抗水稻黑条矮缩病RNA干扰载体的构建及遗传转化

水稻黑条矮缩病是由水稻黑条矮缩病毒引起的水稻病害,该病可导致病株生长迟缓、矮化、抽穗结实困难,严重影响了水稻的生产。在水稻黑条矮缩病毒基因组不同双链RNA序列的基础上,分别设计了5对特异性引物,通过RT-PCR获得了相应片段,结合基因沉默的方法,分别构建RNA干扰载体,并进一步将发夹结构构建入以玉米泛素Ubi为启动子、以bar基因为选择标记的改造后的植物双元表达载体pCA1300-Ubi中,经农杆菌介导对黄淮稻区主栽水稻品种圣稻13进行遗传转化,成功获得了5个含有水稻黑条矮缩病干扰片段的植物双元表达载体,经农杆菌介导获得了部分水稻转化植株。旨在为下一步对水稻黑条矮缩病的研究及抗病水稻新品种的培育提供材料。     

水稻黑条矮缩病毒基因组片段6编码一种非结构蛋白

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)是引起我国水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病的病原.引起玉米粗缩病的RBSDV湖北分离物10条基因组dsRNA全序列已被确定,其中基因组片段6(S6)全长序列为2 645 bp,只含有一个阅码框(82～2 460 nt),编码一个分子量约为89.6 kDa的蛋白(P6).为进一步研究该蛋白的生物学功能,在大肠杆菌中表达了RBSDV基因组片段6编码的P6蛋白并制备了相应的抗血清.Western blotting分析显示,P6抗血清不与纯化的RBSDV粒子蛋白发生反应,而在被RBSDV感染的玉米叶片和带毒的传播介体--灰飞虱中可检测到P6.此结果表明,RBSDV-S6编码的蛋白是一种非结构蛋白.     

水稻黑条矮缩病毒的研究进展

水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)属于呼肠孤病毒科斐济病毒属第二组成员,其引起的水稻黑条矮缩病在中国稻区造成巨大的经济损失。文章简述了水稻黑条矮缩病的危害情况及病毒特性、病毒各个编码蛋白的研究现状、应用基因工程控制病害等方面的研究进展,为今后对水稻黑条矮缩病的研究提供参考。     

南方水稻黑条矮缩病毒S9片段基因编码产物的生物信息学分析

预测南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV) S9片段编码蛋白的功能,为进一步深入分析相关基因编码产物的功能提供理论依据。应用RT-PCR克隆了SRBSDV云南芒市分离物(SRBSDV-YNMShi)的S9片段,测定其全序列,并对S9及其编码蛋白进行生物信息学分析。结果表明,S9片段全长1900 nt,编码P9-1和P9-2 2个蛋白。S9核苷酸序列与广东、海南、湖北分离物的同源性分别为99.5%、99.1%和98.7%。系统进化分析再次印证了SRBSDV是斐济病毒属的成员,SRBSDV-YNMShi与广东、越南分离物聚成一枝,与海南分离物有一定的进化分离趋势。P9-1为一个不稳定疏水蛋白,亚细胞定位于细胞核内,无规则卷曲是该蛋白质的主要结构元件,与其亲缘关系最近的水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)有着类似结构。P9-2是有2个跨膜结构域的亲水性稳定蛋白,亚细胞定位于质膜,α-螺旋是其主要结构元件,有1个保守的G蛋白偶联受体。P9-1可能为SRBSDV复制的关键因子,P9-2可能为膜蛋白,具有转运的功能。     

普通野生稻对南方水稻黑条矮缩病的抗性机制分析及主效QTL定位

南方水稻黑条矮缩病给水稻生产带来巨大的产量损失,开展水稻对该病的抗性机制分析及抗性基因定位,将为抗病品种培育提供材料基础和理论依据。本研究利用QTL-seq技术结合连锁分析定位抗病野生稻材料Y11的抗性主效QTL。结果表明,Y11对南方水稻黑条矮缩病的抗性源于对病毒的抗性而非抗虫性,属于数量性状。此外,在第6染色体上SSR标记RM20148和RM20297之间检测到一个新的南方水稻黑条矮缩病抗性主效QTL qSRBSDV6。本研究初步阐明了普通野生稻对南方水稻黑条矮缩病的抗性机制,定位到一个新的南方水稻黑条矮缩病抗性主效QTL。研究结果将为南方水稻黑条矮缩病的分子育种奠定基础。     

水稻黑条矮缩病抗性资源的筛选和抗性QTL的定位

通过水稻黑条矮缩病的田间鉴定发现,分蘖盛期的病状最为显著,是病症观察的最佳时期。对江苏省311份粳稻品种进行重病区田间鉴定试验,未发现对黑条矮缩病毒(RBSDV)免疫的品种。江苏省目前正在推广的24个主栽水稻品种发病率在10.0%～30.0%之间,曾推广的287份粳稻品种中,71.5%的品种发病率在10.0%～29.0%之间,其余品种发病率在29%以上。来源于日本的粳稻品种Koshihikari的黑条矮缩病发病率相对较低,籼稻高产品种桂朝2号为感病品种。利用Koshihikari/桂朝2号RILs群体进行抗RBSDV的基因定位,结果在第3染色体上标记RM7～RM5748之间检测到1个抗黑条矮缩病的QTL,来自Koshihikari的等位基因增强了水稻黑条矮缩病的抗性,携带抗性位点的家系明显提高了对RBSDV的抗性。本研究结果将为研究水稻黑条矮缩病和水稻抗黑条矮缩病分子育种提供重要信息。     

水稻草状矮化病毒基因组RNA1-3的分子生物学

水稻草状矮化病毒(以下简称水稻草矮病毒,Rice grassy stunt virus,RGSV),是纤细病毒属(Tenuivirus)的一个成员,病毒粒体丝状,由核衣壳蛋白和基因组RNA组成。该病于20世纪70年代曾在南亚、东南亚大面积发生,给当地的水稻生产造成严重损失,在我国的福建、台湾、广东、广西和海南等地也有分布。与同属病毒其它成员相比,RGSV分子生物学研究进展较为缓慢,直至1998年才报道病毒基因组全序列,其基因组包含6个ssRNA片段,其中RNA1,2,5和6分别对应于纤细病毒属其它病毒的RNA1-4。6个片段均采用双义编码策略。这不仅在纤细病毒属中,在植物病毒中也是独特的。有鉴于此,本文对水稻草矮病毒沙县分离物(RGSV-SX)RNA1-3的分子生物学及部分基因功能进行了研究(RGSV-SX RNA1-3全长序列已递交GenBank登录,登录号分别为：AF509470、AF511072、AF397468)。根据RGSV菲律宾北方分离物(RGSV-IR)序列设计合成引物,通过RT-PCR获得了覆盖RGSV-SX基因组RNA1-3的cDNA克隆。序列分析结果表明,RGSV-SX分离物RNA1长9764个核苷酸,与已发表的RGSV菲律宾IR、SC分离物相比,核苷酸序列同源性均为99．6％,其中,NS1蛋白三个分离物间的氨基酸序列同源性为100．0％、RdRP氨基酸序列同源性分别为95．0％、95．0％、99．0%;RNA2全长4071个核苷酸,RNA2与IR、SC分离物的核苷酸序列同源性分别为97．6％、99．3％,NS2氨基酸序列同源性分别为99．5％、99．0%,NSvc2氨基酸序列同源性分别为96．3％、96．9％;RNA3的全长为3120个核苷酸,整个片段与IR、SC分离物的核苷酸序列同源性分别为98．7％、91．0%,NS3氨基酸序列同源性分别为98．4％、96．4%;NSvc3氨基酸序列同源性分别为99．2％、81．9％。对RGSV各分离物(SX、IR、SC)间RNA1-6核苷酸序列同源性进行多重比较结果表明,RGSV存在明显的重排现象,不同分离物的相应RNA片段存在积累突变的差异。以RNA2、RNA3变异程度较大,SX的RNA2与IR变异较大,变异率达2．36％,更接近于SC分离物,而SX的RNA3-6则与IR分离物更接近,SX的RNA1与IR、SC有变异,但变异不大,且三个分离物间的变异主要发生在基因间隔区。这些结果表明,SX与IR同源性更高,二者具有较近的亲缘关系,而与SC的差异较大,这在分子水平上也进一步确定了SX与IR分离物相近,而与SC分离物相差较远,由此可以推测,我国沙县分离物SX可能来源于菲律宾北方分离物(IR),并在流行过程中经介体昆虫传播发生了较少的基因内重排或变异。对RGSV-SX的vRNA3 ORF片段进行克隆、原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达,并制备了抗血清,为进一步开展NS3基因及它所编码蛋白的功能研究打下基础。通过建立水稻原生质体培养体系,经聚鸟氨酸(PLO)介导将提纯的水稻草矮病毒(RGSV)接种到水稻原生质体内,按不同时间取样,提取其总蛋白,以RGSV抗血清、制备的NS3融合蛋白抗血清及提纯的病害特异性蛋白SP(NS6)抗血清为探针,采用酶联免疫吸附法(ELISA)和蛋白免疫印迹法(Western-blot),研究RGSV在水稻原生质体内的表达周期。构建了含NS3基因的植物表达载体pCBTNSv3,转化农杆菌,用以转化水稻的研究。在实验过程中详细比较了根癌农杆菌转化水稻的各种条件,建立了农杆菌介导的水稻转化的优化系统,克服了再生植株难的问题,获得了转RGSV NS3的水稻转基因再生植株,经鉴定,初步证实NS3基因已整合到水稻的基因组中。     

水稻黑条矮缩病抗性评价方法及抗性资源筛选

水稻黑条矮缩病是水稻主要病毒病害之一。目前由于缺乏规模、高效的黑条矮缩病抗性鉴定体系,制约了抗黑条矮缩病水稻资源的发掘,限制了抗黑条矮缩病的育种进程和基础研究。本研究通过分析水稻黑条矮缩病田间鉴定所需灰飞虱的有效接种密度、带毒率及播期等,提出水稻黑条矮缩病田间鉴定有效接种的灰飞虱密度在800万头 hm^-2左右较为合理,而带毒率应不低于5%。并进一步对现有黑条矮缩病人工接种鉴定的循回期、接种虫量、接种时间及虫龄等进行了优化。利用上述鉴定体系,2010年对来源于20个国家的共1240份水稻种质进行黑条矮缩病田间鉴定,初步获得发病率低于10%的品种34个;2011、2012连续两年对该34个品种进行多年多点重复抗性鉴定,发现来自东南亚地区的3个品种Kanyakumari 29、Madurai 25和Vietnam 160连续3年发病率均低于10%,表现较高的黑条矮缩病的抗性。进一步分期播种鉴定的结果表明,Kanyakumari29在3个播期、3个鉴定点的发病率均低于12%,而Madurai 25和Vietnam 160发病率均低于9%。此外,在人工接种条件下Kanyakumari 29、Madurai 25和Vietnam 160的发病率均低于9%。因此,多年多点田间鉴定和人工室内接种鉴定的结果均表明,Kanyakumari 29、Madurai 25和Vietnam 160稳定、高抗黑条矮缩病。综上所述,本研究建立的田间鉴定与室内鉴定相结合的黑条矮缩病鉴定体系准确、可靠,可用于黑条矮缩病的大规模鉴定,该体系的建立及高抗黑条矮缩病水稻资源的发掘为水稻抗黑条矮缩病基因的鉴定及育种利用提供了重要的方法和材料基础。     

江苏大豆上分离的豇豆轻斑驳病毒基因组序列克隆及特征分析

为明确豇豆轻斑驳病毒江苏分离物的基因组结构特征,阐明其分类地位及进化特点,选择采自江苏的CpMMV大豆分离物作为研究对象,针对病毒基因组序列设计了4对特异性引物,以病样总RNA反转录后获得的cDNA为模板,通过分段法对其基因组序列片段进行了PCR扩增,扩增产物克隆至T载体经验证后进行序列测定,获得的序列片段经拼接组装得到病毒全基因组序列。序列分析结果显示,CpMMV江苏分离物基因组核苷酸序列全长8 194 bp,编码6个蛋白,5′端和3′端各含有一个非编码区(UTR),长度分别为72,117 nt;在编码的6个蛋白中,CP与其他分离物之间的同源性较高(96.5%～100.0%),相对保守;而RdRp(81.1%～98.2%)、TGB1(81.0%～97.0%)、TGB3(80.9%～95.6%)同源性相对较低,在不同分离物中表现较好的多样性;基于全基因组序列的系统进化分析结果显示,江苏分离物与已公开的其他CpMMV分离物同源性较高,共同聚类到一个大分支上,其中与中国安徽分离物同源性最高(98.2%),与海南分离物次之(96.0%),而与美国、巴西、印度、墨西哥、肯尼亚等国外分离物同源性...     

谷子6号染色体雄性不育基因的克隆

克隆谷子雄性不育材料1066A的不育基因,分析不育基因与可育基因存在的突变位点,为揭示谷子雄性不育分子机制、利用分子标记辅助选择方法选育多用途的不育材料奠定基础。利用谷子全基因组测序数据及前人不育基因定位结果克隆谷子雄性不育材料1066A的雄性不育基因,发掘导致不育的突变位点,旨在为从分子水平揭示谷子不育机制、利用分子标记辅助选择方法选育多用途的不育材料奠定基础。首先利用生物信息学方法从豫谷1号6号染色体找到1个雄性不育基因位点(Si015780m.g),该基因全长5 027个碱基,编码479个氨基酸,且位于前人用分子标记定位的基因组区间内。根据豫谷1号不育基因序列设计2对特异引物在雄性不育材料1066A的基因组DNA进行PCR扩增。将扩增产生的2个基因组片段进行拼接后在谷子不育材料1066A中获得2 561 bp的基因序列,包含了下游部分编码区。通过对豫谷1号、张谷、1066A的不育基因部分编码序列及推定的蛋白质序列进行比对分析,结果发现谷子不育材料1066A的不育基因编码序列存在3处突变:2处单碱基替换和1处单碱基插入,这3处突变导致谷子不育材料1066A的不育基因蛋白的第402,403个氨基酸由异亮氨酸和亮氨酸替换成缬氨酸和异亮氨酸,同时导致其不育基因编码的蛋白在第466个氨基酸处发生提前终止。3处突变中2处氨基酸替换对编码蛋白的功能影响不大,因此,认为谷子不育材料1066A的不育基因蛋白翻译提前终止可能是导致其产生不育的原因。     

水稻黑条矮缩病抗性QTL分析

利用珍汕97B/明恢63的重组自交系群体,采用自然发病鉴定的方法,以穴发病率为表型值,对各株系进行黑条矮缩病抗性鉴定。群体的穴发病率偏向于抗病亲本,且呈连续性分布,表明水稻黑条矮缩病抗性受数量性状基因控制。利用WinQTLcart 2.5软件对黑条矮缩病抗性QTL进行分析,共检测到6个QTL,其中第6、11染色体上各有2个,第7、9染色体各有1个。第6、7、9染色体上的4个QTL在两个地点都能检测到,是稳定表达的QTL,尤其是第6染色体上的2个QTL,LOD值分别为12.09和9.77,贡献率分别为20.20%和18.68%,是主效QTL,能在分子标记辅助选择育种中加以利用。     

以标记辅助选择改良江苏主栽粳稻品种“淮稻5号”黑条矮缩病抗性

水稻黑条矮缩病是由灰飞虱传播的一种病毒病,最近在江苏、浙江等省暴发给水稻生产造成严重威胁。本研究在前期对水稻黑条矮缩病抗性基因初步定位的基础上,针对第6染色体短臂上紧密连锁的两个抗性QTL,以抗性亲本“明恢63”为供体,感病亲本“淮稻5号”为轮回亲本,通过标记辅助选择,构建了携带目标抗性QTL的系列近等基因系。自然接种和人工接种鉴定表明新培育的近等基因系其发病率较对照轮回亲本下降25%左右,抗性得到显著改良。农艺性状调查结果显示大多数近等基因系其生育期、株高及产量构成性状等与轮回亲本相似,表明目标区段存在较少的累赘连锁。此外,对有关如何实现目标QTL的精细定位,以及利用标记辅助选择聚合多个抗性QTL培育抗病品种的策略也进行了探讨。     

玉米抗粗缩病自交系种质的发掘和遗传多样性及其在育种中的应用

玉米粗缩病是近十年来危害我国部分玉米产区的主要病害之一, 挖掘抗粗缩病玉米种质, 进而培育抗病品种是防治粗缩病危害最经济有效的途径。选用184份常用玉米自交系(包括111份普通玉米和73份糯玉米)于2009—2010年在玉米粗缩病重发区江苏沿江地区农业科学研究所试验田进行田间自然鉴定; 同时利用117对SSR引物对供试的玉米自交系进行多态性检测, 按UPGMA方法, 利用Powermarker 3.0软件对184份自交系进行系统聚类分析。筛选出2份高抗(T877和YJ7)、6份抗病普通自交系和2份糯玉米抗性种质。基于644个SSR多态性位点, 结合系谱资料和育种实践, 将184份自交系划为9个杂种优势亚群。自交系4S及其衍生系(第VI亚群)和来源于美国杂交种78599的玉米自交系(第VIII亚群)为玉米抗粗缩病育种的重要种质。     

小麦和水稻auxin基因家族的生物信息学比较分析

根据测序获得的1条260 bp cDNA片段,通过预测发现其包含小麦植物生长素(AUXIN)基因的部分编码序列,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217的cDNA中扩增获得一条608 bp的cDNA片段,该基因序列数据库(GenBank)登录号为AY902381(基因)和(蛋白).编码202个氨基酸,预计蛋白的分子量为23.0 kDa,等电点为9.93.利用已经分离的小麦生长素(AUXIN)基因的保守序列为检索序列,对小麦和水稻中的AUXIN基因家族成员进行分析,利用这些基因编码蛋白序列构建系统发生树,查找在GenBank的EST数据库中查找这些基因的ESTs表达序列,分析了这些基因在细胞中的定位情况和蛋白结构的相似性,根据已知相似基因的功能,分析该基因有进一步深入研究的必要.     

水稻苯达松敏感致死基因(ben)的电子杂交定位和基因预测

来自水稻突变体的苯达松敏感致死基因（ben）能够作为一种除草剂筛选标志用于杂交水稻种子的安全生产。本研究利用我们已得到的与Ben/ben基因紧密连锁的两个RAPD标记（OPG18/972,OPG18/943）以及与该标记高度同源的跨叠克隆Contig10968（来自中国水稻基因组框架序列,全长8 273 bp）的序列信息,沿标记的两端设计新的PCR引物     

2个水稻矮杆突变体的遗传分析

为了研究水稻矮杆突变体的遗传规律,通过将2个矮杆突变体mini-plant（mp）和矮糵丛生突变体分别与‘明恢63’、‘明恢86’等进行正反交杂交组合,经过田间的性状调查与卡方测定,发现F1代中2个矮杆突变体均为隐性遗传,在F2分离群体中,2个矮杆突变体的遗传规律符合孟德尔的常染色体单基因隐性遗传。因此,可以推断2个水稻矮杆突变体都是由常染色体上的隐性单基因控制。     

玉米病毒病发病流行原因分析与防控对策

玉米病毒病是系统侵染性病害,是玉米上危害损失重而难以防治的病害。为了探明浙江西北部地区新近大面积发生的玉米病毒病病原和灾发流行规律,研究提出防治技术。于2008-2011年对该病的病原、传毒媒介、发病流行规律、致灾因子和综合防治技术进行调查试验研究。结果表明,浙江临安等地发生的玉米病毒病为玉米矮缩病,又称玉米粗缩病,是由水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)引起,灰飞虱为传毒媒介;病害发生流行与介体灰飞虱发生量和带（传）毒率、气候条件、玉米品种抗病性、播栽期,以及水稻发病状况等具有密切关系;提出了病害防控对策和综合防治技术,并在生产上示范和大面积推广应用,有效地控制了病害发生危害,保障了玉米的丰收,取得了显著的经济和社会效益。