一种囊状幼虫病毒分子标记的克隆

蜜蜂囊状幼虫病是由囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)侵染蜜蜂幼虫而导致的一种致死性病毒病。本研究根据Gene Bank上SBV多个毒株的基因组信息设计合成一对特异性引物,从出现囊状幼虫病典型症状的中蜂幼虫中扩增出一个大小约为106 bp的特异性SBV106片段,进而将其克隆进p GEM-T载体,经蓝白斑筛选出阳性质粒,Eco RⅠ酶切可得约106 bp大小的目的片段,阳性质粒原菌液测序结果显示该片段与SBV全序列(收录号:AF092924)的相似度达100%,证明该序列为SBV特有序列。上述结果表明SBV106片段可作为检测蜜蜂囊状幼虫病的分子标记,应用于养蜂生产。     

仔猪先天性震颤瘟病毒RT-PCR检测方法的建立

旨在建立检测仔猪先天性震颤瘟病毒(APPV)的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法。根据GenBank上登录的APPV基因组序列,设计1对引物,以临床上表现典型震颤仔猪的淋巴结为材料,提取RNA,建立了RT-PCR方法,并进行敏感性、重复性和特异性试验,对其扩增产物测序比对分析;利用该方法,对临床病料进行检测。结果显示,从典型震颤仔猪的淋巴结中均扩增到与预期大小有一致的片段,经测序比对,扩增片段序列与APPV相应片段的核苷酸同源性在89%以上;该方法只能扩增出APPV片段,而其他几种常见猪病毒均为阴性,3次重复检测结果基本一致,可检测最低cDNA浓度为184.11ng/μL;对临床病料检测,典型病例的检出率达100%。试验结果表明,建立的RT-PCR方法具有良好的特异性、重复性、敏感性等优点,可用于临床APPV引起的仔猪先天性震颤早期检测、病毒鉴定和分子流行病学调查。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank上发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,针对TGEVN基因全序列设计合成了一对引物,以TGEV疫苗株为模板,建立了检测TGEV的RT-PCR方法。应用该方法对TGEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1168bp的特异性目的片段;测序结果与已报道的TGEV不同毒株的序列同源性达到95%～97%;敏感性测定该RT-PCR可扩增到18pg的TGEV-N-cDNA;对猪传染性胃肠炎(TGE)的病料进行RT-PCR鉴定,可检测出TGEVN基因片段。结果表明建立的RT-PCR方法对TGEV的检测敏感性高、特异性强,可用于TGEV感染的诊断和流行病学调查。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,针对TGEV N基因全序列设计合成了一对引物,以TGEV疫苗株为模板,建立了检测TGEV的RT-PCR方法.应用该方法对TGEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1 168 bp的特异性目的片段;测序结果与已报道的TGEV不同毒株序列的同源性为95%～97%;敏感性测定结果为可扩增到18 pg的TGEV N基因cDNA.结果表明,建立的RT-PCR方法对TGEV的检测敏感性高、特异性强,可用于TGEV感染的诊断和流行病学调查.     

蜜蜂囊状幼虫病RNA依赖的RNA聚合酶部分基因的克隆和序列分析

蜜蜂的囊状幼虫病是中华蜜蜂常见且危害严重的疾病,病原为一小正链RNA病毒。本试验通过囊状幼虫病的部分基因的克隆及序列分析,发现该序列与广东的囊状幼虫病毒有较高的同源性,但也存在着个别的碱基差异,可能是一种新型的变异囊状幼虫病毒。     

山羊痘病毒反向末端重复序列的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向末端重复序列片段,将其克隆至pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-ITR,再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组菌进行序列测定,并将所得序列与GenBank收录的2株山羊痘病毒、3株绵羊痘病毒全基因序列进行比较分析。结果:所测4个毒株序列与GenBank上收录的山羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为100%,与绵羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为98.3%。研究结果表明,山羊痘病毒反向末端重复序列与已收录的羊痘毒株之间该片段的同源性非常高,为今后兽医临床上应用PCR方法检测羊痘病毒提供了另一更为特异、保守的基因片段。     

山羊痘病毒PCR/酶切检测方法的建立

为了建立一种快速的山羊痘检测方法,根据山羊痘病毒基因组保守区T3A/T3C基因设计了1对引物,以山羊痘病毒DNA为模板进行PCR扩增并连接到pMD18-T载体进行序列测定,测序结果显示片段长491 bp,与已报道的山羊痘病毒对应序列进行比对,同源性高达98%。特异性和灵敏性试验及PCR产物的酶切位点分析表明,该引物特异性好,敏感性强。本研究建立的山羊痘病毒PCR/酶切检测方法可应用于山羊痘病毒感染的临床诊断。     

山羊痘病毒ITR基因片段的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y和B株ITR基因片段,插入pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组载体经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上8株羊痘病毒相应序列进行同源性分析。结果经PCR扩增,4株病毒均可得到一条均一的DNA片段,该片段可被内切酶AluⅠ特异酶切,而且该PCR的DNA模板最小检出量为24.40pg。经测序,该基因片段长度为289bp;序列比较发现,4株病毒ITR片段与GenBank上2株山羊痘病毒的核苷酸与氨基酸序列同源性均为100%,与3株绵羊痘病毒分别为98.2%和96.5%,与3株牛疙瘩皮肤病病毒为98.2%～99.3%和96.5%～97.7%。这表明ITR基因片段在羊痘病毒属中较为保守,可以针对ITR基因建立羊痘病毒的PCR检测方法。     

中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测方法研究进展

中蜂囊状幼虫病是一种由中蜂囊状幼虫病毒引起的严重威胁中蜂健康的传染性疾病.目前由于该病尚无有效的药物治疗方式,因此,预防与及时检测对于遏制该病传播显得尤为重要.本文主要从临床诊断、分子生物学和免疫学方面总结中蜂囊状幼虫病检测与鉴定的方法,包括形态诊断、RT-PCR技术、实时荧光定量PCR、巢式PCR、胶体金免疫快速诊断...     

口蹄疫病毒灭活疫苗中VP1基因RNA抽提方法的建立

本试验提取疫苗种毒、BEI灭活病毒和白油乳化灭活疫苗病毒中的RNA,并就VP1基因进行了RT-PCR扩增、核酸序列测定和序列比对分析。结果显示,3种来源的VP1基因片段长度均为813 bp,与预期的目标相符,核苷酸序列显示3种方法处理的病毒VP1同源性为100%。说明灭活剂BEI和乳化工艺没有全部破坏口蹄疫病毒VP1基因核酸,为检测疫苗毒株的核酸序列建立了一种方法。     

蜜蜂囊状幼虫病RT-PCR快速检测方法的初步应用

蜜蜂的囊状幼虫病是中华蜜蜂常见且为害严重的疾病,病原为小正链RNA病毒。实验通过RT-PCR的方法检测出了该病毒,经序列测定发现与广东的蜜蜂囊状幼虫病毒基因序列有所差别,推测可能是由于地区和蜜蜂种类差异导致的。     

陕北中蜂囊状幼虫病抗病品系的选育

中华蜜蜂,简称中蜂。是我国独有的蜂种,囊状幼虫病是目前危害中华蜜蜂最主要的病害。试验以囊状幼虫病流行后自愈的蜂群为基础选育素材,采用人为感染、逐级淘汰、闭锁繁育、固定有益基因的育种手段,进行中蜂囊状幼虫病抗病品系的选育,大大地提高了其抵抗囊状幼虫病的性能。     

蜜蜂囊状幼虫病研究进展

蜜蜂囊状幼虫病对中蜂危害极大,近年该病危害日趋严重。对蜜蜂囊状幼虫病的病原学、流行病学、诊断方法和防治措施,蜜蜂对囊状幼虫病的防御机制等进行论述。     

梯度条带PCR快速检测CSBV方法的建立

通过与传统RT-PCR检测方法比较,建立了一种新的快速、准确鉴定中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)的方法,为中华蜜蜂囊状幼虫病的诊断与防治提供了重要的手段。对陕南、陕北、关中三地的健康蜂及CSBV感染蜂分别进行传统RT-PCR和梯度条带PCR两种方法的检测,通过琼脂糖凝胶电泳及测序结果对两种方法进行分析比较。结果发现传统RT-PCR和梯度条带PCR方法对陕西三地的感染病毒蜂鉴定结果一致,而梯度条带PCR方法相对更快速和直观。与传统RT-PCR鉴定方法比较,该新方法能够在电泳检测阶段通过DNA片段的梯度次序即确定是否存在病毒,能够省去PCR产物测序步骤,缩短了对该病毒的鉴定周期,对及时发现和鉴定病蜂、采取预防措施提供了重要的技术手段。因此,梯度条带PCR快速鉴定方法不仅为CSBV的检测提供了一种简单、快速、直观的方法,对类似动物病毒的快速鉴定也提供了很好的借鉴。     

四川省东方蜜蜂病毒病感染状况调查

为了解四川省东方蜜蜂主要病毒病:蜜蜂黑王台病毒(BQCV)、畸翅病毒(DWV)、囊状幼虫病毒(SBV)、克什米尔蜜蜂病毒(KBV)、急性蜜蜂麻痹病毒(ABPV)和慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)的感染状况。采用RT-PCR方法对来自四川省9个地区共270份东方蜜蜂样品进行快速病原学检测。调查结果显示:四川省东方蜜蜂群中有5种病毒的感染;其中,BQCV总阳性率为17.8%,KBV总阳性率为3.0%,SBV总阳性率为1.1%,ABPV总阳性率为1.9%,CBPV总阳性率为2.2%。在被调查的9个地区中,有7个地区蜂群存在至少1种以上病毒病感染的现状,表明四川省东方蜜蜂群疾病感染状况较为严重,其对养蜂业可持续发展的潜在危险需要给予充分关注。     

中蜂囊状幼虫病毒多克隆抗体的制备

利用中蜂囊状幼虫病毒（CSBV）灭活疫苗作为抗原制备兔多克隆抗体。利用RT- PCR方法对疑似感染CSBV的中蜂样品进行检测,检测阳性后,经差速离心法纯化CSBV,并用BCA方法检测病毒浓度,将病毒浓度稀释至0.25 mg/mL。按稀释后的CSBV体积的0.3%加入甲醛灭活进行灭活,制备CSBV油乳剂灭活苗,经无菌、安全性和稳定性检验合格后,对新西兰大白兔进行3次免疫,每次间隔2周,对其产生的多克隆抗体进行了SDS- PAGE分析和效价检测,结果表明制备的兔多克隆抗体效价OD值最高可达到1.109。实现了中蜂囊状幼虫病毒高效价多克隆抗体的制备,为深入研究CSBV和综合防治奠定了基础。     

长白山区西部中囊病消长规律及时间隔离等防治方法的研究

对近几年传入长白山区西部的中蜂囊状幼虫病消长规律进行了研究,不仅对抗病中蜂和营养杂交中蜂进行了试验观察,而且在试验和调查过程中发现中囊病在长白山区西部传播的链条上有一个可以切断的薄弱环节:在中囊病区内,病蜂病虫断绝,病毒消亡1a左右的地方试养中蜂,不发生中囊病。在此基础上进一步提出了在当地条件下利用时间隔离法防治中囊病。     

兔出血病病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为快速检测兔出血病病毒,参照RHDV-TP株VP60基因序列(GenBank Ac-ession AF453761),在其5′端设计一对引物,扩增片段为386 bp,建立了检测兔出血病病毒的RT-PCR检测方法。经过对反应参数的优化,确定了反应的最佳条件。该方法在含多种已知病原的病料中,可特异性检出RHDV,检测病料的最高稀释度为10-5倍,且有很好的稳定性。临床样品检测结果显示,该方法的敏感性要高于血凝抑制试验,从而建立了RHDV特异、敏感的RT-PCR检测技术,可应用于RHDV临床诊断及流行病学调查。     

ARV、REV与ALV三重RT-PCR检测方法的建立

根椐GenBank中已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）、禽网状内皮增生病病毒（REV）、禽白血病病毒（ALV）等3种病毒基因组序列,设计了3对分别与ARV、REV和ALV某段基因序列互补的引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术。结果表明,用这3对引物对同一样品中的ARV、REV、ALV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,可同时扩增ARV的247bp,ALV的675bp,REV的467bp的特异性片段,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10pg的ALV、1pg的ARV和10pg的REV模板。用42份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为92%以上。表明建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。