CsFAD7基因转化烟草的研究

以"革新一号"烟草种子为试材,采用根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法将来源于黄瓜的脂肪酸去饱和酶基因(FAD7)转入烟草,并在附加300mg/L氨苄青霉素(Amp)的MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA的培养基上诱导植株分化,再生芽在附加300mg/L Amp和100mg/L卡那霉素(Kan)的MS培养基上生根,获得再生植株。结果表明:Kan阳性植株经PCR检测筛选,得到转基因阳性植株,证明异源FAD基因已转入烟草基因组中。T1代经PCR-South-ern检测证明转化基因可以遗传;转基因烟草在低温胁迫下生长较好,叶绿素荧光参数F0值下降不大,Fv/Fm值保持较高,表现了对低温的耐受能力,脂肪酸分析表明,该基因可以使烟草叶片的亚麻酸含量比例升高。     

过表达香樟CcCBFb的烟草非生物胁迫抗性增强

为探究香樟Cc CBFb基因增强植株非生物胁迫抗性的功能,通过农杆菌介导法将该基因转入烟草中,经PCR和半定量RT-PCR技术鉴定阳性转基因株系后,对获得的T1代转基因无性系(T2和T4株系)以及野生型(WT)进行干旱(0、150、300和450 mmol·L~(-1)的甘露醇)、高盐(0、100、200和300 mmol·L~(-1)的Na Cl)、4℃低温、–4℃冰冻胁迫处理,结果显示:转基因烟草在干旱和高盐胁迫下,幼苗的存活率均高于野生型;经4℃低温处理后,转基因烟草植株的脯氨酸和可溶性糖含量均显著高于野生型植株,而丙二醛(MDA)含量均低于野生型植株;经–4℃的冰冻处理6 h后,野生型和转基因T4株系植株叶片均出现不同程度的萎蔫,而转基因T2株系植株未出现不良现象。由此可见,过表达CcCBFb基因不但能够增强烟草的抗旱和抗盐性,而且能够显著增强抗寒性。     

中国水仙NtPLATZ1正、反义植物表达载体构建及转化烟草的研究

通过构建中国水仙锌指蛋白基因NtPLATZ1正义和反义两种植物表达载体,并用冻融法将其导入农杆菌EHA105菌株,介导遗传转化烟草,对遗传转化的烟草再生植株进行PCR-Southernblot和RT-PCR检测,研究NtPLATZ1的功能。结果表明成功将NtPLATZ1转化烟草,获得5株阳性转基因植株。NtPLATZ1在转基因烟草中过表达能抑制烟草的生长,抑制表达可促进烟草生长。     

转番茄Bax inhibitor-1基因烟草悬浮细胞系的建立

利用农杆菌侵染获得转番茄Bax inhibitor-1(LeBI-1)基因的抗性烟草植株,进行了PCR鉴定和共聚焦扫描显微镜检测;同时以MS为基本培养基研究植物生长调节剂的最佳配比和浓度对建立野生型和转基因烟草悬浮细胞素的影响。结果表明:PCR鉴定为阳性,并检测到绿色荧光蛋白,而且6-BA浓度在0.2 mg/L、NAA浓度为2.0 mg/L条件下,可建立野生型和转基因烟草稳定的悬浮细胞系。     

罗布麻eIF-5A基因功能

以罗布麻为试材,采用农杆菌介导法将罗布麻eIF-5A基因导入烟草,分别对正常生长条件和NaHCO_3胁迫下转AveIF-5A基因烟草和非转基因烟草的过氧化氢酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量进行测定,以期为罗布麻eIF-5A基因功能研究提供参考。结果表明:正常生长条件下,转AveIF-5A基因烟草和非转基因烟草POD活性和MDA含量差异不显著,转基因植株SOD活性显著高于非转基因植株;在NaHCO_3胁迫下,转AveIF-5A基因烟草POD活性和SOD活性均极显著高于非转基因植株,而MDA含量极显著低于非转基因植株。AveIF-5A基因过量表达可以提高转基因烟草的耐盐能力。     

紫红线茄转基因体系的优化及基因SmARF8基因RNA干涉表达载体的遗传转化

建立了以紫红线茄下胚轴为外植体的高效转基因体系。利用该方法,以获得茄子SmARF8基因RNA干涉转基因植株为目的,构建了以NPTⅡ基因为筛选标记的融合表达载体pCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT,并通过农杆菌介导,侵染茄子下胚轴外植体。含有2 mg · L^-1吲哚乙酸,0.5 mg · L^-1玉米素,25 mg · L^-1卡那霉素和500 mg · L^-1头孢氨苄的MS选择培养基可直接诱导外植体产生转基因分化苗,再生率达到80%。转基因苗继续生长并在不含激素的MS培养基上产生健壮根系,最终获得转基因株系。RT-PCR和qRT-PCR分析验证了T₀代转基因株系中内源基因SmARF8被干涉后不表达或表达量降低,Southern blot分析显示选择的T₀代转基因株系中存在1个T-DNA插入拷贝。以上研究结果表明利用建立的转基因体系SmARF8基因在茄子中被成功敲除。     

梨糖转运相关基因PbTMT4启动子克隆及功能分析

以‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri‘Dangshan Suli’)为材料,利用梨基因组数据库,通过PCR获得了糖转运相关基因PbTMT4(Pbr032130.1)2 211 bp的CDS序列及其编码起始位点上游长度为1 220 bp的启动子序列。使用农杆菌介导法将PbTMT4导入拟南芥,与野生型对照植株相比,转基因拟南芥植株的生长速度更快,抽薹、开花时间更早,叶片糖积累量更高。生物信息学分析表明,该启动子中含有多个与逆境应答、激素信号和光信号相关的顺式作用元件。为进一步分析PbTMT4启动子功能,构建了该启动子与GUS基因融合的植物表达载体并转化拟南芥。对T_3代转基因拟南芥各组织进行GUS活性染色和半定量分析,发现GUS基因在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,NaCl、干旱、GA_3、MeJA以及光照处理均能一定程度上提高转基因拟南芥中GUS基因的转录水平。逆境处理发现,PbTMT4转基因株系较野生型植株受到的伤害小。研究结果初步表明,PbTMT4可促进转基因拟南芥发育并提高糖积累量,可能在抗非生物胁迫中起重要的调控作用。     

GhMADS3基因组成型表达对矮牵牛花形和花色的影响

 利用农杆菌介导法将GhMADS3基因转入矮牵牛。对14株转基因植株进行分析鉴定, GUS染 色表明外源基因在转基因植株中表达, PCR检测显示GhMADS3整合到矮牵牛的基因组中, RT-PCR分析表 明GhMADS3在转基因植株中表达。转基因植株花器官普遍较野生型小, 花萼膨大、顶尖向内弯翘, 花冠深 裂且边缘伴有不规则褶皱, 柱头裸露在外, 花器官颜色较野生型变淡甚至完全白化。测定花瓣、花萼中花 色素苷和花萼中叶绿素含量, 结果表明转基因植株均较对照偏低。说明GhMADS3的导入使得矮牵牛花形、 花色发生改变。     

‘粉红亚都蜜’葡萄NAC转录因子基因VvDRL1的功能初步分析

以欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’为材料,利用同源克隆法获得1个NAC转录因子,命名为VvDRL1（GenBank：XP-002281816）。该基因全长840 bp,编码280个氨基酸,与‘黑比诺’葡萄中该基因的同源性为100%,但是基因组DNA序列中存在6处单核苷酸突变。瞬时转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位分析,VvDRL1基因主要在细胞核内表达,属于核蛋白;通过农杆菌介导的叶盘法获得稳定整合的转基因烟草,T2代转基因植株生长迟缓,株高、叶面积和叶片细胞面积约为野生型烟草的60%、34%和31%,转基因植株叶片出现向内卷曲现象,利用石蜡切片进行显微结构观察,转基因植株主叶脉上表皮下缺失2 ~ 3层厚壁细胞,且海绵组织内的空隙明显多于野生型植株。研究结果表明,VvDRL1在调控植株的形态发育方面起着重要作用。     

苹果MdMYB121基因异位表达提高烟草的抗逆性

 苹果MdMYB121（序列号MDP0000196982）蛋白具有典型的R2R3MYB结构域,半定量RT-PCR检测发现,MdMYB121表达能被多种非生物胁迫和逆境相关激素不同程度地诱导。采用RT-PCR技术克隆出该基因的全长cDNA,构建其表达载体并侵染烟草,获得转基因植株。表型分析发现,与野生型对照相比,转基因烟草的种子萌发对盐胁迫不敏感,幼苗的抗盐性也得到明显提高;相对于野生型幼苗,转基因幼苗生长对水杨酸（SA）处理不敏感,根和茎较长,侧根更多。转基因烟草植株对高盐、干旱和低温的抗性比野生型对照明显提高。表明MdMYB121能够响应非生物胁迫,在植物抵抗非生物胁迫中具有重要功能。     

荷花NnNHX1基因耐盐性在转化烟草中的验证

 为研究荷花液泡膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因NnNHX1的耐盐性,构建了植物表达载体pCAMBIA1301-220-NnNHX1,并通过农杆菌介导的叶盘转化法将NnNHX1基因转入烟草。利用荧光定量PCR分析NnNHX1在转基因烟草中的表达情况。对转基因烟草进行盐胁迫试验,并测定其在盐胁迫条件下叶绿素、脯氨酸和丙二醛含量、相对电导率、SOD和POD活性等相关生理指标及后代种子的发芽率。结果显示,在获得的7个转NnNHX1基因烟草株系中,T-N1、T-N2和T-N10等3个株系NnNHX1表达量较高。盐胁迫下,转基因烟草组培苗和盆栽苗的生长状况都好于对照植株,在叶绿素含量、脯氨酸含量、细胞质膜的完整性（相对电导率和丙二醛含量）和抗氧化酶（SOD和POD）活性等方面都好于对照,并且后代种子的发芽率也明显高于对照。表明荷花NnNHX1基因能够在烟草中正常翻译和表达,NnNHX1的过量表达提高了转基因烟草的耐盐性。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

枇杷脱水素基因EjDHN5抗低温胁迫功能研究

为研究枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)脱水素基因(Ej DHN5)在枇杷抗低温胁迫中的功能,将其在烟草中进行过量表达,其中表达水平比较高的两个株系L24和L26被用来进行功能研究。野生型和转基因烟草苗分别用0、2、4和8μmol·L~(-1)的甲基紫精(Methyl viologen,自由基发生剂)处理并进行光照培养,结果显示,4和8μmol·L~(-1)甲基紫精处理使野生型烟草苗存活率分别下降到73.6%和56.9%,光系统Ⅱ(PSⅡ)活性显著降低,而转基因苗的存活率仍维持在100%,PSⅡ活性明显高于野生型。对六叶期烟草的叶盘进行甲基紫精处理,野生型烟草叶盘的叶绿素含量显著低于转基因株系,而活性氧含量和MDA含量明显高于转基因株系。对野生型和转基因烟草苗进行低温处理,转基因株系生长状况明显优于野生型,活性氧含量低于野生型,膜质过氧化程度轻于野生型。这些结果表明,过量表达EjDHN5能提高烟草的抗氧化胁迫和抗低温胁迫能力,推测EjDHN5在提高枇杷抗低温能力方面起着重要作用可能与其能提高抗氧化胁迫能力有关。     

嫁接对番茄产量、品质及耐盐性影响的综合评价

以‘佳西娜74-112’番茄自根嫁接植株及其与8种砧木嫁接植株为试材,研究盐胁迫下不同砧木对番茄生长、产量、品质、钾钠离子吸收与分配、光合作用等的影响,采用隶属函数法进行综合评价。结果表明,虽然盐胁迫降低了生长势和产量,但却显著提高了果实品质。嫁接植株生长势、产量、品质和耐盐性因砧木不同而显著不同。采用‘西方番茄砧木’嫁接进行耐盐栽培,比对照条件下自根嫁接番茄产量降低32.3%,但比盐胁迫栽培的自根嫁接番茄产量提高37.7%,且对果实品质的负面影响相对较小,表现出最强的综合优势。采用隶属函数法将多项指标进行综合排序,提出了一套可应用于番茄耐盐砧木筛选的分析流程,有望为盐碱地土壤的综合开发利用提供参考。     

转YHem1 番茄植株耐盐性的研究

 YHem1是一个由拟南芥HemA1启动子（一种光响应型启动子）控制的酿酒酵母菌5–氨基乙酰丙酸（ALA）合酶基因（Hem1）。将该基因转化番茄植株,可以提高叶片内源ALA含量及其代谢能力,增加叶绿素含量和抗氧化酶活性,并降低产生速率和丙二醛（MDA）含量。200 mmol ·L^-1 NaCl处理,降低了野生型番茄叶片ALA合成与代谢能力和叶绿素含量,同时诱导叶片产生速率、H₂O₂和丙二醛（MDA）含量上升,而超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等抗氧化酶活性则逐渐降低。盐胁迫也导致转YHem1番茄ALA合成与代谢能力、叶绿素含量和抗氧化酶活性下降,但其降幅明显低于野生型。盐处理10 d后,转基因番茄植株保持着较高的生物学积累量和较低的盐胁迫抑制程度,说明转入YHem1基因可以提高番茄耐盐性。此外,转基因番茄叶片H₂O₂含量始终保持较高水平,暗示其可能作为一种信号分子参与细胞生理调节。     

非均匀盐胁迫对番茄幼苗耐盐性的影响

为了研究非均匀盐胁迫下番茄幼苗的光合特性和根系生长发育的状况,采用分根水培系统,设置3个总盐胁迫水平（NaCl浓度）处理——无盐胁迫（0）、中度盐胁迫（0.4%）和重度盐胁迫（0.6%）,按照左右两侧根系处于非均匀和均匀胁迫两种方式分成6个处理：T1（0,0）为对照,T2（0.1%,0.3%）,T3（0.2%,0.2%）,T4（0.1%,0.5%）,T5（0.2%,0.4%）,T6（0.3%,0.3%）,测定各个处理下番茄的光合指标、生物量、Na+和K+含量以及根系生长参数等。结果表明：（1）随着盐胁迫的加重,叶片中Na+含量增加,K+含量、光合指标、生物量和根系生长指标均依次降低;（2）在总盐（NaCl）浓度相同时,与左右两侧根系均匀盐浓度胁迫相比,非均匀胁迫下叶片中Na+含量显著降低（P < 0.05),气孔导度（Gs）与均匀胁迫下无显著差异,但净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）均增加,T2比T3处理下的Pn、Tr分别增加了4.88%和3.83%,T4处理下叶片的Pn、Tr分别比T6处理增加了13.51%和8.25%,T5处理下叶片Pn比T6处理增大了7.83%,Tr无显著差异;（3）当总盐浓度一定时,非均匀胁迫比均匀胁迫下两侧根系的总根长、根表面积、根体积以及总干物质量均有所增加。研究结果表明非均匀胁迫较均匀胁迫显著提高了番茄的耐盐性,这为番茄在盐碱地上的生长提供了耐盐胁迫的理论依据。     

外源腐胺对盐胁迫下黄瓜幼苗叶片PSⅡ光化学特性和体内离子分布的影响

以黄瓜品种‘津优4号’为材料,采用营养液栽培,研究了外源腐胺（Putrescine,Put）对NaCl 胁迫下幼苗叶片光系统Ⅱ（PSⅡ）光化学特性和器官离子分布的影响。结果表明,外源Put提高了NaCl胁迫下黄瓜幼苗叶片最大光化学效率（Fv/Fm）、PSⅡ实际光化学效率（ΦPSⅡ）和保护性热耗散（ΦNPQ）,显著增强光耐受能力和电子传递能力,降低了光损伤程度,抑制了植株体内Na+ 和Cl-向地上部的运输,显著降低了叶中Na+ 和Cl-的含量。说明外源Put能够减少NaCl胁迫下盐离子进入植株叶中,降低离子毒害,减轻不可逆光抑制,进而缓解盐胁迫对黄瓜幼苗光合机构的伤害。     

转香樟CcCBFs烟草的抗逆性分析

为探究香樟CBF基因（CcCBFa、CcCBFb和CcCBFc）增强植株非生物胁迫抗性的功能,对获得的T1代转基因烟草,分别进行300 mmol · L-1甘露醇模拟干旱、300 mmol · L-1 NaCl溶液模拟高盐和4 ℃模拟低温胁迫处理,测定其丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量,探讨其抗逆性。结果表明：CcCBFb和CcCBFc可显著增强烟草抗旱性;CcCBFa和CcCBFc可显著增强烟草抗盐性;CcCBFc可显著增强烟草抗寒性。CcCBFc可以提高转基因烟草抗旱、抗盐、抗寒能力。     

中国野生毛葡萄芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23调控抗白粉病的研究

利用同源克隆法得到抗白粉病的中国野生毛葡萄‘丹凤–2’芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23的开放阅读框,并构建过表达载体;通过器官发生途径诱导不抗白粉病的欧洲葡萄‘无核白’分生愈伤组织并采用农杆菌介导法对其进行转化;经过PCR检测和Western blot鉴定,获得了5株VqSTS11超量表达植株和3株VqSTS23超量表达植株;人工接种白粉菌发现,转基因植株中白粉菌菌丝生长速度慢,孢子萌发受到一定的抑制,并且转基因植株中芪合酶基因相对表达量升高,抗病相关基因表达上调,芪类物质含量积累增多。本研究结果进一步证明中国野生毛葡萄‘丹凤–2’芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23对白粉菌具有抗性,‘丹凤–2’可以为改良欧洲葡萄品种抗病性提供抗病基因,作为抗病育种的资源。