橡胶树红根病菌Fip-gpo基因的克隆及启动子分析

为预测橡胶树红根病菌(Ganoderma pseudoferreum)真菌免疫调节蛋白基因的序列特点和表达模式,采用同源克隆获得Fipgpo的c DNA和DNA的全长序列。结果表明:该基因编码区全长934 bp,编码111个氨基酸残基,分子量为12.54 k D,等电点4.66,有4个ATM磷酸化位点,与赤灵芝(G.lucidum)的Fip序列相似性为91%;其启动子区域含有59 bp的内含子,除了含有TATA-box、CAAT-box基本元件外,还含有参与光应答/调控元件、赤霉素响应元件、茉莉酸甲酯应答元件、厌氧诱导作用元件、调控在胚乳中特异表达的顺式作用元件、分生组织特异激活顺式元件及生长素反应元件。推测Fip-gpo基因的表达受激素、非生物诱导、光照等的调控。     

白桦BpPR1基因生物信息学分析

利用生物信息学方法,对白桦BpPR1理化性质、亲水/疏水性、跨膜结构、二级结构、三级结构及与其他植物PR1蛋白的同源性进行了预测,同时对该基因启动子的顺式作用元件以及基因结构进行了预测和分析。结果表明,①BpPR1的cDNA全长为816 bp,CDS为531 bp,编码由176个氨基酸构成的稳定亲水性蛋白,存在跨膜运输结构,属于CAP蛋白家族的一员。白桦BpPR1与葡萄、枣亲缘关系较近;②BpPR1基因组结构中含有2个外显子和3个内含子;③BpPR1启动子含有多个真核生物启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box,还含有与低温响应、脱落酸响应、茉莉酸甲酯响应、生长素响应、水杨酸响应、细胞分裂素响应相关的响应元件以及MYBHv1结合位点等,说明该蛋白可能受多种生长调节剂调控,参与生物与非生物胁迫过程。     

水稻B-box锌指蛋白基因OsBBX26的 克隆及表达分析

[目的]克隆水稻B-box锌指蛋白基因(OsBBX26),并分析其在非生物胁迫下的表达模式,为探究水稻B-box蛋白的非生物胁迫响应机制提供理论依据.[方法]以水稻模式品种日本晴为材料,采用RT-PCR克隆OsBBX26基因,对其进行生物信息学分析,并通过构建pBA-OsBBX26-YFP植物表达载体进行亚细胞定位.同时,采用实时荧光定量PCR检测分析OsBBX26基因的组织特异性及非生物胁迫(干旱、ABA、低温和高盐)下的表达模式.[结果]克隆获得的OsBBX26基因(LOC_Os08g42440)cDNA全长序列为1467 bp,编码488个氨基酸,其编码蛋白分子量为51.86 kD,理论等电点(pI)为6.63,包含1个B-box锌指结构域和1个CCT结构域,其中B-box结构域位于第13~60位氨基酸,CCT结构域位于第435~478位氨基酸,该蛋白定位于细胞核中.OsBBX26基因位于8号染色体上,启动子区域除了含有TATA-Box和CAAT-Box等基本转录元件外,还含有与逆境相关的顺式作用元件,包括低温响应元件LTR、脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element、厌氧响应元件ARE、茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif,以及MYB转录因子结合位点.OsBBX26蛋白与粳稻B-box蛋白亲缘关系最近,其次与籼稻B-box蛋白亲缘关系较近,与其他植物B-box蛋白也存在较高的相似性,其中与小米、大麦、高粱、玉米和短柄草B-box蛋白的氨基酸序列相似性分别达72%、72%、71%、69%和68%.OsBBX26基因在幼叶中的表达量最高,其次是在成熟叶片中,在幼根、成熟根、茎和幼穗中的表达量均极低,表明该基因表达具有明显的组织表达特异性.干旱、高盐、ABA和低温胁迫处理下OsBBX26基因均上调表达,干旱、高盐和ABA胁迫处理12 h达峰值,但低温胁迫处理在24 h后才达峰值.[结论]OsBBX26基因受干旱、高盐、ABA和低温胁迫诱导均上调表达,推测其参与水稻植株响应多种非生物胁迫,在逆境响应中发挥重要调控作用.     

马铃薯StSnRK2.4基因的克隆及其序列特征分析

利用RT-PCR技术从马铃薯普通栽培品种‘陇薯3号’试管苗根部扩增得到StSnRK2.4基因的cDNA序列,并对其编码蛋白进行特性和结构分析.结果表明:该基因序列全长1 083bp,编码360个氨基酸,与烟草SnRK2家族基因具有较高的同源性,达95.56%,已注册该基因到GenBank(No.JX280914);该蛋白分子量为41.49kU,理论等电点为5.52,是一个不跨膜的膜内蛋白,主要存在于细胞核中,含有依赖cAMP/cGMP蛋白激酶磷酸化、蛋白激酶C磷酸化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、酪氨酸蛋白激酶磷酸化和豆蔻酰化位点,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点信号序列和蛋白激酶ATP结合区域信号序列,推测该基因功能与植物抗逆境胁迫有关.     

木薯MADS-box基因克隆及其响应乙烯信号的表达模式分析

利用电子克隆技术从木薯基因组DNA中获得1个MADS-box基因,对其理化性质进行分析,并对该蛋白响应激素信号进行研究.结果表明:该基因含有全长为687 bp的ORF,编码229个氨基酸.通过对该蛋白进行ProtScale程序预测表明,该蛋白可能为亲水性蛋白;理化性质分析表明,该蛋白相对分子量为26.1037 ku,等电点为6.87;跨膜结构域预测表明,该蛋白为非分泌型蛋白;亚细胞定位分析该蛋白可能定位于细胞核;磷酸化位点分析表明该蛋白能被丝氨酸激酶所磷酸化.运用定量PCR对该基因响应乙烯信号的表达模式进行分析,结果表明,该基因能够响应乙烯信号,并在外施乙烯12h时具有最高的表达量.本研究为进一步研究该基因响应乙烯信号影响木薯叶片的生长发育提供研究基础.     

黄瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS2克隆与表达调控

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是合成棉子糖系列寡糖(RFOs)的关键酶，在植物抵抗非生物胁迫过程中发挥重要作用。为探究GolS2基因在黄瓜应答非生物胁迫中的作用，本研究采用RT-PCR法从黄瓜中克隆了GolS2基因，其开放阅读框长度为981 bp,编码326个氨基酸，植物GolS2蛋白氨基酸序列一致性很高。进化树中，黄瓜GolS2蛋白与拟南芥GolS2和GolS3蛋白聚在同一分支，亲缘关系最近。盐胁迫和低温胁迫处理显著诱导GolS2基因在黄瓜幼苗中的表达，但低温处理显著抑制GolS2基因在采后黄瓜果实中的表达。对其启动子顺式作用元件的分析结果显示，GolS2基因启动子中含有多个与逆境胁迫响应有关的顺式作用元件。在采后黄瓜果实中沉默HHO2和GRP3基因的表达，显著下调GolS2基因表达，表明这两个基因调控GolS2基因表达。本研究结果明确了GolS2基因在不同类型黄瓜组织中应答非生物胁迫的功能存在差异，这为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

黄瓜细胞质型谷氨酰胺合成酶基因(GS1)的克隆及其在低氮条件下的表达

【目的】分离和克隆黄瓜谷氨酰胺合成酶GS1基因,分析其序列特征,了解其在低氮条件下的表达情况。【方法】依据黄瓜基因组数据库中Csa015274基因编码区全序列,应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物,从黄瓜叶片cDNA中克隆该基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析鉴定,并用实时荧光定量PCR法研究GS1基因在不同氮素浓度下的表达变化。【结果】分离到GS1基因,GenBank登录号为JQ277263。该基因长1 071 bp,编码356个氨基酸,与甜瓜(Cucumis melo L.)GS1基因同源性高达97%。该基因编码的蛋白是1个不稳定的疏水蛋白,无跨膜结构,无信号肽,存在蛋白激酶C磷酸化位点,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,N-十四酰化位点,酪氨酸激酶磷酸化位点等活性位点。GS1基因表达模式分析显示,在低氮条件下,该基因下调表达,随着氮素浓度的增高GS1基因的表达量增加。在高浓度的氮素水平下,该基因的表达同样受到抑制。【结论】成功从黄瓜叶片中分离克隆到GS1基因,该基因具有已知物种GS1基因的特征,可用于该基因的功能研究。     

大豆转录因子GmDof1.5的克隆与非生物胁迫诱导表达

Dof转录因子在植物的生长发育和非生物胁迫响应中起重要的调控作用。利用RT-PCR技术从大豆中克隆了一个功能未知的Dof转录因子基因GmDof1.5,该基因位于大豆基因组15号染色体上,ORF全长540 bp,编码含有179个氨基酸的蛋白质,相对分子质量为20.15 ku,等电点为9.82。蛋白序列预测发现,GmDof1.5蛋白含有一个典型Zf-Dof结合域,且含有大量磷酸化位点。蛋白系统进化分析表明,大豆GmDof1.5与豆科植物鸡血藤SsDof4的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,ABA、干旱、高盐、高温和低温胁迫均可不同程度地诱导GmDof1.5的表达,且GmDof1.5对高温胁迫的响应最为显著。     

棉铃虫核型多角体病毒ORF44基因的序列分析及原核表达

棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)ORF44是一个功能未知的基因,研究对HearNPV ORF44基因的序列及原核表达进行了初步研究。结果表明,HearNPV ORF44基因全长1 137 nt,编码378aa,预测编码蛋白分子量为42.7 ku。序列分析显示,ORF44具有双相启动子特征序列,同时兼有杆状病毒早期和晚期基因转录启动子特征序列。ORF44的推导氨基酸序列中含有1个强跨膜螺旋区域,32个磷酸化位点和4个糖基化位点。除HzNPVORF45外,未发现与ORF44氨基酸同源性高于30%的基因。构建了pET-44表达载体,并在大肠杆菌BL21中得到了高效表达,表达的融合蛋白分子量为44 ku,与预测编码蛋白分子量大小相符。序列分析结果表明,ORF44是He-arNPV的一个特有基因,ORF44融合蛋白的成功表达为深入研究HearNPV ORF44奠定了基础。     

淡色库蚊肌动蛋白全长基因的克隆及生物信息学分析

为阐明肌动蛋白抗药性相关机制及研制新型卫生杀虫剂奠定基础,根据库蚊抗性与敏感品系差异表达的EST片段,设计特异扩增引物,运用RACE技术从淡色库蚊抗性品系中扩增出该抗性相关基因的全长cDNA序列,分析其生物信息学特性。结果表明,获得淡色库蚊肌动蛋白基因cDNA全长1 708bp序列,其编码377个氨基酸;该基因编码的蛋白为膜蛋白,具有27个跨膜螺旋、1个信号肽切割位点、27个磷酸化位点。     

意大利蜜蜂Ci蛋白的生物信息学分析

【目的】掌握意大利蜜蜂转录因子(Ci)的生物信息学并阐述其功能,为揭示Ci蛋白在意大利蜜蜂Hh信号通路中的功能和作用打下基础。【方法】从NCBI获取意大利蜜蜂Ci蛋白氨基酸序列,分别使用ProtParam预测其理化性质、SignalP-5.0预测信号肽、TMHMM-2.0预测跨膜结构,通过NetOGlyc 3.0、NetNGlyc 1.0、NetPhos 3.1、SUMOplot等进行O-糖基化位点、N-糖基化位点、磷酸化位点及苏木化位点预测,采用GOR4、SWISS-MODEL、CD-Search等预测意大利蜜蜂Ci蛋白高级结构,在多重序列比对分析的基础上利用MEGA 11.0构建系统发育进化树,并通过String数据库预测相互作用蛋白。【结果】意大利蜜蜂Ci蛋白存在2个亚型,分别是XP＿624136.4和XP＿006558245.2。其中,XP＿624136.4亚型的开放阅读(ORF)为4338 bp,编码1445个氨基酸残基,编码蛋白分子量为15.50 kD,理论等电点(pI)为8.39;XP＿006558245.2亚型的ORF为3873 bp,编码1290个氨基酸残基,编码蛋白...     

野生茄托鲁巴姆蛋白酶抑制剂基因StPI1的克隆与特征分析

以野生茄托鲁巴姆为材料,在利用SSH文库获得基因片段的基础上,采用RACE方法克隆了1个蛋白酶抑制剂Ⅱ型基因的全长cDNA序列,命名为StPI1。StPI1 cDNA序列全长790bp,含有29bp的5′-UTR和201bp的3′-UTR,编码包含202个氨基酸的前体蛋白。StPI1前体蛋白N末端1~27位为信号肽,成熟蛋白含有3个保守的蛋白酶抑制剂Ⅱ结构域。预测StPI1蛋白含有1个磷酸化位点、1个糖基化位点和3个N端酰基化位点。表达模式分析表明,在黄萎病菌侵染后,StPI1在托鲁巴姆根中呈上调表达。     

硒诱导的黄瓜耐镉转录本鉴定分析及表达载体构建

以黄瓜乙烯响应因子CsERF7转录本为研究对象，通过外源硒缓解黄瓜镉胁迫试验分析其表达及黄瓜生长状况，并克隆CsERF7基因，构建过表达载体转化拟南芥，同时分析CsERF7的理化性质和功能。结果表明，外源硒显著升高了镉胁迫引起的黄瓜生长指标的降低，CsERF7在镉处理下的表达丰度是对照的56%,而镉+硒比单独镉处理上调表达4.53倍，与RNA-seq结果相符，此基因可能在硒调控黄瓜镉胁迫响应中起作用。同时，成功构建超表达载体pEGOEP35S-H-ERF7-GFP,转化拟南芥获得转基因株系。生物信息学分析表明，黄瓜CsERF7基因属于AP2/ERF家族的AP2亚家族，开放阅读框ORF长度588 bp,编码196个氨基酸，有1个AP2结构域；该蛋白属于非跨膜亲水性蛋白，亚细胞定位预测定位在线粒体中，存在22个氨基酸磷酸化位点；其二级结构主要由α-螺旋和延伸链构成，与三级结构预测结果高度一致，所得蛋白序列与黄瓜、甜瓜同源性最高。     

苦荞转录因子FtNAC15基因的克隆及表达分析

为研究NAC转录因子在苦荞中的功能,从苦荞发育种子中克隆了一个NAC家族基因,其开放阅读框全长1 098 bp,编码365个氨基酸,将其命名为FtNAC15。基因结构分析表明:FtNAC15基因由3个外显子和2个内含子组成。氨基酸序列多重比对和进化关系分析表明:FtNAC15蛋白与水稻ONAC003、拟南芥ANAC010和ANAC073亲缘关系较近,属于NAC家族转录因子家族中同一亚组。基因上游启动子序列顺势作用元件分析表明:该基因启动子中的顺式作用元件可以分为5类,即启动子核心元件、节律和光照响应元件、转录因子结合位点、非生物胁迫响应元件和激素响应元件。表达分析表明:FtNAC15基因在种子发育的成熟期和干旱胁迫下上调表达,表明其参与调控荞麦种子发育和响应干旱胁迫。     

大豆铁结合蛋白基因的克隆及其推定蛋白结构分析

根据GeneBank数据库中大豆类铁结合蛋白序列设计引物,通过反转录方法从豫豆8号中克隆到cDNA片段,测序结果表明,该基因cDNA全长752 bp,编码250氨基酸.利用DNAMAN软件进行序列比对分析发现,该cDNA的氨基酸序列与大豆(M64337.1)铁结合蛋白同源性高达98%以上.运用生物信息学软件及相关网站对其功能位点、结构功能域分析,结果显示,该基因具有1个FER-RITIN-LIKE功能域、2个铁结合蛋白基因家族铁结合区域的信号序列、6个磷酸化位点等重要功能位点.     

斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF56基因的序列分析及原核表达

对斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF56基因的序列特征及原核表达进行了初步研究.ORF56基因编码区全长675 bp,编码224个氨基酸,预测编码蛋白分子量25.9 ku.序列分析显示,ORF56具有典型的晚期启动子特征序列GTAAG,推导的氨基酸序列中含有13个磷酸化位点和3个N-糖基化位点.PCR扩增获得该基因,克隆到融合表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21中诱导表达.用纯化的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,为深入研究SpltMNPVⅡORF56的结构与功能提供基础.     

毛竹cab-PhE11基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR技术和RACE-PCR技术,从毛竹(Phyllostachys edulis)中分离了捕光叶绿素a/b结合蛋白基因cDNA编码区全长,命名为cab-PhE11(GenBank登记号:EU327783)。该基因全长1154 bp,编码区cDNA全长753 bp,编码250个氨基酸。生物信息学分析表明,在cab-PhE11编码的蛋白第62~239位包括典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,还包含1个N-糖基化位点、1个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点、5个N-肉豆蔻酸化位点以及1个丙氨酸富集区。序列相似性分析结果表明,cab-PhE11编码的氨基酸序列与玉米、绿豆、拟南芥、烟草等的cab基因有较高的相似性,都在80%以上,该基因属于lhcb6类基因。     

鸽泛素折叠蛋白基因的生物信息学分析

通过对鸽脑垂体cDNA文库进行筛选,获得泛素折叠蛋白(ubiquitin-fold modifier 1,Ufm1)基因的全长cDNA序列,并通过生物信息学方法对鸽Ufm1的E序列进行相关分析预测该基因编码蛋白的理化特性、翻译后的修饰位点及二级结构等.研究结果表明:Ufm1基因全长781 bp,包含1个258 bp的ORF编码85个氨基酸,该序列的GenBank登录号为EU914822.Ufm1属于非跨膜蛋白,cDNA编码的氨基酸序列发现糖基化位点4个,预测到有3个Ser和4个Thr存在潜在的磷酸化.预测此Ufm1的二级结构中β延伸链占34.1%,α螺旋占24.7%,无规则卷曲占41.2%.Ufm1基因的全长DNA序列的筛选及分析结果可为泛素-蛋白酶体通路在鸽就巢泌乳机制中作用的相关研究提供理论参考.     

沙冬青A20／ANl锌指蛋白基因序列及表达分析

A20/AN1锌指蛋白普遍存在于真核生物中,在胁迫响应引起的信号传导过程中发挥着重要作用。本文利用生物信息学和RT-PCR方法从低温干旱胁迫的沙冬青叶片组织中分离锌指蛋白基因AmSTZF,该基因编码一条含172个氨基酸残基的多肽,含A20和AN1两个锌指蛋白保守结构域,属A20/AN1锌指蛋白。生物信息学分析显示该蛋白定位于细胞质中,具有磷酸化位点,参与细胞转录调控。RT PCR分析表明:低温和干旱胁迫处理的沙冬青叶片中,AmSTZF的表达增强,初步推测该基因与沙冬青低温、干旱胁迫响应相关。      

不结球白菜响应ABA和低温基因WRKY18的克隆及表达分析

[目的]WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物的生长发育、生物及非生物胁迫响应。克隆和鉴定不结球白菜共同响应ABA和低温的WRKY基因,对研究不结球白菜抗逆分子机制和改良其抗逆性具有重要意义。[方法]采用电子克隆的方法在NCBI数据库中进行不结球白菜WRKY18基因全长拼接,然后在不结球白菜‘苏州青’中,克隆到1个与低温及ABA响应相关的WRKY基因,通过生物信息学手段和实时定量RT-PCR(qRT-PCR)技术分析了该基因的序列结构特征及其在低温和ABA处理下的表达变化。[结果]该基因全长为1080bp,含有978bp的开放阅读框,编码326个氨基酸,与油菜及拟南芥的WRKY18直系同源,氨基酸序列相似性分别为87%和73%,命名为BcWRKY18。序列分析表明,该编码蛋白为核蛋白,不含跨膜区,无信号钛,具有WRKYGQK基序(motif)约60个氨基酸残基的WRKY保守结构域,为WRKY转录因子家族成员。系统聚类分析指出了BcWRKY18蛋白的保守性及其在开花植物中的进化关系;序列结构和同源建模分析指出了BcWRKY18蛋白的保守结构域、蛋白质的二级及三级结构分布模型;qRT-PCR检测了BcWRKY18基因在ABA和低温胁迫下的表达,表明低温和ABA都能诱导BcWRKY18基因表达,其表达模式都存在相似的过程,且BcWRKY18基因对ABA的响应比对低温的响应更快、更明显。[结论]从不结球白菜中克隆获得1个新的WRKY类转录因子基因BcWRKY18,基因表达分析发现BcWRKY18可能存在对ABA和低温的共响应及自身反馈调控。