烟草炭疽菌的分子鉴定与检测

克隆并测定烟草炭疽菌r DNA全序列,序列全长2870 bp。序列比对发现,烟草炭疽菌与胶孢炭疽菌的rDNA序列相似性最高,达96.0%~96.2%;从构建的系统关系树也可以看出,烟草炭疽菌与胶孢炭疽菌聚成一个单独的分支,说明烟草炭疽菌与胶孢炭疽菌的亲缘关系最近。因此,结合烟草炭疽菌的形态学特征,可以初步将从贵州烟草分离的烟草炭疽菌鉴定为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。根据所测烟草炭疽菌的rDNA序列设计特异性引物,不仅可以从8种不同的烟草病原真菌中鉴定出烟草炭疽菌,而且可以从7种炭疽菌中鉴定出烟草炭疽菌。用烟草炭疽菌接种普通烟,以接种发病的病组织总DNA为模板,利用该特异性引物进行PCR扩增,同样可以扩增出特异性条带,表明该方法可用于烟草炭疽菌的鉴定和快速检测。     

胶胞炭疽菌DNA的PCR特异性扩增

利用1对胶灰疽菌特异寡聚核苷酸引物，对31个来自于橡胶树，芒果树的胶胞炭疽菌菌株的全基因组DNA进行扩增，均扩增到约500bp的DNA片段，而芭蕉炭疽功，辣椒疽菌，菜豆炭疽菌，腐霉菌，镰刀菌则不能被扩增。这表明，通过种间DNA特异片段的PCR扩增，能将胶胞炭疽菌与其他炭疽菌种类区别开来。采用该方法鉴别胶胞炭疽菌，其结果与形态鉴别的相吻合。     

红掌毁灭炭疽菌的分子检测

根据GenBank中炭疽属Colletotrichum不同种的ITS序列差异,设计了毁灭炭疽菌Colletotrichum destructivum的特异性引物F1/ITS4,由此建立的PCR检测体系可以从80个毁灭炭疽菌菌株中扩增得到1条486 bp的特异性条带,而扩增其他近似或相关种的菌株时没有相应的特异性条带.该...     

喀斯特炭疽菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立

为寻求喀斯特炭疽菌的快速检测方法,利用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术,以喀斯特炭疽菌基因组中的ACT基因为靶序列设计并筛选特异性引物探针,通过特异性、灵敏度、重复性试验建立喀斯特炭疽菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。结果表明:建立方法的特异性较强、灵敏度较高、重复性稳定性较好,最低检测限为0.2pg DNA/反应,标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.998。该方法操作简便,可用于进出境口岸喀斯特炭疽菌的检疫。     

百合炭疽病病原菌PCR检测技术

百合炭疽病是百合（Liliumlongifzorum）种球上重要病害之一,其病原为百合炭疽病菌（ColletotrichumliliiPlakidas）。通过百合炭疽病菌与常见胶孢炭疽病菌（C．gloeosporioides ）等4种不同炭疽病菌种类的核糖体DNAITS序列比对设计特异性引物,通过特异性检验,确定BT73／BT-RSl0和BT-F98／BT-R510。2对引物均可以分别扩增出438bp和413bp的百合炭疽病菌目标片段,而对常见4种炭疽病菌及百合球茎上2种常见的病原菌百合枯萎病菌及灰霉病菌均不能扩增出相同的目标片段。用引物对F73／BT-R510和BT-F98／BT-R510特异性PCR扩增百合炭疽病菌的灵敏度分别都在50pg以上。用外圈引物对F73／BT-R510和内圈引物对BT-F98／BT-R510进行巢式PCR扩增,对百合炭疽病检测的灵敏度提高不明显。     

应用二次PCR检测草莓炭疽病菌

开发了一种基于PCR的草莓炭疽病致病菌暹罗炭疽菌(Colletotrichum sisamense)检测方法。通过分析暹罗炭疽菌及24种真菌的ITS区序列，设计了1条反向特异引物CsiaR,结合引物CgInt可仅从暹罗炭疽菌中扩出约400 bp片段。对不同浓度暹罗炭疽菌DNA溶液进行检测，第1轮和第2轮PCR的最低检出限分别为50 pg/μL和5 fg/μL;对接种不同浓度暹罗炭疽菌分生孢子悬浮液的草莓样本(接种48 h,症状未出现)进行检测，低于1.0×10⁴个孢子/mL的处理无法检出；对田间随机采集的草莓样本检测时，PCR检测阳性的样本(含有症状和无症状)中均可分离到暹罗炭疽菌。总体来说，本方法可用于草莓中暹罗炭疽菌的早期、快速及准确检测，从而为草莓炭疽病的及时有效防控提供依据。     

番茄白粉菌的PCR分子检测

根据番茄白粉菌核糖体DNA的ITS(internal transcribed spacer)序列的特异性,设计2对引物OidF1/R1、OidF2/R2,对番茄白粉菌进行了PCR特异性扩增试验。结果表明:2对引物都可以从番茄白粉菌基因组DNA中扩增出350 bp左右的特异性扩增产物,并具有专一性,只在白粉菌和接种感病组织DNA中有扩增条带,而番茄早疫病菌、叶霉菌以及健康组织DNA中均无特异性扩增片段;引物具有高度的灵敏度,可以检测含有1 ng的番茄白粉菌DNA。由此证明,该方法可快速、准确和灵敏地鉴定和检测番茄白粉病的发生。     

应用DPO技术检测番茄斑萎病毒方法的建立

为了准确、高效地检出番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV),利用双启动寡核苷酸引物(DPO)技术,以TSWV外壳蛋白(CP)基因为靶基因,设计了一对DPO引物,对PCR反应体系中的引物、d NTPs、Taq DNA聚合酶用量进行优化,建立了TSWV的DPO-PCR检测方法,并对其灵敏度、特异性以及退火温度敏感性进行了评价。结果表明,应用DPO引物建立的PCR技术能够成功地扩增出TSWV的208 bp特异性条带,与预期目标相符。经过优化后,DPO-PCR反应体系(25μL)为:DNA模板1μL,10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,d NTPs(每种2.5 mmol/L)2.0μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2μL,上、下游DPO引物(20μmol/L)各1.0μL,以去离子水补充至25μL。利用该检测方法,在49.8~70.0℃的退火温度范围内,均可实现目标基因片段的高效扩增,说明其对退火温度不敏感;利用病毒RNA进行检测,该方法的灵敏度为7.5 ng;通过对TSWV、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和番茄黑环病毒的检测表明,仅TSWV呈现阳性反应,说明该方法特异性强。所建立的DPO-PCR检测方法能够准确、高效地检测TSWV,可用于进出境种苗检疫筛查及田间病害诊断。     

烟草疫霉的快速分子检测

 根据烟草疫霉与其他疫霉菌ITS序列的差异设计了1对寡聚核苷酸引物,用于烟草疫霉的PCR检测。结果表明,在优化的反应体系与扩增条件下,该对引物表现出强特异性,只在烟草疫霉为模板的扩增体系中具有1条660bp的条带。利用此特异性引物可稳定地从含有烟草疫霉的土壤及其发病组织中检测出病原菌。本实验提供并完善了一套快速检测烟草疫霉的方法和技术,特别对土传病害的准确诊断与快速检测在实践和理论上具有重要意义。     

贝西滑刃线虫双重PCR检测方法研究

为实现贝西滑刃线虫的高效、准确鉴定,根据贝西滑刃线虫核糖体28SrRNA-D2/D3片段的保守区域设计了特异性引物,并结合植物寄生线虫通用引物作为内标,构建了贝西滑刃线虫的一步双重PCR检测体系。结果表明:特异性引物GU-F/GU-R对贝西滑刃线虫具有高度的特异性,扩增出245bp的特异性目标片段,有效检测灵敏度可达0.125ng/μL线虫DNA模板量。该方法特异性好、灵敏度高、稳定性强,适用于贝西滑刃线虫的快速检测。     

一种针对致病因子的烟草黑胫病的环介导等温扩增检测方法的开发与应用

烟草黑胫病由烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)引起,发病率高,危害严重,是困扰我国烟草生产的主要病害。本研究采取环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification assay,LAMP),针对烟草疫霉菌特有的半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45设计四条引物,之后在PCR仪中对贵州省收集的两个烟草疫霉菌菌株的DNA进行检测,最后在普通水浴锅中对感染黑胫病烟草组织进行检测。结果表明,两个菌株的DNA均可以通过LAMP反应产生绿色荧光。感染黑胫病的烟株根部组织和茎基木质部组织与也可以直接通过LAMP反应产生绿色荧光。由此得出,本研究针对烟草疫霉菌特异的致病因子半胱氨酸蛋白酶开发的LAMP体系,利用普通水浴锅就可以直接针对感染黑胫病的烟株组织完成检测反应,对该病害在基层站点的检测提供了方便。     

大蒜与 3 种药用作物对烟草炭疽病菌的抑菌效果

烟草炭疽病是烟草苗期发生的一种主要病害,采用菌丝生长速率法,研究了大蒜、玄参、川明参、半夏等作物茎叶根系提取物、根系分泌物及其组合对烟草炭疽病菌的抑菌效果.结果表明:1)大蒜、玄参、川明参、半夏的茎叶和根系提取物对烟草炭疽病菌都有不同程度的抑制作用,抑制作用随提取物浓度增大而增强;大蒜抑菌活性最强,其茎叶和根系抑制率在0.50g/mL时均达到100%,玄参次之,茎叶抑制率在0.25g/mL时最高达58.40%,根系在0.5g/mL时最高(57.20%),川明参和半夏抑制率不高;大蒜鳞茎抑菌活性强于茎叶,玄参茎叶抑菌活性强于根系;川明参茎叶、根系提取物组合增益效应明显;2)大蒜、玄参、川明参、半夏根系分泌物对烟草炭疽病菌均表现出一定的抑制作用,随根系分泌物浓度增大而增强,抑菌强度由大到小为大蒜,玄参,川明参,半夏;3)提取物和根系分泌物组合的抑菌性,玄参、川明参介于提取物组合与根系分泌物之间,半夏略有降低.得出大蒜、玄参、川明参有防控烟草炭疽病的应用潜力.     

炭疽菌属（Colletotrichum Cda）分类学研究──Ⅴ．产直形孢子的种

报道了河北省炭疽菌属（ＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍＣｄａ）产直型孢子的７个种。其中４个种为河北省新记录，它们是：球炭疽菌Ｃ．ｃｏｃｃｏｄｅｓ（Ｗａｌｌｒ．）Ｈｕｓｎｅｓ，壳皮炭疽菌（Ｃ，ｃｒａｓｓｉｐｅｓ（ＳＰｅｇ．）Ａｒｓ，毁灭炭疽菌Ｃ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｕｍＯ′Ｇａｒａ和芸苔炭疽菌Ｃ．ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍＳａｃｃ．ａｐｕｄＨｉｇｇｉｎｓ．文中有种的特征描述和检索表。     

梨轮纹病和炭疽病病原菌PCR检测

为建立梨轮纹病原菌和炭疽病病原菌的分子检测方法,根据GenBank上炭疽病原菌和轮纹病原菌不同种的ITS序列差异设计2对引物TJ1/TJ2和LW1/LW2,对2种病原菌菌株进行扩增,比较了常规PCR和巢式PCR的检测灵敏度,并对果园中接种梨轮纹病原菌的梨果实进行检测。结果表明,建立的PCR体系可分别从炭疽病原菌和轮纹病原菌菌株扩增出317 bp和325 bp的特异性条带,对其他相似或相近的病原真菌则无扩增条带。巢式PCR技术的灵敏度比常规PCR提高了约105倍,且可以在接种较低浓度(1 ml 10个)轮纹病原菌孢子液7 d后的梨果实组织中检测到病原菌。说明使用巢式PCR技术,可以准确、灵敏地监测梨轮纹病原菌在果园的种群消长动态。     

以Ypt1基因为靶标的致病疫霉菌Phytophthora infestans的分子检测

三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Ypt1)是一个与原癌基因Ras(Rat sarcoma)相关的基因,在酵母中,该基因编码一个与Ras相关GTP结合蛋白。为了研究以Ypt1基因为分子靶标的致病疫霉菌(P.infestans)检测技术,比较了30种卵菌Ypt1基因的序列,以该序列为靶标设计了1对针对P.infestans的特异性PCR引物Pi1/Pi2。试验结果表明,在供试的55种不同疫霉菌和真菌的144个菌株中,利用这1对引物只能从P.infestans基因组DNA中分别扩增出1条分子量为369 bp的特异性条带,这1对引物的检测灵敏度为100 pg。以疫霉菌Ypt1通用引物Yph1F/Yph2R结合这1对特异引物进行套式PCR扩增,使引物Pi1/Pi2的检测灵敏度提高了10倍,检测到10 pg的基因组DNA。通过套式PCR,引物Pi1/Pi2对游动孢子和卵孢子的检测灵敏度分别为3个游动孢子和1个卵孢子;以Pi1/Pi2引物,分别采用单轮PCR和套式PCR可检测马铃薯发病组织和病田土壤的致病疫霉。以上结果证明Ypt1基因适合作为疫霉菌分子检测靶标。采用以这1对特异引物建立的以PCR技术为基础的分子检测方法,可对田间土壤和发病植物组织中的P.infestans进行快速、灵敏的检测。     

西瓜炭疽菌核糖体基因ITS区段的克隆及序列分析

采用真菌核糖体基因转录间隔区域(ITS)通用引物,PCR扩增4个来自不同地方的西瓜炭疽病菌核糖体基因的ITS1和ITS2,并对PCR产物进行了克隆和序列分析.结果表明:西瓜炭疽病菌的ITS全长481 bp,其中ITS1长163 bp,5.8 S长153 bp,ITS2长165 bp,各碱基A、T、G、C的个数分别为110、106、118、147,GC含量为55.1%.用Mega3软件对此4个序列以及GeneBank中登录的炭疽属其他24个种的ITS1和ITS2聚类分析,结果显示:Colletotrichum 属可以分为13个聚类组,各聚类组间存在着一定的遗传多样性,其中Colletotrichum orbiculare、Colletotrichum lindemuthiana在ITS1、ITS2上都聚为一组,这就为用ITS作为靶序列来设计特异性引物将Colletotrichum orbiculare、Colletotrichum lindemuthiana与其他种分开提供了分子依据.     

广东菠萝心腐病病原鉴定

为了鉴定广东湛江地区菠萝心腐病病原菌,研究了病原菌的致病性、菌丝体及孢子囊等形态特征,分析了核糖体DNA-ITS序列同源性。结果表明,该病原菌属于疫霉属真菌,同源性分析显示,该菌与GenBank中烟草疫霉ITS序列的同源性达99%以上;采用烟草疫霉特异性引物进行PCR检测,结果确认该病原菌为烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)。     

刺盘孢属真菌PCR检测方法的建立

【目的】刺盘孢属(Colletotrichum)真菌是重要的植物病原菌,引起植物炭疽病。建立刺盘孢属真菌PCR检测方法。【方法】比对分析刺盘孢属及其近似属的ITS序列,设计刺盘孢属特异性引物,建立PCR扩增体系,验证引物的特异性和灵敏度。【结果】设计出刺盘孢属特异性引物ITS-c3/c4,建立了刺盘孢属常规PCR检测体系。建立的PCR体系能从刺盘孢属菌株中扩增出449 bp的特异性条带,刺盘孢属的近似属菌株未能扩增到条带。灵敏度试验可检测到DNA的浓度为2.2 pg/µL。【结论】用建立的PCR体系对炭疽病梨果实样品进行检测,可从发病组织中检测到刺盘孢属真菌。建立的PCR方法可靠、灵敏度高,能够快速、准确检测出刺盘孢属真菌。