针最佳浓度分别为0.4和0.4μmol/L,最佳退火温度为60℃,该方法绝对定量曲线的R~2=0.998,线性关系良好,与实时荧光定量PCR方法相比灵敏度高10倍左右,最低检出限为5.83拷贝/μL;批内和批间重复性试验变异系数均3.2%;与EHV-4、马泰勒虫、马病毒性动脉炎的核酸无交叉反应;通过对123份临床样品进行3D-dPCR检测,结果显示,3D-dPCR方法阳性检出率为66.7%,高于世界动物卫生组织(OIE)中EHV-1的实时荧光定量PCR方法阳性检出率64.2%。3D-dPCR方法对病毒含量较高的样品与实时荧光定量PCR结果一致,对病毒含量较低的样品敏感性更高,能有效检出可疑样品。本试验结果表明,建立的3D-dPCR方法检测低拷贝数的临床样品时灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于EHV-1的准确定量检测。     

鹅星状病毒Ⅰ型荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究根据鹅Ⅰ型星状病毒(GAstV-1)的保守基因序列设计一对特异性引物和探针,建立并优化荧光定量PCR检测方法,并分别进行了特异性、敏感性、重复性进行了试验,且采用田间样品进行验证。结果显示,本研究建立的检测方法与新城疫病毒(NDV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、禽流感病毒AIV(H9N2)、鹅细小病毒(GPV)、鹅圆环病毒(Go CV)、水禽大肠杆菌(E. coli)、鸭疫里默氏杆菌(RA)均无交叉反应;对重组质粒标准品的检测限为1.0×10¹ copies/μL,组内和组间的变异系数均≤1.00%。13份田间临床样品检测结果显示,本研究建立的荧光定量PCR法阳性检出率为100%。由此可见,本研究建立的GAst V-1荧光定量PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,为鹅星状病毒的检测和监测提供了有效的技术手段方法。     

鹅圆环病毒TB Green实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

鹅圆环病毒主要感染宿主的淋巴细胞,导致其免疫功能下降,造成继发感染和共感染。为建立鹅圆环病毒分子检测方法,本研究根据NCBI数据库中GoCV基因特征,设计特异性引物,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法。结果显示,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法,灵敏度高,最低检测限为54.10拷贝/μL;特异性好,与水禽常见传染病病原均无交叉反应,扩增产物的熔解曲线仅GoCV出现1个特异性单峰,Tm值为（84.46±0.09）℃;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.26%～0.55%和0.23%～0.87%。利用建立的TB Green实时荧光定量PCR方法和常规PCR方法同时对64份临床样品进行GoCV感染的检测,结果显示,常规PCR方法检出阳性样品15份,阳性率为23.44%;TB Green实时荧光定量PCR方法检出阳性样品18份,阳性率28.13%,且15份PCR阳性样品经TB Green实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究为后续开展GoCV感染的分子流行病学调查和致病机理研究提供技术支撑。     

猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、量化、快速的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,设计1对PEDV N基因的特异性引物,建立Eva Green染料的实时荧光定量RT-PCR的检测方法,并对疑似PEDV感染的临床样品进行检测。结果显示,所建立的实时荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R2=0.999;不与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)发生交叉反应,具有较强的特异性;灵敏度比常规RT-PCR方法高100倍;重复性试验的变异系数均小于5%,重复性良好。对43份临床样品进行检测,结果比普通PCR多检出2份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法在特异性、灵敏度和重复性方面都很好,可用于临床PEDV检测。     

鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在建立鸭腺病毒A型（duck adenovirus A,DAdV-A）TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原（如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌）检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%（6/85）,PCR方法的阳性率为5.88%（5/85）,且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。     

狂犬病病毒微滴式数字PCR检测方法的建立

为了建立可绝对定量狂犬病病毒(RABV)的微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,本试验根据RABV基因组起始区域设计引物和探针,继而优化引物和探针浓度以及退火温度,并对建立的ddPCR方法的灵敏度、特异性和重复性进行分析。结果显示：ddPCR方法的最佳引物和探针浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为55℃;ddPCR方法的标准曲线相关系数(R²)为0.999,呈现良好的线性关系;灵敏度高,最低可检测到3.37 copies/μL;特异性良好,与常见犬病原无交叉反应;重复性好,检测结果稳定。临床样品的检测结果显示,本试验建立的狂犬病病毒ddPCR方法与实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)方法的符合率为100%。结果表明,本试验建立的狂犬病病毒微滴式数字PCR方法灵敏度高、特异性强,可用于狂犬病病毒的绝对定量检测。     

鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原(如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%(6/85),PCR方法的阳性率为5.88%(5/85),且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。     

基于牛呼吸道合胞体病毒F基因TB Green Ⅱ荧光定量PCR检测方法的建立

为了对牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus, BRSV)进行准确定量检测，针对BRSV F基因设计特异性引物，构建pMD19T-BRSV-gF重组质粒，以其为模板优化反应条件及反应体系，建立TB GreenⅡ荧光定量PCR方法并应用于临床BRSV检测。结果显示，针对BRSV F基因建立的TB GreenⅡ荧光定量PCR方法标准曲线线性关系良好，相关系数为0.995 2;灵敏度高，BRSV最低检测限达3.9×10¹ copies/μL;特异性良好，可特异性检测出BRSV,对牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒的扩增呈阴性；重复性好，批内和批间重复性试验变异系数均小于2%。对50份临床样品进行检测，荧光定量PCR对BRSV的阳性检出率(26%)明显优于常规PCR方法(14%)。结果表明针对BRSV F基因建立的TB GreenⅡ荧光定量PCR检测方法适合BRSV的临床检测。     

牛腺病毒5型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

建立针对牛腺病毒5型六邻体(Hexon)基因的实时荧光定量TaqMan PCR检测方法。根据牛腺病毒5型Hexon基因高度保守区设计引物和TaqMan探针,绘制标准曲线,对其灵敏度、特异性、重复性进行验证,建立牛腺病毒5型实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法。结果显示,构建的重组质粒pUC57-BAV5,标准曲线在10~2～10~7拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.975 2,建立检测方法的最低检测限为32拷贝/μL;应用建立的方法检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、牛呼吸道合胞体病毒无交叉反应;重复性试验表明,同一浓度的20个平行样品的变异系数为1.4%。牛腺病毒5型TaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可以用于牛腺病毒5型的快速、准确的检测。     

C型禽偏肺病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

根据GenBank发表的禽偏肺病毒(aMPV)F基因序列,设计一对特异性引物,建立C亚型aMPV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。对该反应体系进行条件优化,建立了标准曲线,并进行特异性、敏感性及重复性试验,然后将建立的方法应用于临床样品和攻毒样品的检测。结果显示:标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系;建立的方法只能检测出C亚型aMPV,最低可以检测到0.8×10~1拷贝/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于4%。应用建立的方法对43份临床样品检测,结果显示均为阴性;对42份35日龄SPF鸡人工感染后1～21 d的气管和肺脏样品进行检测,结果显示攻毒样品均为阳性。因此,研究建立的特异、灵敏、重复性好的C型aMPV实时荧光定量PCR方法,既可适合于该病的早期诊断和流行病学调查,又为该病毒的致病机制研究提供技术支撑。     

PDCoV与TGEV双重实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

试验旨在建立快捷、高效而准确的鉴别诊断猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）与传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）的双重实时荧光定量PCR方法。通过绘制双重实时荧光定量PCR的标准曲线,检验该方法的特异性、敏感性和重复性,并对临床样品进行检测。结果显示,双重实时荧光定量PCR方法的循环阈值与PDCoV和TGEV质粒拷贝数的对数之间存在良好的线性关系,且对应的相关系数分别为R_（P）²=0.9994和R_（T）²=0.996;能特异性地检测PDCoV和TGEV,而与PEDV、PRV、PRRSV、CSFV和RV无交叉反应,具有较强的特异性;检验PDCoV与TGEV质粒标准品的最低检测限度分别达到2和20拷贝/μL,且分别比常规RT-PCR高1 000和100倍,具有较高的敏感度;PDCoV与TGEV的批内和批间重复性检测的Ct均值基本相同,且变异系数（CV）均<2%,具有较好的重复性。用该方法对114份仔猪腹泻样品检测结果显示,PDCoV和TGEV的阳性率分别为5.6%（6/114）和8.8%（10/114）,混合感染检出率为4.6%（5/114）,比常规RT-PCR具有更高的检出率和敏感性。结果表明,本试验建立的双重实时荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等优点,适用于病毒早期诊断和批量临床样品检测,为疾病防控、流行病学调查及相关性研究提供了技术支持及数据参考。     

猪细小病毒7型Taqman实时荧光PCR检测方法的建立与应用

猪细小病毒7型(Porcine parvovirus 7,PPV-7)是近年新发现的一种细小病毒亚型。为建立PPV-7快速准确的检测方法,以PPV-7病毒全基因组为模板,设计合成1对引物和1条Taqman探针,建立了PPV-7Taqman实时荧光定量PCR检测方法。本方法的标准曲线分析显示,其常数为0.999 2,敏感性可以达到46个病毒拷贝/μL,批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。用猪圆环病毒2型、3型,猪细小病毒1型,猪伪狂犬病病毒等病原进行特异性试验,证实本方法不能从这些病毒中检测出特异性条带,表明本研究建立的PPV-7实时荧光PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点。用临床样品对该方法进行了应用性评价,从96份样品中检出52份PPV-7阳性样品,证实了本方法在生产实际应用的可行性。     

猪星状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种能够快速、简便、灵敏地检测猪星状病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据已报道的猪星状病毒ORF2基因序列,设计并合成1对引物,通过PCR扩增ORF2基因片段,将测序正确的ORF2基因片段克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪星状病毒荧光定量PCR的标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线特异,灵敏度可达1×101拷贝,是普通PCR检测方法的100倍,特异性和重复性较好。本次建立的猪星状病毒荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、敏感等优点,有重要的实用价值。     

猪Hokovirus TaqMan荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立检测PHoV的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据PHoV的VP2基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有VP2基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应.结果显示,该方法的检测灵敏度为10拷贝;而且该检测方法特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3.29％,表明该方法的重复性较好.对华东地区采集的225份临床样品进行检测,结果显示,PHoV的阳性率为14.2％.本研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可以为PHoV的流行病学调查和发病机制等研究提供可靠的工具.