甘蓝自交不亲和信号传导元件ARC1的体外表达及其与SRK相互作用验证

在甘蓝自交不亲和信号传导中ARC1和上游因子SRK之间可能存在相互作用。为进一步证实该相互作用,以甘蓝E1为材料,采用RT-PCR技术扩增ARC1的编码序列, 构建ARC1原核表达质粒pET43.1a-ARC1,转化宿主菌大肠杆菌BL21,通过SDS-PAGE检测该蛋白的表达。利用免疫共沉淀原理及pET43.1a-ARC1融合蛋白序列中的6×His标签与Ni⁺结合的特点建立了体外检测蛋白质相互作用的新方法, 并用该方法对ARC1与SRK的相互作用进行了检测。结果表明,在体外ARC1能与SRK相互作用并形成复合体,这为深入分析ARC1与SRK相互作用机理以及探讨ARC1与下游传导元件的相互作用提供了理论和技术基础。     

甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR以及其他分子生物学方法，以甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对MLPK基因进行扩增克隆，首次得到长度分别为1 615 bp和1 294 bp的基因片段。序列分析表明，甘蓝MLPK与芜菁MLPK的cDNA序列相似性达98%，前者的内含子数为4个，比后者少了3个；同时，在前者内含子中发现了不同于典型的GU-AG规则的新的序列，即第3、4个内含子5′端碱基是TA、CG，3′端碱基为CAGG、GT，推测甘蓝MLPK的mRNA具有独特的剪切机制。这为甘蓝自交不亲和分子机理研究提供了新内容。     

甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR以及其他分子生物学方法，以甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对MLPK基因进行扩增克隆，首次得到长度分别为1615bp和1294bp的基因片段。序列分析表明，甘蓝MLPK与芜菁MLPK的cDNA序列相似性达98％，前者的内含子数为4个，比后者少了3个；同时，在前者内含子中发现了不同于典型的GU—AG规则的新的序列，即第3、4个内含子5，端碱基是TA、CG，3′端碱基为CAGG、GT，推测甘蓝MLPK的mRNA具有独特的剪切机制。这为甘蓝自交不亲和分子机理研究提供了新内容。     

甘蓝KAPP编码基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR及其他分子生物学方法,以甘蓝基因组DNA、花蕾RNA和叶片RNA为模板,分别对甘蓝KAPP gDNA和KAPP cDNA进行扩增,分别获得3247bp的KAPP gDNA片段、1699bp的KAPP cDNA片段、1578bp的花蕾KAPP2 cDNA片段和1581bp的叶片KAPP2cDNA片段。对克隆的甘蓝KAPP gDNA和cDNA(结合报道的KAPPcDNA)进行比对表明,甘蓝KAPP基因包含11个内含子,均符合"GU-AG"剪接规则,并且克隆得到的KAPP cDNA序列与报道的KAPP cDNA序列有6处单个碱基的差异,但两者的氨基酸序列完全一致。然而花蕾KAPP2 cDNA、叶片KAPP2 cDNA片段与报道的KAPP cDNA序列相似性分别为85.2%和85.0%。这两个序列分别在590bp和593bp处较早出现一个无义突变引起的终止密码子。Blast分析表明,两基因编码的氨基酸序列与拟南芥KAPP氨基酸序列相似性最高,其次为甘蓝KAPP氨基酸序列。以已报道的8种植物KAPP的CDS及本实验所克隆的两个KAPP2序列构建分子进化树,获得序列与甘蓝KAPP序列聚为一支。结合比较作图及分子进化树,推测KAPP基因在甘蓝基因组上有两个拷贝,而笔者克隆到的KAPP2 cDNA序列是其中一个拷贝,是KAPP进化过程中突变失活的拟基因。     

甘蓝BoExo70A1与BoSEC3、BoExo84蛋白相互作用的酵母双杂交检测

Exo70A1是芸薹属作物柱头接受亲和花粉的必需因子,可能参与了干性柱头水分分泌和花粉水合过程。本文从自交不亲和甘蓝A1柱头c DNA中获取了Bo Exo70A1、Bo SEC3、Bo SEC10、Bo SEC15和Bo Exo84基因的编码序列,序列分析表明,Bo Exo70A1、Bo SEC3、Bo SEC10、Bo SEC15和Bo Exo84基因分别与At Exo70A1、At SEC3A、At SEC10、At SEC15B和At Exo84B基因的c DNA序列高度同源,其编码的5个蛋白均没有信号肽,Bo SEC3蛋白含有一个典型的EF-hand钙离子结合结构域。将Bo Exo84蛋白拆分为2个片段(Bo Exo84-N和Bo Exo84-C),并与Bo SEC3、Bo SEC10和Bo SEC15蛋白编码序列一起分别亚克隆至p GADT7质粒,Bo Exo70A1蛋白编码序列亚克隆至p GBKT7质粒,酵母双杂交检测结果表明,Bo Exo70A1蛋白能与Bo SEC3、Bo Exo84-N蛋白互作,但不能与Bo SEC10、Bo SEC15蛋白互作,这为深入探讨Bo Exo70A1蛋白乃至整个胞泌复合体在甘蓝干性柱头接受自花花粉排斥异花花粉过程中的作用机制提供了依据。     

甘蓝自交不亲和相关基因BoPUB9的克隆及表达分析

自交不亲和性(self-incompatibility,SI)是指植株的雌蕊对自身花粉和异体花粉进行识别从而抑制自身花粉萌发的特性, PUB (Plant U-Box)蛋白在植物抗逆及信号转导过程中起着重要的作用。本研究通过分析甘蓝自花授粉0～60min的柱头转录组数据,筛选到1个受自花授粉诱导上调表达的PUB蛋白编码基因BoPUB9。BoPUB9 cDNA序列长度为1368 bp, gDNA序列全长1720 bp,含有1个臂重复结构域和1个U-box结构域。荧光定量PCR结果显示, BoPUB9基因在甘蓝的不同组织中均有表达,在萼片中的表达量最高,花瓣、雄蕊、柱头表达量次之,在花粉花蕾中表达量相对较低,同GUS染色结果保持一致。BoPUB9基因在自花授粉0～30 min内快速上调表达, 15 min后为异花授粉后表达量的20多倍,在30min后达到差异最大,自花授粉后的表达量为异花授粉的40多倍。亚细胞定位结果显示,BoPUB9蛋白在细胞核和细胞质中均有表达,且BoPUB9蛋白在大肠杆菌中被成功诱导表达,相对分子质量为51 kD,与预测结果一致。酵母双杂交与poll-down结果显示...     

灯盏花ARC1基因的克隆及序列分析

本研究对灯盏花ARC1基因进行克隆及序列分析。根据实验室前期预测灯盏花的序列设计引物,以灯盏花花蕾为材料提取RNA作为模板,通过反转录(RT-PCR)扩增得到cDNA,作为PCR扩增的模板,将扩增的ARC1基因连接到p MD19-T上,阳性克隆经PCR检测后进行测序结果分析,得到2 199 bp的核酸序列。序列分析结果表明,该基因存在2个结构域,不存在内含子,编码733个氨基酸,其核酸序列的同源性达到64%以上,氨基酸序列同源性达61%。本研究首次从灯盏花中克隆出ARC1基因,为后期研究该基因提供理论基础。     

甘蓝型油菜隐性核不育两用系S45AB中与MS2Bnap基因同源片段的克隆及序列分析

以甘蓝型油菜隐性核不育两用系S45AB的可育株和不育株为材料, 提取减数分裂期与单核期的花粉mRNA, 反转录合成cDNA, 并以其为模板扩增花粉特异基因MS2Bnap. 结果减数分裂期能扩出产物, 而单核期无任何产物. 将减数分裂期的扩增产物克隆、测序. 同源性分析表明: 在S45AB上克隆的MS2Bnap基因与Gene Bank公布的拟南芥控     

禽脑脊髓炎病毒VP1基因植物表达载体的构建

以提取的禽脑脊髓炎病毒总RNA为模板,以P1和P2为引物,反转录为cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增.将扩增产物克隆pMD18-T载体中,获得重组质粒pMD18-T-VP1,PstⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR确认正确后,利用pMD18-T-VP1重组质粒为模板,以P3和P4为引物,经PCR扩增获得了大小约810 bp的产物.VP1基因和 pBI121植物表达载体用SmaⅠ和SacⅠ双酶切,经纯化后连接,再转化到EHA105农杆菌中,酶切和测序鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒pBI121-VP1,为进一步利用转基因植物生产VP1蛋白奠定了基础.     

甘蓝自交不亲和信号转导元件ARC1与EXO70A1的相互作用

从甘蓝型油菜与羽衣甘蓝柱头中克隆出ARC1与EXO70A1基因的编码区, 序列分析显示推导的甘蓝型油菜ARC1比羽衣甘蓝ARC1少编码2个氨基酸, ARC1蛋白在羽衣甘蓝与甘蓝型油菜中存在45个氨基酸的差异, 其序列相似度与一致性分别达到95.9%和93.9%; 推导的EXO70A1在两种植物中仅有6个氨基酸的差异, 其序列相似度与一致性分别达到99.4%和98.9%; EXO70A1蛋白在种内和物种间都保持着高度的保守性, 其保守的程度高于ARC1。应用酵母双杂交系统检测两种蛋白质的相互作用, 发现: 在二倍体酵母细胞中, 全长的ARC1与EXO70A1之间存在较强的相互作用, 能激活4个报告基因(ADE2、HIS3、AUR1-C和MEL1)的表达; 去除C-端(包括臂重复区) 316个氨基酸残基后的ARC1_N与EXO70A1之间表现出较弱的相互作用, 只能激活3个报告基因(ADE2、AUR1-C和MEL1)的表达, 表明ARC1的臂重复区可能并不位于ARC1与EXO70A1的互作界面的核心区段, ARC1的N-端结构域对ARC1-EXO70A1互作起关键作用; 同时发现不同ARC1-EXO70A1组合的互作强度相当, 其可能原因是ARC1和EXO70A1在甘蓝与甘蓝型油菜中存在的这些序列差异并未影响ARC1- EXO70A1互作界面的构象。     

甘蓝型油菜oleosin基因片段的克隆及序列分析

以油菜（Brassica napus）基因组DNA为模板,通过设计一对特异性引物,利用多聚酶链式反应（PCR）扩增获得oleosin基因片段。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明,该基因由878个碱基组成,含一个内含子,编码193个氨基酸。不计附加的18 bp凝血酶切割序列,与已报道的序列相比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为79.20%和91.21%。推测的氨基酸序列构成的蛋白质具有oleosin的基本结构特点,包含3个结构区域：两性N末端区（an amphipathic N-terminal region）,中心疏水区（a central hydrophobic domain）,两性C-末端区（an amphipathic C-terminal domain）。     

利用酵母双杂交法检测甘蓝SCR与SRK之间的相互作用

为深入研究甘蓝S位点受体激酶(SRK)和S位点富含半胱氨酸蛋白(SCR)间相互识别的分子机理,以具有典型自交不亲和性的甘蓝D3为材料,利用巢式PCR分别扩增SRK胞外域(eSRK)和SCR,通过酵母双杂交检测二者之间的相互作用。并利用同源重组技术将eSRK与GAL4报告基因DNA活化域融合(pGADT7eSRK)以及SCR与GAL4报告基因DNA结合域融合(pGBKT7SCR)。两种重组质粒分别转化酵母Y187和Y2HGold后未出现自激活现象。融合的二倍体酵母(pGADT7eSRK× pGBKT7SCR)能在选择性固体培养基(SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA)上生长,并且菌落呈蓝色。结果表明, eSRK与SCR蛋白能够相互结合, 为深入研究二者作用位点成功建立了一个技术平台。     

甘蓝自交不亲和基因MLPK与SSP的FISH定位

利用FISH技术, 对自交不亲和基因MLPK与SSP在甘蓝有丝分裂前中期染色体、减数分裂早粗线期染色体以及伸长DNA纤维等3种分辨率水平的靶DNA载体上进行物理定位。结果表明, 在有丝分裂前中期, MLPK探针信号位于一对近中着丝粒同源染色体的短臂中部, 距着丝粒的百分距离约为53.41±3.16;SSP探针信号位于一对具有随体的近端着丝粒同源染色体的长臂端部, 距着丝粒的百分距离约为78.36±4.26。综合3种载体上的FISH结果表明, MLPK与SSP在甘蓝染色体组中可能都只有一个同源序列座位, 具有在单倍体基因组中的单拷贝性。重复FISH杂交表明, MLPK与5S rDNA位于同一对染色体。依据Armstrong的核型分析标准, 初步判断MLPK与SSP分别位于甘蓝的2号和7号染色体, 与S位点不存在连锁关系。另从比较基因组学角度对定位结果进行了讨论。     

羽衣甘蓝泛素结合酶ubc7基因分离、原核表达及纯化

为分离羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)自交不亲和系(S13-bS13-b)泛素结合酶7(ubc7)基因,探讨Ubc7重组蛋白的原核表达及纯化。利用CTAB的方法提取羽衣甘蓝柱头总RNA,通过RT-PCR的方法分离ubc7基因,将编码ubc7基因的cDNA序列亚克隆到pET-14b原核表达载体中,将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS中,利用IPTG进行诱导表达,并通过Ni2+-NTA树脂进行亲和层析的方法纯化重组蛋白。结果表明,获得的Boubc7含有一个长度为501 bp的开放读码框,编码一个含有166个氨基酸残基的蛋白质。预测BoUbc7的相对分子质量约为18.7 kDa,理论等电点(pI)为5.35。利用IPTG诱导的细菌蛋白中,SDS-PAGE显示出在分子量大小23 kDa处有蛋白特异性的表达,这与预测的His6融合的BoUbc7蛋白分子量相符;利用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析纯化后,成功获得了BoUbc7融合蛋白。该试验分离了羽衣甘蓝ubc7基因,并通过原核表达系统获得了BoUbc7重组蛋白,为进一步分析其生物学功能奠定了基础。     

鸡贫血病毒VP1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a( )载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。