‘西伯利亚’百合丙二烯氧化物环化酶基因LsAOC的克隆及其表达分析

【目的】研究茉莉酸(JA)信号途径在花香的形成及释放中的作用。【方法】以‘西伯利亚’百合(Lilium ‘Siberia’)为试验材料,通过RACE技术克隆得到了丙二烯环化酶基因(allene oxide cyclase,AOC),并将其命名为LsAOC。【结果】该基因全长741bp,编码246个氨基酸,与麝香百合和岷江百合的序列极为相似。在不同花期与器官中基因相对表达量存在差异。在花朵不同开放阶段,盛开期表达量最低,在其他3个时期表达量无显著差异。LsAOC在内花被片、叶片、子房和外瓣中的表达水平较高。【结论】AOC基因可能通过JA信号途径在花朵发育中发挥调控作用。     

唐菖蒲GhAOS基因的克隆与表达

丙二烯氧合酶(AOS)是茉莉酸(JA)生物合成途径中的关键酶,为深入研究AOS基因在唐菖蒲茉莉酸生物合成途径中的作用及唐菖蒲球茎膨大的分子机制,以唐菖蒲品种‘Rose Supreme'的球茎为试材,采用RT-PCR和RACE技术,克隆到了一个GhAOS的cDNA序列,序列内部含有一个1 533 bp的开放阅读框(ORF...     

藜麦CqCHS1基因的克隆及胁迫下表达分析

查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)是植物类黄酮合成途径中的一个关键限速酶,参与植物中多个合成代谢途径,包括花青素合成。通过PCR反应成功克隆出藜麦CHS基因(CqCHS1)的cDNA全长序列,并进行预测分析,包括CqCHS1基因结构和编码的蛋白质保守结构域。同时,利用qRT-PCR技术检测了在不同胁迫处理下CqCHS1的表达情况。结果表明,CqCHS1基因包含2个外显子和1个内含子,其编码的蛋白质由392个氨基酸残基组成。CqCHS1蛋白是亲水性蛋白质,不存在信号肽,定位于细胞质。进化分析显示,CqCHS1与拟南芥AtCHS1的亲缘关系最近,其基因功能可能存在相似性。此外,还发现在CqCHS1基因启动子区域存在多个与胁迫和激素响应相关的顺式作用元件。表达分析结果表明,藜麦幼苗中CqCHS1的表达不会受到干旱胁迫的影响,而外源脱落酸(ABA)处理会抑制CqCHS1的表达,低温胁迫则会诱导CqCHS1的表达。本研究结果为进一步探究藜麦CqCHS1的基因功能提供了基础。     

决明异分支酸合酶基因的克隆及表达分析

异分支酸合酶(Isochorismate synthase,ICS)控制着分支酸到异分支酸衍生的各种产物的分配,据报道它是植物体内蒽醌类物质合成的限速酶.该文采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆其基因全长(SoICS);以荧光定量PCR(FQ-PCR)测定其在植株各部位的表达谱并考察其与蒽醌质量分数的关系.结果表明,SoICScDNA全长为2 103bp(GenBank Accession KF547925);有多个非典型的加尾信号;含一个总长为1 713bp的完整阅读框,编码570个氨基酸;SoICS含有AtICS1和AtICS2中与ICS催化活性相关的5个保守关键氨基酸残基;其N-端有48个氨基酸残基的推定前导序列;具有典型的保守分支酸结合结构域;有多个显著磷酸化位点;其蛋白质三维结构是一个紧凑型球状结构;系统分析显示,决明ICS与蓖麻、毛果杨和山杨的ICS关系较近.FQ-PCR分析表明,ICS基因在叶中表达水平最高,其次为茎、荚果皮、幼果和种子,在根和花中的表达量最低;总蒽醌、游离蒽醌和结合蒽醌质量分数的相关性达到极显著水平,但SoICS转录本表达量和蒽醌质量分数之间没有达到显著相关水平.     

普通烟草CDPK基因家族的克隆及表达分析

 【目的】从烟草中分离更多CDPK基因,分析该基因家族的序列特征、进化关系和表达谱,为全面揭示其功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR、RACE和生物信息学的方法,分离普通烟草CDPK基因;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用RT-PCR研究普通烟草全长基因的表达谱。【结果】分离到普通烟草CDPK基因8个,其中3个可以找到完整的开放读码框;系统进化树分析显示,烟草属11个全长CDPK基因位于4个亚家族,预测的2对普通烟草和拟南芥的直系同源基因在功能上可能非常保守;3个普通烟草全长基因虽然在所有的组织中都能检测到,但是它们的表达谱在不同的组织间存在明显差异。【结论】分离到8个未报道的普通烟草CDPK基因,结合已有的报道,目前在普通烟草中获得了15个CDPK基因,为在基因组范围内研究普通烟草CDPK基因家族的功能奠定了基础。     

CBF3基因的克隆、生物信息学分析及植物表达载体的构建

从拟南芥基因组DNA中分别克隆了CBF3基因和逆境诱导型启动子Rd29A,测序结果显示:克降的CBF3基因长776bp.编码216个氨基酸,与GeneBank公布的的序列相比对,核苷酸同源性达到99.2%,并利用生物信息学手段对其氨基酸序列、进化树、理化性质、疏水性/亲水性等进行分析;启动子Rd29A全长为956 bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸同源性为99.5%.以双元载体pCAMBIAl301为基础,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301一Rd29A-CBF3,为利用CBF2基因提高植物的耐寒性创造了条件.     

水稻乙醇酸氧化酶基因的克隆和表达分析

根据水稻数据库中乙醇酸氧化酶(GLO)基因的编码序列,设计引物,克隆了水稻OsGLO3基因的序列,该片段长1 104bp,编码367个氨基酸,含有11个外显子。荧光定量PCR结果表明:OsGLO4在不同水稻生育期中表达量差异较大,且OsGLO1和OsGLO4在生长发育后期表达量较高,OsGLO2和OsGLO5在生长发育前期表达量较高。     

长春碱生物合成途径中关键酶基因的克隆与生物信息学分析

以长春花幼苗的叶片为材料,通过RT-PCR克隆关键酶基因CDS序列,利用在线软件ExPASy ProtParam、SignalP 4.1、TMHMM V.2.0、TargetP 1.1分析蛋白理化性质、蛋白信号肽、蛋白跨膜区以及亚细胞定位,在线工具Conserved Domain、SOPMA预测蛋白保守结构域和二级结构,MEGA6.0软件构建蛋白系统进化树,为后续的TIA合成提供理论研究依据。结果表明,STR、TDC、和ORCA3关键酶基因的CDS序列大小分别为1 059、1 503、612 bp;生物信息学分析表明,STR、TDC、和ORCA3关键酶定位于细胞不同区室,为酸性蛋白,无信号肽,除STR外无跨膜区,由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲等二级结构组成;除TDC外均包含高度保守的结构域;聚类分析表明其与小蔓长春花、罗芙木和中果咖啡具有较高的相似性,较近的亲缘关系和遗传距离,该结果可为明确该基因在TIA合成代谢途径中的重要作用奠定基础。     

枇杷果实蔗糖磷酸合酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

根据GenBank中已登录的多种植物的蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,从枇杷果实中扩增出该基因的cDNA片段并测序,分别为386 bp和383 bp。序列分析表明,枇杷果实蔗糖磷酸合成酶基因与桃果实蔗糖磷酸合成酶基因相似性达91%。半定量RT-PCR分析表明,该基因在枇杷果实生长发育过程中的表达量逐渐增加。所得基因片段已在GenBank中注册,386 bp和383 bp登记号分别为HM122759和HM146926。     

烟草类萜生物合成途径中关键酶基因的克隆与表达调控

萜类化合物是烟草重要的香气前体物质,它们的降解产物是烟草最重要的香气来源之一.本研究概述了类萜代谢途径及其相关酶类的克隆与表达调控的研究进展,并对利用类萜代谢工程调控该代谢途径来提高烟草香气品质的应用前景进行了展望.     

烟草质膜ATPase4基因的克隆、表达载体构建及表达分析

植物细胞质膜ATPase基因表达可以引起细胞向外界环境释放H⁺,从而形成细胞膜内外的电化学式梯度,促进各种离子的运输,抵抗外界的各种胁迫。为研究ATPase基因在烟草中的非生物胁迫调控机制及相关生物学功能,本研究采用同源克隆的方法,从普通烟草K326中克隆到了1个ATPase4同源性基因,成功构建ATPase4-pcambia1300过表达载体。利用生物信息学分析ATPase4基因编码蛋白的疏水性、理化性质、蛋白结构预测、信号肽预测、磷酸位点预测及同源性分析,结果显示,该基因与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)质膜ATPase4具有99%同源性,故命名为质膜ATPase4基因。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)测定该基因在烟草组织中的表达量及其在非生物逆境胁迫中的表达模式,结果表明,该基因在根中表达量最高,且能快速响应低钾、高盐、PEG和冷胁迫诱导,说明ATPase4基因在烟草逆境胁迫中发挥着重要的调节作用。     

铁皮石斛2个P型H~+-ATPase基因的克隆、表达及生物信息学分析

利用RACE进行铁皮石斛质膜PMA(plasma membrane H~+-ATPase)基因的全长克隆,采用生物信息学方法、DNASTAR 7.0和MEGA 7.0对其编码蛋白结构、序列和分子进化等进行分析,并借助实时荧光定量PCR技术检测基因表达模式。结果表明,从铁皮石斛叶片cDNA中分离到2个P型H~+-ATPase基因 DoPMA1和 DoPMA2(GenBank注册号KU160470和KU160471),各编码1条由973和951个氨基酸组成的肽链;2个基因编码蛋白均含有2个保守的P型ATPase结构域和5个H~+运输ATPase结合位点,不含信号肽,定位在质膜。2个蛋白与植物H~+-ATPases蛋白相似性大于72%,聚在拟南芥、水稻等植物H~+-ATPase分子进化树的Ⅴ和Ⅱ分支。实时荧光定量PCR分析表明, DoPMA1在根和茎中上调,分别为叶中的2.98、1.95倍, DoPMA2在根与叶中表达无显著差异,茎中下调为叶中的0.86倍。研究结果为进一步揭示 DoPMA1和 DoPMA2分子作用奠定基础。     

玉木耳络氨酸酶基因的克隆及表达分析

克隆获得了玉木耳络氨酸酶基因的全长cDNA序列,命名为Actyr。序列分析结果表明:其cDNA序列为1113 bp,编码371个氨基酸;相对分子量为41.11 kDa,等电点为7.64。亚细胞定位分析发现其定位于细胞质。qRT-PCR分析结果表明:Actyr基因的表达量在菌丝生长时期最低;随着玉木耳的生长发育,其表达量不断上升;到子实体直径为3 cm时,Actyr基因的表达量达到最高。     

普通小麦中国春Chi基因的克隆、染色体定位及原核表达

利用ChiF/ChiR引物组合在普通小麦品种中国春中扩增几丁质酶基因,并对其序列进行分析,然后利用中国春缺四体材料对不同的几丁质酶基因进行染色体定位,并对定位成功的亚基进行原核表达以及诱导纯化,最后通过进化树分析小麦几丁质酶与其他物种几丁质酶之间的进化关系。结果表明,从中国春中分离出的30个几丁质酶基因可以划分为出6类,分别命名为Chi-1、Chi-2、Chi-3、Chi-4、Chi-5和Chi-6,登录号分别为KJ507385、KJ507386、KJ507387、KJ507388、KJ507389和KJ507390,它们都属于ClassⅠ几丁质酶。Chi-1、Chi-2、Chi-3、Chi-4和Chi-6分别定位在小麦的3A、2B、5B、1A和3D染色体,Chi-5定位失败。Chi-1、Chi-2、Chi-3、Chi-4和Chi-6的原核表达和纯化体系成功建立,最后发现小麦ClassⅠ型几丁质酶与水稻和大麦的ClassⅠ型几丁质酶进化关系更近,而与拟南芥的关系最远。总体来看,通过对小麦几丁质酶的克隆、序列分析、染色体定位、原核表达体系的建立以及进化分析,可知,小麦几丁质酶包括很多种不同的亚型,而且它们分布在不同的染色体上,同时它们与水稻和大麦的进化关系最近。     

普通烟草IRL基因反义植物表达载体的构建

异黄酮还原酶相似蛋白(IRL)是与异黄酮还原酶具有高度序列同源一致性而功能不同的一类蛋白.通过PCR扩增普通烟草(Nicotiama tabacum)品种龙里红花烟IRL基因的一段特异保守片段NtIRLA,并将其亚克隆到中间载体pCAMBIA2301G中,构建了IRL反义植物表达载体pCAMBIA2301G-IRLA.通过PCR鉴定、酶切鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌株,为进一步利用转基因手段明确IRL基因在烟草次生代谢中的功能奠定了基础.     

玉木耳络氨酸酶基因的克隆及表达分析

克隆获得了玉木耳络氨酸酶基因的全长cDNA序列,命名为Actyr.序列分析结果表明:其cDNA序列为1113 bp,编码371个氨基酸;相对分子量为41.11 kDa,等电点为7.64.亚细胞定位分析发现其定位于细胞质.qRT-PCR分析结果表明:Actyr基因的表达量在菌丝生长时期最低;随着玉木耳的生长发育,其表达量...     

普通小麦及其近缘种NCED基因的克隆及表达分析

利用已知的大麦NCED基因(dbj|BAF02837.1)保守区域设计引物,在野生一粒小麦、硬粒小麦、野生二粒小麦、普通小麦和粗山羊草中分别扩增出长度为782、782、782、7837、83 bp的目的片断,生物信息学分析结果表明,均含有一个开放阅读框,编码242个氨基酸残基组成的蛋白,具有典型的9-顺式-新黄素加双氧酶蛋白的结构域。同源性比对结果表明,普通小麦与大麦的NCED序列具有高度同源性(97%);普通小麦及其近缘种在该区内NCED基因片段的同源性在95%以上。半定量RT-PCR表达分析表明,NCED基因参与了普通小麦及其近缘种对非生物胁迫高渗、高盐的应答反应,但在不同物种或胁迫处理下的表达模式不同,其中粗山羊草和普通小麦在高渗和高盐胁迫下分别表现出了较快的应答反应。     

鲤RNF2基因的克隆、组织表达与生物信息学分析

以鲤肾脏组织RNA为模板,扩增并克隆鲤环指蛋白2(RING Finger Protein 2,RNF2)基因的CDS区全长,分析其组织表达谱.结果显示,鲤RNF2基因的CDS区序列长1011 bp,编码336个氨基酸;该基因与鲫、斑马鱼、金头鲷、海洋青鳉鱼、鳕鱼、非洲爪蟾、尖尾娇鹟、小鼠、智人的同源性分别为98.2％、...     

茄子抗逆相关基因SmDREB3的克隆和表达分析

DREB(dehydration responsive element binding protein)基因在植物非生物胁迫的应激反应中具有非常重要的作用,本研究运用同源克隆的方法从‘YZ-14’紫茄品种中分离克隆得到了一个DREB基因,因其与番茄和马铃薯中DREB3基因的相似度很高,所以命名为SmDREB3。SmDREB3基因的cDNA全长为887bp,开放阅读框(ORF)长度为777bp,可以编码一个含有259个氨基酸的蛋白,与同科作物马铃薯中DREB基因序列的相似性高达90%,与番茄中DREB基因序列的相似性也能达到88%。成熟蛋白等电点为6.39,分子量为28.665kDa。RT-qPCR实验结果表明,SmDREB基因在紫茄的各个组织中都会表达,但表达水平具有组织特异性,其在果皮中的表达量最高,其次为叶和果肉,而在根、花和茎中的表达量相对较低。本研究为深入研究茄子的抗逆机制以及培育抗逆茄子新品种方面提供了理论基础。