猪流行性腹泻病毒广东分离株GD/JMEP的遗传演化分析

为了解广东地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行现状,对广东地区猪场进行了PEDV流行株的分离,分离得到1株猪流行性腹泻病毒,对分离毒株的S、N、M及ORF3基因进行遗传演化分析。结果表明:检测的PEDV毒株GD/JMEP与经典的CV777毒株亲缘关系较远,与近几年广东地区流行的PEDV毒株处于一个群,亲缘关系较近;通过ORF3序列分析发现,未有核苷酸的缺失;N、M基因核苷酸和氨基酸同源性分析发现,GD/JMEP与EAS1等经典毒株的同源性相对较低,与2013—2015年中国、美国、韩国等流行毒株的同源性较高;相比于经典传统毒株CV777,GD/JMEP的N基因存在9个氨基酸的差异,M基因存在11个核苷酸位点的变异和3个氨基酸的改变S基因存在几个位点核苷酸的缺失或者插入;与目前流行毒株比较,M、N基因存在核苷酸位点的改变,S基因在406位点存在新的突变;通过氨基酸比对分析,GD/JMEP发生了6个新的氨基酸位点突变,表明本试验所检测的PEDV为目前广东流行毒株。     

6株猪流行性腹泻病毒贵州株S基因序列分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）S基因的特点,掌握其遗传变异情况,本试验设计3对特异性引物对6株PEDV贵州株S基因进行全基因RT-PCR扩增、克隆及序列测定;应用生物信息学软件将6株PEDV贵州流行株与参考毒株进行同源性与系统进化分析。结果显示,6株PEDV贵州流行株S基因的全基因长为4 161 bp,编码1 387个氨基酸,与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性在93.3%~98.8%之间,氨基酸同源性在91.6%~98.9%之间;进化树分析结果显示,6株流行毒株与美国毒株、越南毒株和山东毒株亲缘关系较近;与CV777株、LZC、Brl、83P-5亲缘关系较远。结果表明,PEDV贵州地方流行毒株S基因编码的氨基酸存在一定程度变化,近年来呈现变异趋势。本研究可为贵州省PEDV的防控提供一定的理论依据。     

河南省部分地区猪流行性腹泻病毒ORF3和N基因的克隆及其遗传进化分析

为探究河南省猪流行性腹泻病毒部分毒株的遗传进化情况,采用RT-PCR对2017年2月至2018年1月在河南省部分地区猪场收集到的25份PEDV阳性病料进行ORF3和N基因的扩增,并对其进行克隆、序列比对及遗传进化分析。结果显示,PEDV毒株的ORF3基因序列是由675个核苷酸组成的,与经典毒株CV777之间核苷酸及氨基酸同源性分别为95.2%~97.5%和95.1%~96.9%。N基因之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为96.2%~100%和93.8%~99.8%;与经典毒株CV777核苷酸与氨基酸的同源性分别为94.7%~95.8%和93.2%~96.8%。河南部分地区PEDV流行毒株与经典毒株CV777不在同一分支,说明猪场暴发猪流行性腹泻与免疫接种疫苗后依旧难以控制的原因,可能与大多数PEDV河南流行株发生变异有关。     

我国华东地区猪流行性腹泻病毒ORF3基因的遗传变异分析

为了确定猪流行性腹泻病毒的流行特点及变异规律,本研究对我国华东地区分离到的14株PEDV的ORF3基因进行了克隆和序列测定,并与国内外代表毒株的ORF3基因进行了比较分析。结果表明:我国华东地区检测的PEDV流行毒株的ORF3基因之间的同源性为92.4%~100%,与经典毒株CV777同源性为92.0%~96.4%,与PEDV变异株的同源性为95.1%~100%。根据ORF3基因的遗传进化分析,分离的14个PEDV毒株与CV777的遗传进化距离较远,与PEDV变异株的遗传进化距离较近,表明我国PEDV流行毒株以变异株为主,较以往的疫苗株CV777发生了较大的变异,因此需要开发新的疫苗,制定更具针对性的防控措施。     

猪流行性腹泻病毒JS2017株的分离鉴定及S基因序列分析

为了解江苏省某规模化猪场猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传变异情况,本试验采集腹泻仔猪小肠组织及肠道内容物,通过RT-PCR进行PEDV鉴定。将检测为阳性的病料组织经20μg/mL胰酶处理后,接种到Vero细胞中进行培养,将细胞培养物进行反复冻融后,收获病毒液,进行RT-PCR鉴定。采用分段重叠策略对其S基因进行全基因序列扩增,并在此基础上分析该毒株S基因的核苷酸同源性及遗传进化关系。结果显示,经RT-PCR鉴定,病料组织呈PEDV阳性,阳性病料接种Vero细胞盲传4代后,出现明显的细胞病变,表现为细胞合胞体病变,空泡化,最终裂解脱落。收获的病毒液经RT-PCR鉴定后,确认分离到1株PEDV,命名为JS2017株。核苷酸序列分析表明,JS2017株S基因序列与美国变异株OH1414、加拿大变异株ON-007、中国变异株PEDV-LYG和CH/PDS/2015位于同一进化分支,其核苷酸同源性高达99.0%以上;其中与中国变异株YC2014亲缘关系最近,核苷酸同源性为100.0%;与经典株CV777、DR13株同源性较低,亲缘关系较远。结果表明,本研究分离获得的JS2017毒株是一株PEDV地方流行变异毒株,与2014年中国江苏分离株(YC2014株)亲缘关系最密切,与当前猪流行性腹泻疫苗株亲缘关系较远。     

猪流行性腹泻病毒JS2017株的分离鉴定及S基因序列分析

为了解江苏省某规模化猪场猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传变异情况,本试验采集腹泻仔猪小肠组织及肠道内容物,通过RT-PCR进行PEDV鉴定。将检测为阳性的病料组织经20μg/mL胰酶处理后,接种到Vero细胞中进行培养,将细胞培养物进行反复冻融后,收获病毒液,进行RT-PCR鉴定。采用分段重叠策略对其S基因进行全基因序列扩增,并在此基础上分析该毒株S基因的核苷酸同源性及遗传进化关系。结果显示,经RT-PCR鉴定,病料组织呈PEDV阳性,阳性病料接种Vero细胞盲传4代后,出现明显的细胞病变,表现为细胞合胞体病变,空泡化,最终裂解脱落。收获的病毒液经RT-PCR鉴定后,确认分离到1株PEDV,命名为JS2017株。核苷酸序列分析表明,JS2017株S基因序列与美国变异株OH1414、加拿大变异株ON-007、中国变异株PEDV-LYG和CH/PDS/2015位于同一进化分支,其核苷酸同源性高达99.0%以上;其中与中国变异株YC2014亲缘关系最近,核苷酸同源性为100.0%;与经典株CV777、DR13株同源性较低,亲缘关系较远。结果表明,本研究分离获得的JS2017毒株是一株PEDV地方流行变异毒株,与2014年中国江苏分离株(YC2014株)亲缘关系最密切,与当前猪流行性腹泻疫苗株亲缘关系较远。     

猪流行性腹泻病毒jiaozuo1012/2019株的分离鉴定及遗传进化分析

为确定2019年河南焦作某猪场哺乳仔猪发生腹泻的病因,本研究采用RT-PCR方法对该发病猪场送检的5份仔猪肠内容物样品进行仔猪腹泻相关病毒检测,对检测的猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性样品进行病毒分离,对分离的PEDV S基因和ORF3基因进行PCR扩增,并分析这两个基因与GenBank中的PEDV参考株相应基因的同源性及遗传进化分析。结果显示,送检的5份猪肠道内容物样品PEDV检测结果均为阳性,而猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)的检测结果均为阴性;将随机选取的1份PEDV阳性样品接种Vero细胞并经传代培养,对培养5代的病毒经PCR检测表明分离到一株PEDV,并将其命名为jiaozuo1012/2019株;基于S基因同源性分析结果显示,该分离株与河南分离的PEDV CH/HNLH/2015株同源性最高,为99.3%,与近期河南分离株的同源性为96.4%～99.0%,与经典PEDV CV777株的同源性较低为93.4%。分离株S基因编码的氨基酸在aa59～aa62位存在4个氨基酸(~(59)QGVN~(62))的插入,在aa140和aa163～aa164分别存在1个和2个氨基酸的缺失(~(140)N和~(163)NI~(164));ORF3基因的同源性分析结果显示,分离的PEDV与江苏分离的PEDV JSCZ1601株的同源性最高,为99.7%,与近年来河南分离株的同源性为98.5%～99.6%,与经典株CV777的同源性较低为96.6%;S基因与ORF3基因的进化树结果显示,该分离株与目前国内流行株遗传关系最近。上述结果表明,本研究分离的PEDV具有近年来新流行PEDV株的序列特征,与经典PEDV株具有相对较远的遗传进化关系。本研究为进一步探究PEDV在河南地区的变异规律提供了参考依据。     

1株猪流行性腹泻病毒S基因的克隆及序列分析

本研究对分离的1株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S基因进行克隆和测序,并进行生物信息学分析。通过ORF3序列分析发现,未有核苷酸的缺失,推测为PEDV野毒株。S基因分析结果表明,该毒株(以GD/JMEP表示)与经典的CV777毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性为93.2%,存在多个氨基酸的缺失、插入或者突变;与近几年广东流行的PEDV毒株处于同一个群,亲缘关系较近;相比于经典传统毒株,GD/JMEP株在S基因的几个位点存在核苷酸的缺失或者插入;与目前流行毒株比较,在S基因的406位点存在新的突变。通过氨基酸序列比对分析,GD/JMEP株发生了6个新的氨基酸位点突变,表明本试验检测的GD/JMEP株为目前广东PEDV流行毒株。     

流行性腹泻病毒5株猪安徽流行株S基因的克隆与序列分析

为了解安徽省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的遗传变异,试验对5株PEDV安徽流行毒株S基因进行RT-PCR扩增、序列测定和分析。结果显示,5株PEDV安徽流行毒株S基因的全长均为4 161 bp,编码1 386个氨基酸,核苷酸同源性为98.7%~99.8%,它们与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性在93.6%~99.8%之间;进化树分析显示,5株流行毒株与CV777、attenuated DR13、LZC和CHS亲缘关系较远,与2011年后国内外PEDV分离株亲缘关系较近。研究结果可为PEDV的防控和疫苗研制提供参考和依据。     

广东省猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析

为了研究广东省猪流行性腹泻病毒(PEDV)毒株ORF3和M基因的变异情况,试验于2012—2013年从广东省不同地区猪场采集56份腹泻病仔猪的小肠,通过PCR扩增得到8株PEDV的ORF3和M基因,并进行序列比对及遗传分析。结果表明:8株PEDV的ORF3基因与参考毒株核苷酸的同源性为94.7%~99.9%,其中GD-DG毒株与LZC毒株比较核苷酸的同源性最低(94.7%),GD-HY毒株与中国TX2011毒株比较核苷酸的同源性最高(99.9%);8株PEDV的M基因与参考毒株核苷酸的同源性为95.7%~99.9%,其中GD-MM毒株与泰国M_NIAH380_98毒株比较核苷酸的同源性最低(95.7%),GD-HZ毒株与韩国CPF299、PFF188、PFF285毒株及泰国KU01CB08毒株比较核苷酸的同源性最高(99.9%)。说明近年来广东省流行的PEDV毒株以变异株为主,与经典株CV777的亲缘关系较远。     

浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株（ZJ16NB6）与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。     

猪流行性腹泻病毒CH/S株N蛋白基因的遗传变异及其原核表达

应用RT-PCR和nested-PCR方法扩增得到含猪流行性腹泻病毒CH/S株N蛋白基因的目的片段,并将其进行了克隆、序列测定及分析。CH/S株N蛋白基因含有一个长1326bp的ORF,编码由441个氨基酸残基组成的多肽,未发现碱基的插入和缺失。CH/S与CV777、Chinju99、JS-2004-2和LJB/03N蛋白基因ORF的序列同源性分别为97.1%、96.8%、96.7%和96.5%;推导的氨基酸序列的同源性分别为97.7%、97.1%、97.1%和96.8%。以阳性质粒为模板,用分别含有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的上、下游引物扩增得到ORF,其PCR产物经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到pET-30a载体,构建的重组质粒命名为pET-30a-PN;将pET-30a-PN转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达;SDS-PAGE结果表明表达出与预期大小相符的约54.4Ku的重组蛋白,重组蛋白以包涵体形式存在;薄层扫描结果表明表达产物占菌体总蛋白的30.5%;Western blot分析表明表达的重组蛋白能与抗PEDV高免血清反应,说明该重组蛋白具有免疫学活性。     

2株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及ORF3基因的克隆与序列分析

为研究、防控广东地区猪流行性腹泻,首先通过RT-PCR法确定某猪场粪便样品中存在猪流行性腹泻病毒,随后利用Vero细胞进行盲传,最后经核酸类型鉴定、RT-PCR、病毒TCID50的测定、目的基因测序和序列分析等方法,确认分离到2株猪流行性腹泻病毒毒株,命名为PEDV GDKP-2013和PEDV GDKP2-2013,通过ORF3全基因核苷酸序列分析可知,GDKP-2013株与GDKP2-2013株与经典参考毒株的氨基酸序列一致性为 JX261936-CHGD-01,98.2%,98%;JQ039903-CH-GD-2011,98.6%,98.4%;AF353511-CV777,95.4%,95.1%;KC344845-STPED0810,95.1%,94.8%;EU054929-DR13,95.5%,95.2%;KF272920-USA-Colorado-2013,95.1%,94.8%,表明此2毒株与国内分离株的氨基酸同源性高,与韩国、泰国和美国分离株的氨基酸同源性要低一些,同时,与疫苗参考株的氨基酸同源性也相对较低;基因系统进化分析可知,GDKP-2013株与GDKP2-2013株主要处在Ⅰa分支,均与弱毒疫苗株（Ⅰb分支）相互之间遗传进化关系较远。     

猪流行性腹泻病毒TaqMan检测方法的建立及基于S基因的遗传变异分析

旨在建立一种能快速、高效且灵敏的检测出猪流行性腹泻病毒（PEDV）的通用型TaqMan qPCR检测方法,并进一步了解河北省PEDV的遗传变异情况。本研究参考PEDV变异株AJ1102的M基因的保守区域设计特异性引物及探针,对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立了一种应用于猪场筛查PEDV的qPCR方法,并对筛查出的阳性样品S基因扩增测序后进行遗传进化分析。结果显示：该方法的特异性强,与猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）及传染型胃肠炎病毒（TGEV）等猪病常见病原均无交叉反应;建立的检测方法对pMD19T-PEDV标准品的最低检测下限为1.09×10¹拷贝·μL^-1,比普通PCR灵敏约100倍,敏感性高;组内和组间的变异系数均小于1%,重复性良好。基于S全基因成功克隆出的9条序列分布于GⅡ的两个亚群,克隆的9条序列的核苷酸相似性为96.6%～99.1%;氨基酸的相似性为94.6%～98.7%。结果表明：本研究得到的PEDV流行株与近年来国内分离株的关系较为密切,而与中国目前使用的疫苗株以及欧洲株亲缘关系较远,这表明河北部分地区PEDV当前流行毒株比较复杂且有变异的趋势,提示持续检测PEDV流行毒株变异动态的必要性。本研究不仅为PEDV的临床诊断提供了技术支持,更为进一步掌握PEDV遗传进化规律提供了参考依据。     

猪流产胎儿中猪圆环病毒3型的检测及其遗传演化分析

旨在分析猪流产胎儿中猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)的感染及其遗传进化情况。对2015—2017年采集的湖南省680份猪流产胎儿病料样品进行PCV3检测、扩增和测序,并利用生物信息学软件对获得的序列进行遗传进化分析。结果显示,猪流产胎儿样品中PCV3阳性率为24.4%(166/680),其中,2015—2017年阳性率分别为18.2%(26/143)、22.7%(54/238)和28.8%(86/299)。从PCV3阳性样本中获得了1株PCV3基因组全长序列,命名为PCV3/CN/Hunan-57(GenBank序列登录号为MZ934695),与国内外毒株基因组序列相比,相似性为97.8%~99.2%;获得了5株PCV3 ORF2基因序列,它们的核苷酸和氨基酸相似性为97.5%~98.3%和96.7%~99.7%,与国内外参考毒株ORF2基因序列相比,其核苷酸和氨基酸相似性为96.3%~99.2%和96.8%~100%。基于ORF2基因序列构建遗传进化树和进行多重序列比对,发现获得的PCV3阳性序列分别属于PCV3a(1株)和PCV3c(4株),并鉴定出T100A、G113S和A184S突变位点。综上表明,猪流产胎儿中PCV3感染率较高,且存在不同类型的PCV3毒株感染,为后续深入研究PCV3遗传变异及其相关致病性提供了重要参考信息。     

Etiological Investigation of Diarrhea in Newborn Piglets and Molecular Characterization and Genetic Variation Analysis of ORF3 Gene of PEDV in North Guangdong

In order to understand the main pathogen of newborn piglets diarrhea in North Guangdong region, 31 diarrhea samples were collected from six pig farms in North Guangdong, the pathogen of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine rotavirus (PoRV) were detected by Real-time RT-PCR, meanwhile, ORF3 gene of PEDV amplified from positive samples were sequenced and analyzed. Pathogen detection results showed that 83.87%(26/31) samples were positive for PEDV, all herds and samples were negative for TGEV and PoRV. The sequence analysis revealed that the ORF3 gene of 5 epidemic strains of PEDV were all 675 bp, homologies of nucleotides were 98.7% to 100.0%, and homologies with reference sequences of nucleotides were 94.5% to 100.0%, and some gene mutation in common nucleotides site. The results of gene phylogenetic trees showed that PEDV could be divided into two groups, PEDV genetic relationship between field strains in North Guangdong and some regions in China, Southeast Asia, North America, Europe from 2013 to 2015 was closer, classed as a gene subgroup, from 2011 to 2012 main epidemic strains in our country and vaccine strains classed as other two gene subgroups. These results indicated that PEDV infection was the main pathogen of newborn piglets diarrhea in North Guangdong region, as time passed, the PEDV epidemic strains gene presented a tendency of evolution and variation.     

6株猪流行性腹泻病毒N基因的克隆与分析

为了解安徽省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,采用胶体金试纸条检测安徽省境内发生疑似猪流行性腹泻病的病猪粪便（2013—2017年）;对PEDV抗原阳性猪样品,利用RT-PCR方法扩增其PEDV N基因,并进行测序和序列分析。结果发现,经胶体金试纸条检测确认了6个猪流行性腹泻发病猪场;对来自该6个猪场的病料样品或病毒传代培养物进行RT-PCR扩增和测序,共获得6株PEDV流行毒株的N基因序列,其序列全长均为1 326 bp,将其分别命名为N12、N22、N32、N42、N52和N62。核苷酸同源性分析显示,6株PEDV分离株N基因之间序列同源性为94.8%~99.8%。其中,5株PEDV分离株（N12、N22、N32、N52和N62）与PEDV疫苗株、经典毒株、2011年之前的我国分离株（LZC、CHS）的同源性较低（94.1%~96.3%）,亲缘关系较远;与2011年后国内外PEDV分离株存在较高同源性（96.9%~99.2%）,亲缘关系较近;而N42正好相反。该研究表明,近年来安徽各地猪场以PEDV新变异毒株的流行为主。     

Bioinformatics Analysis on S1 Gene of Four Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strains

To analyse the genetic variation of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV),one pair of primers was designed and RT-PCR was used to amplify the S1 gene epitope sequences of 4 PEDV field strains.Phylogenetic analysis showed that 4 strains were closely related to each other and belonged to the second group,and the Hunan and Henan isolates had a close relationship with JXGZ2013,GDZQ2012,GDZQ2014 strains,with the nucleotide homologies at 98.3% to 98.7%;Shanghai strain had a closed relationship with BJ-2011 strain and LZW isolates,with the higher homology at about 98.7%;Fujian isolates had a close relationship with strain of American in 2013,Japanese and Taiwan variation of China with the nucleotide homology at 99.0% to 99.5%;These results showed that a rapid variation and evolution of PEDV strains occurred in recent years,and linear B-cell epitope analysis showed that the threshold values at site 265 to 278 amino acid of 4 filed strains were higher than that of vaccine strains.The epitope differences indicated a possible of infectious that cause of patterns of epidemiology of PEDV.     

4株猪流行性腹泻病毒S1基因生物信息学分析

为分析猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的遗传变异情况,本研究设计合成1对引物,应用RT-PCR方法扩增S1基因的主要中和表位区序列,并对4株PEDV分离株S1基因中和表位区进行遗传进化和B细胞抗原表位分析。结果显示,4株分离株位于同一进化分支G2上,其中湖南株和河南株与JXGZ2013、GDZQ2012、GDZQ2014株亲缘关系最近,同源性高达98.3%~98.7%;上海株与BJ-2011株、LZW分离株核苷酸同源性高达98.7%左右;福建株与2013年美国株、日本株及中国台湾变异株亲缘关系较近,核苷酸同源性高达99.0%~99.5%;B细胞线性抗原分析显示,与疫苗株相比,4株流行株在265－278位氨基酸处抗原表位明显增强。提示近年来PEDV呈现快速变异和进化趋势,抗原表位的变化可能是影响PEDV流行株感染性的主要原因。