家蚕抗菌肽的诱导及其抑菌作用研究

家蚕抗菌肽是存在于家蚕及蚕蛹的血淋巴内具有抗菌活性的多肽物质,在家蚕的天然免疫中起到至关重要的作用。采用不同剂量的γ-射线照射家蚕、对家蚕进行饥饿、电击和注射大肠杆菌等诱导处理后,提取家蚕抗菌肽,测定其抑菌效果。结果表明：以上的处理均能有效诱导抗菌物质的产生,其中饥饿法处理的家蚕产生抗菌肽的抑菌活性最强。本试验利用家蚕生产抗菌肽为家蚕的综合利用提供了一种新的途径。     

黄粉虫幼虫中抗菌肽的诱导及其抗菌活性的初步研究

本文首次以鞘翅目拟步甲科昆虫黄粉虫（Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ）幼虫为实验材料,分别用超声波和饥饿后饲喂大肠杆菌的方式进行诱导,对诱导前后０～４ｄ内获得的抗菌肽进行了平板测活。实验表明抗菌肽含量在诱导后第４ｄ最高,且在４ｄ内随时间的增加而增加。两种诱导方式诱导出的抗菌肽具有相似的抗菌活性,都能较好地抑制大肠杆菌０７９和沙门氏菌５０１１５,且收集的抗菌物质经１００℃处理２０ｍｉｎ后抗菌活性基本不变。本文首次采用了饥饿后饲喂含菌食物的诱导方式,简便易行,适合大量昆虫抗菌肽的诱导、分离及应用。     

双翅目昆虫抗菌肽研究进展

抗菌肽是一类普遍存在于生物体内的带有正电荷的两亲性多肽物质,具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。随着传统抗生素的毒副作用及其耐药菌株的出现,迫使人们去寻找新型的抗微生物制剂,而具有抗微生物等多种生物学功能的抗菌肽有着广阔的应用前景。昆虫抗菌肽数量难以估量,而双翅目昆虫的抗菌肽近年来被广泛研究报道。本文就双翅目昆虫抗菌肽的特点和种类、作用机制及应用的最新进展进行综述。     

3种昆虫黄酮提取物的大肠杆菌抑菌活性研究

[目的]测定美洲大蠊、中华稻蝗、芫菁3种昆虫体内黄酮提取物的抑菌作用效果。[方法]采用溶剂萃取法(SFE)提取3种昆虫总黄酮,根据公式计算不同浓度的黄酮提取物对大肠杆菌的抑制率。[结果]其他条件相同时,美洲大蠊、中华稻蝗、芫菁3种昆虫的黄酮浓度与抑制大肠杆菌繁殖的作用效果呈正相关;浓度相同时,美洲大蠊黄酮体内提取物抑菌效果最佳,中华稻蝗次之,芫菁的抑菌效果最弱。[结论]美洲大蠊、中华稻蝗、芫菁3种昆虫黄酮提取物对大肠杆菌有一定的抑制作用。     

5-氨基乙酰丙酸对中华稻蝗（Oxya chinensis）的杀虫活性及对3种酶活性的影响

 【目的】研究5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid,ALA）对中华稻蝗（Oxya chinensis）的杀虫活性及对3种酶活性的影响。【方法】以中华稻蝗4龄若虫为试验材料,用不同剂量的ALA（A1：250 mmol•L-1;A2：450 mmol•L-1;A3：750 mmol•L-1;A4：1 000 mmol•L-1）处理中华稻蝗,观察其对中华稻蝗的毒性效应和对其体内乙酰胆碱酯酶（AChE）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性的影响。【结果】不同剂量ALA处理组中华稻蝗死亡率依处理剂量呈现上升趋势,高浓度处理组A3、A4的死亡率分别达到66.19%和80.21%;LD50值为3.61（3.29～3.93）mg•g-1虫重（95%置信范围）。生化研究结果显示,最高浓度A4处理组雌、雄虫体内AChE活性分别较对照组下降了51.53%和42.65%,差异显著（P＜0.05）;GPx活性分别较对照组下降了42.82%和43.85%,差异显著（P＜0.05）。同时,中华稻蝗GSTs活性随ALA处理剂量升高而增高,A4处理组雌、雄虫体内GSTs活性分别较对照组升高了171.05%及97.42%,差异显著（P＜0.05）。【结论】ALA对雌、雄中华稻蝗均有明显的毒性效应;ALA可引起AChE和GPx光失活,从而导致中华稻蝗神经传导受阻同时抵御氧化损伤的能力下降;高剂量ALA激活GSTs,可引发昆虫对光毒性物质的自身反馈抵御反应。     

昆虫抗菌肽研究与应用

昆虫抗菌肽(AMPs)是昆虫在受到刺激或感染之后,在其血淋巴中会产生的一种抗菌类物质,具有分子量小、稳定性好、广谱抗菌、无毒副作用等特点。随着抗菌肽家族的不断扩大,其各方面的研究也日益深入,昆虫抗菌肽作为一种新型短肽以其独特的特性已成为食品、农业、医药等领域的研究热点。简要综述了昆虫抗菌肽的生物特性、作用机理及应用现状。     

镉和铬急性染毒对中华稻蝗解毒酶及多酚氧化酶的影响

为了解重金属对生物体营养物质的消化、吸收、代谢以及对昆虫的毒性效应,研究了重金属镉和铬急性染毒对中华稻蝗5龄若虫几种代谢解毒酶及多酚氧化酶活性的影响。研究结果显示：高浓度镉和铬分别在48 h和72 h激活CarE活性;当镉处理中华稻蝗96 h后,体内ACP活性下降;铬染毒72 h后,AKP活性升高,而铬作用24 h和48 h后,ACP活性表现为在低浓度处理组中被激活,高浓度处理组中被抑制;镉处理48 h后,GST活性升高,铬处理72 h和96 h,GST有升高的趋势;镉处理24 h和铬处理96 h后PPO活性降低。这些结果表明,镉和铬染毒后,中华稻蝗体内代谢解毒酶及多酚氧化酶活性发生变化,这种变化与重金属的浓度及作用时间密切相关。     

中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶2基因的分子特性和生物学功能

【目的】研究中华稻蝗（Oxya chinensis）几丁质脱乙酰基酶（chitin deacetylase,CDA）基因的分子特性和生物学功能,为新型农药靶标筛选提供科学依据。【方法】采用生物信息学方法在稻蝗转录组数据库中搜索获得几丁质脱乙酰基酶基因cDNA序列,对其进行保守区域分析,选取赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、果蝇（Drosophila melanogaster）、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）、家蚕（Bombyx mori）和云杉卷叶蛾（Choristoneura fumiferana）等昆虫物种的同源序列与中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶氨基酸序列进行聚类分析,进一步构建系统发育树;运用real-time PCR方法检测几丁质脱乙酰基酶基因在中华稻蝗5龄若虫不同组织部位和不同发育天数表皮中的表达特性;进一步采用RNA干扰（RNAi）技术研究该基因对中华稻蝗蜕皮发育的影响。【结果】在中华稻蝗转录组数据库中搜索获得2条几丁质脱乙酰基酶基因的cDNA全长序列,生物学软件分析其氨基酸,发现2条序列均具有信号肽,开放阅读框包含3个几丁质脱乙酰基酶保守区域：几丁质结合区（ChBD）、低密度脂蛋白受体区（LDLa）和几丁质脱乙酰基催化结合域（CDA）。聚类分析表明2条序列分别与所选用的5种昆虫CDA2聚为一支。剪切子聚类分析发现2条序列分别与5种昆虫CDA2a和CDA2b相聚为一支,综合序列分析和聚类结果,认为所获得的序列属于几丁质脱乙酰基酶2基因的2个不同剪切子,分别命名为OcCDA2a和OcCDA2b。定量PCR分析表明OcCDA2a和OcCDA2b均在中华稻蝗表皮、前肠和后肠中高表达;在5龄第1天的表皮中表达量较高,之后逐步下降,蜕皮前又略有上升;RNAi研究发现5龄第2天的若虫注射dsOcCDA2a或dsOcCDA2b 24 h后,与注射dsGFP的对照相比,目的基因表达量显著降低,沉默效率分别为96.72%和80.43%;进一步观察试虫的表型,与对照组相比,注射dsOcCDA2和dsOcCDA2a的大多数虫体出现龄期延长,脊线开裂,旧表皮不能顺利剥离而导致虫体扭曲,最终死亡。少数若虫在蜕皮前死亡,未出现异常表型,部分若虫虽蜕至成虫,但四肢无力,行动缓慢。死亡率分别达到87.5%和94.4%;注射dsOcCDA2b的试虫无可见表型,可正常蜕皮发育至成虫。【结论】中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶2基因具有2个剪切子,分别为OcCDA2a和OcCDA2b。OcCDA2a参与虫体蜕皮,对其生长发育起着重要的作用,该基因的沉默导致中华稻蝗因蜕皮困难而死亡,而OcCDA2b对中华稻蝗的生长发育没有影响。     

中华稻蝗几丁质酶基因10（OcCht10）的分子特性及功能

【目的】获得中华稻蝗（Oxya chinensis）几丁质酶基因10（OcCht10）的cDNA序列,预测其功能域,并做聚类分析明确该基因的系统发育关系。绘制OcCht10在5龄若虫不同组织部位和发育时间的表达图谱,研究其在中华稻蝗蜕皮过程中的生物学功能,为害虫防治提供高效安全的候选基因。【方法】从中华稻蝗转录组数据库搜索OcCht10 cDNA片段,经过blast分析、比对、拼接后,翻译为氨基酸序列,预测其功能域,并与其他昆虫几丁质酶家族基因进行聚类分析,进一步确认该基因的系统发育关系并进行准确命名;选取中华稻蝗5龄第6天不同组织部位及5龄若虫不同天数表皮样本,总RNA提取后反转录为cDNA模板,采用Real-time quantitative PCR（qPCR）方法获得OcCht10在5龄稻蝗若虫不同组织部位和不同发育阶段的表达谱;设计OcCht10 dsRNA引物,用试剂盒体外合成dsOcCht10,采用注射法进行RNA干扰;取注射24 h稻蝗表皮样本,用qPCR方法检测OcCht10基因沉默效率;并仔细观察dsRNA注射后稻蝗表型,统计其死亡率。【结果】经对中华稻蝗转录组数据库的搜索,获得OcCht10 cDNA片段长度为9 318 bp,开放阅读框为8 613 bp,编码2 870个氨基酸;其3′非编码区为705 bp,推测OcCht10 5'端有500多碱基尚未获得;预测其氨基酸序列具有多个结构域,包含有5个几丁质酶催化域和6个几丁质结合域;与其他昆虫几丁质酶基因聚类分析结果显示OcCht10属于昆虫几丁质酶家族基因Ⅱ组,该组基因与昆虫蜕皮相关;5龄若虫组织特异性分析表明该基因主要在表皮、前肠和后肠等外胚层发育而成的组织器官中表达,提示OcCht10可能参与表皮几丁质代谢;发育时间表达图谱表明该基因在5龄第6-7天,即蜕皮前的表皮中高表达,表明OcCht10可能负责蜕皮时表皮几丁质降解;5龄若虫第2天注射该基因的dsRNA,24 h后取表皮检测其干扰效率,结果显示该基因被沉默70%;与注射dsGFP的对照组相比,注射dsOcCht10 5龄若虫表现为龄期延长,旧表皮无法开裂,蜕皮受阻,昆虫无法正常活动导致死亡,死亡率达到100%。【结论】获得OcCht10的部分cDNA序列,该基因在昆虫蜕皮前表皮中高表达;OcCht10参与中华稻蝗的蜕皮发育,注射dsOcCht10可有效沉默靶基因,并导致试虫无法完成正常蜕皮而死亡。     

昆虫抗菌肽的研究进展

昆虫虽然没有完善的免疫防御体系,但却具有高效的无细胞免疫系统。昆虫抗菌肽是昆虫免疫后血淋巴中的一类抗菌多肽,它具有分子量小、热稳定、水溶性好、无免疫特性、抗菌谱广和抑制肿瘤细胞等特点。对昆虫抗菌肽的结构、作用机理及存在的问题的最新进展作一综述。     

产抗菌活性物质植物内生菌的研究进展

植物内生菌是一种新的巨大的微生物资源,其产生的抗菌活性物质具有潜在的应用价值。笔者对植物内生菌及其产生的抗菌物质的发展现状,植物内生真菌、内生细菌和内生放线菌抗菌物质的研究进展进行了综述,并讨论了植物内生菌抗菌物质的发展方向。     

香连丸抗菌作用试验研究

[目的]分析香连丸药效成分（黄连、木香、吴茱萸）不同配方的抗菌作用。[方法]以黄连、木香、吴茱萸为供试药物,志贺氏痢疾杆菌、福氏痢疾杆菌、宋内氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌为供试菌种,研究3种药物不同配方对4种细菌的抗菌作用。[结果]木香、吴茱萸、木香＋吴茱萸对4种细菌均无抗菌作用,各配方供试药液对宋内氏痢疾杆菌均无抗菌作用;黄连＋木香、吴茱萸＋木香对志贺氏痢疾杆菌和福氏痢疾杆菌的抗菌作用较黄连＋木香＋吴茱萸弱;黄连＋木香对金黄色葡萄球菌具有杀菌和抗菌作用,而黄连＋吴茱萸、黄连＋木香＋吴茱萸对金黄色葡萄球菌的抗菌作用均较弱。[结论]丸剂加味香连丸的药效最佳。     

重组人溶菌酶体外抑菌活性研究

以购买商品化的溶菌酶标准品作为对照,通过平板扩散法检测重组人溶菌酶(rhLYZ)在体外对几株致病菌及益生菌的抑菌作用,同时用梯度稀释法检测重组人溶菌酶的MIC和MBC。分别将重组酶和商品酶做梯度稀释后,滴加到涂布有一定量菌液的MH平板,通过平板扩散法测量各组抑菌环直径大小,从而判定其抑菌活性。结果表明,重组人溶菌酶抑菌活性显著高于标准溶菌酶,低质量浓度的重组酶即可对致病菌的生长产生抑制和杀灭作用。rhLYZ对金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希菌较为敏感,抑菌环直径达到15mm～18mm;对多杀性巴氏杆菌抑菌环直径则达到27.5mm。提示rhLYZ对金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希菌及多杀性巴氏杆菌等病原菌均具有较强抑菌活性。     

6种绿化植物挥发性有机物抑菌效果研究

[目的]研究分布较广的6种绿化植物叶片的挥发性有机物对细菌的抑制作用。[方法]提取法国冬青、雪松、七叶树、女贞、法国梧桐、三叶草6种植物叶片释放的挥发性有机物,用菌落法和滤纸片法研究其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用。[结果]6种植物叶片释放的挥发性有机物对3种细菌都有抑菌作用,法国冬青、雪松、女贞、法国梧桐的抑制作用较强,其中1.0 g法国冬青碎叶对3种细菌的抑菌率均达45%以上,对3种细菌抑菌圈达20 mm以上;而三叶草、七叶树的抑制作用较弱。[结论]法国冬青、雪松、女贞、法国梧桐的挥发性有机物抑菌效果明显,从环境生态学的角度来看,应选择抑菌作用强的树种作为绿化树种。     

哈氏弧菌诱导布氏石斑鱼头肾提取物的抗菌活性研究

以致病性哈氏弧菌（Vibrio harveyi）腹腔注射布氏石斑鱼（Epinephelus bleekeri）18h后,取布氏石斑鱼头肾制备头肾粗提物,并对该粗提物的抗菌活性进行研究,结果表明：布氏石斑鱼经哈氏弧菌诱导后,其头肾粗提物不仅对金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）等革兰氏阳性菌有良好抑制作用,而且对大肠杆菌D31（Escherichio coli D31）、哈氏弧菌和溶藻弧菌（V.alginolyticus）等革兰氏阴性菌也有良好抑制效果;利用电泳凝胶琼脂糖弥散法检测发现,头肾粗提物中具有多种对大肠杆菌D31有较强作用效果的蛋白类抗菌物质;切胶回收AU—PAGE凝胶上的抗菌组分,利用SDS—PAGE凝胶检测各抗菌活性组分的分子质量大小依次约为：10．9KD,10．0KD,8．1KD,7．2KD,6．3KD,由于这些抗菌活性成分可被蛋白酶破坏,且分子质量均接近或低于10KD,可初步将其认定为抗菌肽。     

辣椒乙醇提取液的抑菌活性研究

采用琼脂扩散法研究了辣椒乙醇提取液对细菌、霉菌和酵母菌的抑菌活性。结果表明,提取液对3种菌均具有明显的抑菌作用,且其抑菌效果随提取液浓度的增大而增强。辣椒乙醇提取液对6种供试菌株的抑菌活性依次为：酿酒酵母〉黑曲霉〉青霉〉沙门氏菌〉金黄色葡萄球菌〉枯草芽孢杆菌。     

八角尺蠖幼虫粪便提取物抑菌活性的初步研究

[目的]研究八角尺蠖幼虫粪便提取物的抑菌作用,为其合理开发利用提供理论依据。[方法]用蒸馏水、乙醇、丙酮和正己烷4种溶剂对八角尺蠖幼虫粪便进行提取。以4种细菌和4种真菌为供试菌种,使用滤纸片法测定4种溶剂提取物的抑菌活性。[结果]八角尺蠖幼虫粪便的蒸馏水提取物对枯青霉、根霉菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉和产气杆菌的抑菌效果较强;乙醇提取物对枯青霉、根霉菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较强;丙酮提取物对枯青霉、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果较强。[结论]八角尺蠖幼虫粪便的4种溶剂提取物均具有一定的抑菌活性,其中蒸馏水、乙醇和丙酮提取物的抑菌活性较强,且不同提取物对不同的供试菌种的抑菌效果也存在差异。     

5-硝基水杨醛双缩二氨基硫脲Schiff碱的合成·表征与抑菌活性研究

[目的]合成对称的5-硝基水杨醛双缩二氨基硫脲Shiff碱,并测试其抑菌活性。[方法]目标化合物经红外、元素、核磁、质谱确证其化学结构,并用管碟法测试其抑菌活性。[结果]4种不同浓度对2种细菌均有一定程度的抑菌效果,但对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于大肠杆菌。[结论]该新化合物对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌有较好的抑制效果。     

贻贝抗菌肽的分离纯化

[目的]从贻贝中提取具有抗菌作用的多肽。[方法]以紫贻贝为原料,采用0.5%的乙酸直接提取方式提取抗菌肽,再经过Sephacryl S-100聚丙烯酰胺凝胶色谱进行纯化,收集各馏分并用滤纸片扩散法测定其抗菌活性及对各种细菌的最低抑菌浓度,使用SDS-PAGE测定抗菌肽的分子质量,测定其在100℃条件下不同处理时间和不同pH条件下抗菌活性的变化。[结果]使用0.5%的乙酸作为提取液粗提取抗菌肽具有较高的提取效率,使用Sephacryl S-100纯化抗菌肽,可将抗菌肽纯化为单一物质。分离纯化出的贻贝抗菌肽具有较强的抗菌性,分子质量为5 908,且具有耐高温、耐酸碱的性质。[结论]该研究为抗菌肽的大规模生产奠定了基础。