大肠杆菌O157：H7荧光纳米颗粒试纸条的研制

建立大肠杆菌O157：H7荧光纳米颗粒免疫层析法。方法：首先将荧光纳米颗粒与大肠杆菌O157：H7单抗共价偶联,制成大肠杆菌O157：H7单抗-荧光纳米颗粒偶联物。用该偶联物代替金标颗粒,以双抗体夹心作为反应模式来制备大肠杆菌O157：H7免疫层析试纸条。在紫外灯下观察免疫层析试纸条上经免疫反应而产生的质控线和检测线上的荧光信号,并利用荧光强度来半定量检测大肠杆菌O157：H7。结果：用所制备的试纸条对11属24种54株菌进行检测,所有27株大肠杆菌O157：H7的检测结果呈阳性．其它非大肠杆菌O157菌株检测结果呈阴性。用该试纸条检测人工污染的鸡肉样品。灵敏度为2．7×10^4CFU／mL。通过观察检测线的有无。可对大肠杆菌O157：H7进行半定量检测。分别用所制备的大肠杆菌O157：H7免疫层析试纸条和标准法检测57份样品,2种方法的总符合率为80．7％。结论：大肠杆菌O157：H7荧光纳米颗粒检测试纸条的研制成功,为大肠杆菌O157：H7的快速检测提供了一个极好的检测方法．便于野外检测的开展．具有广阔的应用前景。     

遗传标志性基因Z0372 PCR检测肠出血大肠杆菌O157:H7

肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157:H7是重要的食源性病原菌,导致严重的人兽共患病。本文旨在建立以Z0372基因为靶基因的PCR检测技术,特异性检测EHEC O157:H7。以Z0372基因为靶序列,设计引物,建立Z0372-PCR,分析敏感性、特异性,并检测模拟阳性污染样品。结果表明,Z0372-PCR对纯培养物检测限103~104CFU/m L,模拟阳性污水样和肉样,增菌后检测限10~102CFU/m L(g)。非大肠杆菌O157和其他肠道病原全部为阴性扩增,只有肠出血性大肠杆菌O157:H7扩增出清晰而特异的条带。模拟阳性样品检测,条带特异,无任何杂带,测序与Gen Bank序列高度同源。因此,Z0372-PCR是特异性检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的技术,操作简便,成本低廉,适合实验室肠道内容物、刮取物、污水和食品等的快速检测。     

火焰南天竹组培快繁体系的探讨

以观赏灌木火焰南天竹幼嫩茎尖为研究对象,研究不同灭菌时间对成活率及污染率的影响,以及不同培养基和激素浓度对不定芽诱导、增殖和生根的影响。试验表明,在无菌环境下,用70%酒精消毒5 s,再用10%NaClO灭菌12 min的灭菌效果最佳;最佳诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1+IBA 0.1 mg·L^-1+AC 1.0 g·L^-1,最高诱导率为87%;最佳增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1+IAA 0.1 mg·L^-1L +AC 1.0 g·L^-1,增殖系数最高可达5.29;最佳生根培养基为1/2 MS+IBA 0.5 mg·L^-1 +AC 4.0 mg·L^-1,生根率最高可达98%。将火焰南天竹组培苗移入泥炭土∶蛭石∶珍珠岩为8∶1∶1的混合基质中成活率较高,最高可达94%,且组培苗长势良好。     

灌溉水源中沙门氏菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立基于SYBR Green I嵌合染料法的灌溉水源中沙门氏菌实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, q PCR)检测方法。【方法】以沙门氏菌侵袭蛋白A (inv A)基因为靶基因，设计1对特异性q PCR检测引物，在对q PCR反应体系和反应条件进行优化后，通过特异性实验和灵敏度实验对q PCR方法进行验证，并制作灌溉水源中沙门氏菌q PCR定量标准曲线，最后与国标方法对比检测灌溉水源中沙门氏菌污染来验证该方法的准确性。【结果】经过优化的q PCR检测方法灵敏度检测结果显示最低检测限量为1×10^-1 pg·μL^-1，特异性检测结果显示具有良好的特异性，干扰菌株对本q PCR检测方法无影响，所制作的q PCR扩增标准曲线在2×10⁰～2×10⁵ cfu·m L^-1有较好的线性关系，相关系数为0.999 6，能对沙门氏菌进行准确的定量分析。该方法在与国标方法对比检测灌溉水源中沙门氏菌污染时具有同等准确性。【结论】本研究建立的基于SYBR...     

兰州百合组培快繁体系的构建

以兰州百合新鲜鳞茎为外植体,选择MS和1/2 MS培养基为基本培养基,采用正交设计研究不同消毒剂组合对外植体存活率、不同植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导率和发芽率的影响;并用响应面法优化不同激素组合对生根率的影响。结果表明:(1)最佳消毒剂组合为75%乙醇消毒20 s+2%次氯酸钠溶液浸泡10 min,外植体成活率可达96.30%。(2)愈伤组织诱导最佳培养基配方为MS+0.3 mg·L^-1 NAA+3 mg·L^-1 6-BA,诱导率可达96.33%。(3)促进发芽的最佳培养基配方为MS+0.3 mg·L^-1 NAA+3 mg·L^-1 6-BA,发芽率可达98.00%。(4)促进生根的最佳培养基配方为1/2 MS+0.5 mg·L^-1 NAA+3 mg·L^-1 6-BA+2 mg·L^-1活性炭,生根率可达94.00%。本研究建立的组培快繁体系可用于兰州百合的快速大量繁殖,可为兰州百合组培苗的工厂化生产提供参考。     

跨膜蛋白39A基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价

为建立一种快速检测跨膜蛋白39A(TMEM39A)基因的方法,根据GenBank中登录的不同种属TMEM39A基因序列的保守区域,设计并合成1对荧光定量通用性引物,经过条件优化,建立了检测TMEM39A基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果显示:标准品模板在3.937×10⁸~3.937×10³拷贝·μL^-1范围内呈良好的线性关系,R²可达0.999;该方法特异性较好,检测灵敏度可达3.937×10² 拷贝·μL^-1;组内和组间变异系数均小于1%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法能够检测出不同细胞中的TMEM39A含量,具有种属通用性。该研究方法的建立为临床上提供了一种TMEM39A的快速检测和定量分析技术。     

小麦赤霉病生防菌DZSG23的抗病机制

课题组前期从健康杜仲叶片中分离得到1株内生细菌枯草芽孢杆菌DZSG23,此菌可以较好地防控小麦赤霉病。为明确芽孢杆菌DZSG23在小麦中的定殖与强化抗病机制研究,利用抗生素标记法分析了DZSG23菌体在小麦组织中的定殖情况,采用荧光定量PCR技术检测不同生育期小麦穗部PR-1、AOS、ACOI等基因的表达水平变化。结果表明,DZSG23可在苗期小麦植株和小麦穗表面稳定定殖;DZSG23浇灌接种苗期小麦后的第34天,DZSG23在苗期小麦植株的根、茎和叶中的定殖量分别达到1.437×10⁶ CFU·g^-1、3.285×10³ CFU·g^-1和2.377×10³ CFU·g^-1;DZSG23喷施小麦穗表面15 d后,穗表面菌群密度仍可达7.146×10³ CFU·g^-1。此外,诱导系统抗性(ISR)信号通路研究表明,拮抗菌DZSG23可以诱导PR-1和AOS基因的上调表达,表明拮抗菌DZSG23引入小麦后可诱导小麦的...     

环介导等温扩增技术快速检测鲜切蔬菜中的大肠杆菌

为鲜切蔬菜快速检测的市场化应用提供理论基础,利用大肠杆菌的特异性基因rfbE基因设计LAMP引物,通过对10株菌株进行特异性检测,建立利用环介导等温扩增技术检测鲜切蔬菜中的大肠杆菌O157∶H7的方法,并进行验证检测。结果表明:检测鲜切蔬菜样品特异性为93.3%,准确度为96.5%,检测大肠杆菌灵敏度达1.69CFU/mL。建立的快速检测方法可满足市场化应用的需要。     

多肉植物红宝石组织培养快繁技术

为建立多肉植物红宝石高效组织培养快繁技术体系,为工厂化生产提供技术保障。以多肉植物红宝石的幼嫩叶片作为外植体,进行多肉植物红宝石组培快繁技术研究。结果表明:采用75%酒精浸泡60s,再使用0.1%升汞处理10min是红宝石外植体最佳消毒处理方法。红宝石愈伤组织诱导的最适培养基为MS+6-BA 1.5mg·L^-1+NAA 0.5mg·L^-1(pH=6.0),诱导率可达83.3%;愈伤组织分化成芽的最适培养基为MS+6-BA 0.6mg·L^-1+NAA 0.2mg·L^-1(pH=6.0),分化率可达77.78%;生根最适培养基为1/2MS+活性炭2.0g·L^-1(pH=6.0),生根率可达70.00%。     

枯草芽孢杆菌HS-09产芽孢发酵培养基的优化

枯草芽孢杆菌HS-09具备较好益生菌性能,已作为微生态菌剂应用于水产养殖业。为了提高菌株HS-09产芽孢发酵水平,以芽孢产量为指标,通过单因素试验及正交试验对枯草芽孢杆菌HS-09产芽孢发酵培养基的碳源、氮源进行筛选及优化,确定最佳发酵培养基。结果表明:影响枯草芽孢杆菌HS-09芽孢产量的主次因素为玉米粉>硫酸铵>葡萄糖。枯草芽孢杆菌HS-09产芽孢发酵优化培养基为葡萄糖10g·L^-1、硫酸铵8g·L^-1、玉米粉15g·L^-1、硫酸镁0.5g·L^-1、硫酸锰0.5g·L^-1、磷酸氢二钾1g·L^-1、磷酸二氢钾2g·L^-1、碳酸钙3g·L^-1;以最佳产孢发酵培养基进行200L发酵罐放大发酵,发酵有效菌落数可达4.3×109cfu·mL^-1,实现芽孢90%高转化率。该研究结果可为菌株工业化生产提供参考依据。     

手参愈伤组织培养及植株再生

以手参为对象,研究了外植体和植物生长调节剂对愈伤组织诱导,以及植物生长调节剂对不定芽分化及生根的影响,初步建立了其组织培养再生体系。结果表明,以茎尖外植体愈伤组织诱导率最高,在MS附加0.5 mg·L^-1 NAA的培养基上,诱导率可达60%;愈伤组织在MS附加0.1 mg·L^-1 NAA培养基上增殖效果较好;不定芽分化诱导以MS附加0.1 mg·L^-1 TDZ最高,可达53.3%,在MS附加0.1 mg·L^-1 TDZ和0.1 mg·L^-1 NAA的培养基更适合芽的增殖和生长;生根诱导以1/2MS培养基附加0.5 mg·L^-1的NAA的诱导率最高,可达30.6%。     

SSEL结合多重PCR同时快速检测生菜中4种食源性致病菌

为实现生菜中肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和单增李斯菌的同时快速检测,将前期开发的SSEL增菌技术与多重PCR联用,对SSEL的增菌性能、SSEL增菌液的处理方式、多重PCR的灵敏度和特异性进行了分析。结果表明:生菜样品经SSEL增菌24 h后,4种目的菌含量均可达10~5 CFU/mL;以SSEL增菌液及其DNA提取物为模板的多重PCR均能检测出生菜中的4种目的菌,灵敏度分别为10~5 CFU/mL和10~2 ng/μL;SSEL结合多重PCR对测试菌株的特异性达100%。     

葡萄柚精油协同紫外线灭活果蔬表面诺如病毒和大肠杆菌的研究

【目的】果蔬中大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)和诺如病毒(norovirus)常导致食源性疾病暴发。紫外照射(UV-C)是灭活病原微生物的常用手段,但由于果蔬表面的特殊构造,UV-C对微生物的灭活效果受到一定的限制,同时也影响食品的颜色、质地和组织稳定性。葡萄柚精油(GEO)具有较强的抗菌和抗病毒活性且使用安全,但单独使用成本太高。试验旨在探究GEO协同UV-C作用对果蔬表面病原微生物的灭活效果,为提升食源性疾病暴发的防控技术提供科学依据。【方法】使用特定浓度的大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)(6.07×10⁸ CFU/mL),鼠诺如病毒(MNV-1)(5.29×10⁵ PFU/mL)和杜兰病毒(TV)(5.67×10⁵ PFU/mL)在无菌环境下人工污染樱桃番茄、生菜和蓝莓表面,利用不同质量浓度GEO(1.0,4.0,8.0,16.0,32.0,64.0 mg/mL)和不同照射剂量UV-C(20,40,60,80,100,200 mJ/...     

基于磁性纳米探针的莠去津残留荧光检测方法

[目的]本文旨在构建磁性纳米探针并将其应用于莠去津残留的荧光检测。[方法]通过共沉淀法合成磁性纳米材料;合成莠去津适配体及荧光素标记DNA单链形成的非完全互补DNA双链,并将其修饰于磁性材料之上,构建特异性检测莠去津残留的功能化荧光磁性探针;利用紫外、透射电镜等技术对探针进行表征分析;利用凝胶电泳技术,分析目标物莠去津与探针负载的适配体特异性结合后,释放荧光素标记DNA单链、解除材料对荧光淬灭从而恢复荧光的机制;运用荧光光谱技术,构建基于荧光信号强度变化的莠去津残留灵敏定量方法。[结果]本研究开发的荧光检测莠去津残留方法在0.01～20μg·mL^-1具有良好的线性关系,相关系数(R²)可达0.998,检测限为8.17μg·L^-1,相比于其他农药,探针对莠去津具有较高的特异选择性及抗离子干扰能力。在稻田水添加浓度范围中,莠去津的平均添加回收率为95.48%～102.03%,相对标准偏差(RSD)为2.17%～3.14%;稻田土中莠去津的加标回收率为94.79%～100.66%,RSD为3.40%～4.72%。[结论]本研究...     

重组大肠杆菌全细胞催化合成四氢嘧啶

四氢嘧啶是天冬氨酸的环状氨基酸衍生物,广泛应用于化妆品、食品、药品等领域。通过比较了5个不同来源的四氢嘧啶合成基因簇ectABC,发现从专性嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus OF4)来源的基因簇整合到大肠杆菌BW25113中后,得到的重组菌pYB1s-BPectABC/BW25113产四氢嘧啶能力最好。利用单因素试验初步优化了pYB1s-BPectABC/BW25113全细胞催化条件:以100 mmol·L^-1天冬氨酸钠和100 mmol·L^-1甘油为底物,在100mmol·L^-1 KCl的转化液(pH=7.0)中,30℃下反应24h,最终四氢嘧啶的产量可达3.10g·L^-1,转化产率达到0.129g·L^-1·h^-1。本研究初步得到了四氢嘧啶合成重组菌pYB1sBPectABC/BW25113,为后续四氢嘧啶的研究奠定了基础。     

石豆兰杂交种无菌播种技术研究

为建立石豆兰杂交种无菌播种快速繁殖体系,以‘Bulbophyllum pingtungense’为父本、‘Bulbophyllum fascinator var.corazonae’为母本进行种间杂交,取其F1代成熟种子作为试验材料,通过无菌播种技术对石豆兰杂交种子萌发、增殖、生根等问题进行研究。结果表明：最适于石豆兰杂交种子萌发的培养基为1/2MS+土豆汁100 g·L^-1+活性炭1 g·L^-1;芽增殖最适宜的培养基为MS+6-BA1.0 mg·L^-1+NAA0.5 mg·L^-1+活性炭1 g·L^-1,平均出芽数可达9.2个;壮苗生根的最佳培养基为1/2MS+NAA0.5 mg·L^-1+IBA1.0 mg·L^-1+活性炭1 g·L^-1+土豆汁100 g·L^-1,生根率可达100%,平均根数为3.88条,平均株高达4.18 cm。综上,初步建立的石豆兰杂交种快速繁殖体系,可为石豆兰杂交种的种...     

糖蜜对人工培养银叶真藓生长发育的影响

为促进藓结皮人工扩繁,以世界广布种银叶真藓(Bryum argenteum)为对象,通过室内试验研究了不同浓度(3、6、10、20g·L^-1和30g·L^-1)糖蜜溶液对银叶真藓生长发育的影响。结果表明,添加糖蜜溶液会降低银叶真藓萌发数量,其中添加10g·L^-1和20g·L^-1糖蜜溶液时银叶真藓萌发数量与对照组差异显著,分别为对照组的38%和29%。添加糖蜜溶液会影响银叶真藓生长速率,其中添加3g·L^-1糖蜜溶液可显著增加银叶真藓生长速率,盖度每周可增加11.56%,密度每周可增加6.67株·cm^-2,而添加30g·L^-1糖蜜溶液时银叶真藓生长速率显著低于对照组。添加10、20g·L^-1和30g·L^-1糖蜜溶液能在培养末期维持银叶真藓的盖度和密度,而添加3g·L^-1和6g·L^-1糖蜜溶液在培养末期时密度会下降,降幅分别为最大密度的19%和15%。培养初期使用3g·L^-1糖蜜溶液而培养末期增大浓度到10g·L^-1,可显著增加银叶真藓的盖度、密度,在培养末期可维持72.83%的盖度和41.25株·cm^-2的密度。糖蜜溶液作为葡萄糖的替代物能促进银叶真藓的生长发育,在大面积培养人工藓结皮时可推广使用。     

以亚甲基蓝为杂交指示剂的电化学适配体鼠伤寒沙门氏菌传感技术

【目的】构建一种更具实用性的可定量检测鼠伤寒沙门氏菌的新型电化学适配体传感器,克服传统沙门氏菌检测方法在时效性、灵敏度和操作简便性等方面的不足。【方法】将反应制得的氧化石墨烯（GO）滴涂在玻碳电极（GCE）表面,于PBS缓冲液中采用电化学还原法将其还原为还原氧化石墨烯（rGO）,随后放置电极于氯金酸溶液中进行电沉积,于表面修饰一层纳米金（AuNPs）。依靠金硫键的作用将鼠伤寒沙门氏菌适配体互补链（S）固定在电极上,滴加封闭剂巯基己醇（MCH）占据电极表面空余位点,保证电极无非特异性吸附后,再将鼠伤寒沙门氏菌适配体（Apt）滴涂于电极表面,使S与Apt杂交形成DNA双链结构。将电极于37℃下同鼠伤寒沙门氏菌与核酸外切酶I（Exo I）的混合液孵育,依靠鼠伤寒沙门氏菌与Apt高度特异性结合,将Apt从电极表面带离,再基于Exo I对单链DNA的剪切作用,使鼠伤寒沙门氏菌得以循环重复作用于适配体,再将电极浸入亚甲基蓝（MB）溶液一段时间后,通过监测电极表面的电信号,并对其在菌液中的孵育时间及Exo I的浓度进行优化,构建检测鼠伤寒沙门氏菌的新型电化学适配体传感器。使用构建的传感器对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、单增李斯特菌以及副溶血弧菌进行检测,以确定该传感器的特异性;对2×10²-2×10⁷ cfu/mL的鼠伤寒沙门氏菌进行检测,以确定该传感器的敏感性;对猪肉样品进行鼠伤寒沙门氏菌的定量检测,以确定该传感器的实用性。【结果】所构建的鼠伤寒沙门氏菌电化学适配体传感器在菌液中的最适孵育时间为40 min,Exo I的最适浓度为0.8 U·µL^-1。特异性试验结果表明,该传感器仅在鼠伤寒沙门氏菌存在时有电信号响应,而对非目标菌无响应。敏感性试验结果表明,该传感器具有很高的敏感性,对鼠伤寒沙门氏菌的敏感性可达67 cfu/mL。使用构建的鼠伤寒沙门氏菌电化学适配体传感器对猪肉中的鼠伤寒沙门氏菌进行定量检测,加标回收率在97.3%-106.7%。【结论】所构建的新型鼠伤寒沙门氏菌电化学适配体传感器具备灵敏度高、特异性强、易于操作、检测迅速及成本低廉等优点,有望应用于食品工业中鼠伤寒沙门氏菌的现场快速定量检测。     

贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4发酵培养基和发酵条件优化

【目的】贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4对许多病原菌具有较强的抑制作用,为提高其生防作用,开展FJ17-4发酵技术研究。【方法】以发酵液的OD₆₀₀值为评估指标,采用单因素和正交试验方法对发酵培养基和发酵条件进行筛选和优化,获得最佳发酵培养基和发酵条件后,进一步对优化后发酵液的菌体数、病原菌抑制率和室内盆栽防治效果进行测定和分析。【结果】菌株FJ17-4的最佳培养基配方为黄豆粉12.5 g·L^-1、玉米粉5.0 g·L^-1、K₂HPO₄ 12.5g·L^-1,最佳发酵条件为：初始pH 7.0,培养温度30℃,装液量20%(50 mL/250 mL),接种量12.5%,转速180r·min^-1,发酵培养时间40 h。优化后发酵液的OD₆₀₀值和菌体数量分别为1.52×10¹⁰、1.03×10¹⁰ cfu·mL^-1,比优化前分别提高了25.62%和21.95%...     

高知芽孢杆菌Cytobacillus kochii H产蛋白酶条件优化及抑菌效应

【目的】对筛选到具有抑菌效果且产蛋白酶的菌株H进行分类地位的确定，同时对其产蛋白酶的条件进行优化，以期为其在植物病害防治上的应用奠定基础。【方法】通过生理生化、电子显微镜扫描及16sRNA测序相结合的方法明确菌株H的分类地位；通过单因素和正交试验对菌株H产蛋白酶条件进行优化，并检测其优化前后对病原真菌的抑菌效果。【结果】菌株H鉴定为高知芽孢杆菌(Cytobacillus kochii)；菌株H产蛋白酶的优化条件为：pH8.0、葡萄糖20.0 g·L^-1、蛋白胨8.0 g·L^-1、MgSO4 1.0 g·L^-1、CaSO4·2H2O 0.1 g·L^-1，在装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中接种2.5 mL108 CFU·mL^-1的种子液，培养24 h后蛋白酶活力达到402.2 U·mL^-1，较初始培养条件下的蛋白酶活力提高13.92倍；优化后菌株H对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和辣椒疫霉病菌(Phytophthora cap...