腰带长体茧蜂cDNA文库的构建

从寄生在亚洲玉米螟 (Ostriniafurnacalis)幼虫体内 6d的腰带长体茧蜂 (Macrocentruscingulum)胚胎中提取总RNA和mRNA ,用分离到的微量mRNA合成cDNA第 1链。通过长距离PCR扩增得到足够量的双链cDNA。将SfiⅠ酶切后并纯化的cDNA片段连接到经SfiⅠ酶切的噬菌体λTripIEX2上 ,并对噬菌体进行包装 ,建成cDNA的全长库。经大肠杆菌XL1 Blue平板检测 ,未扩增文库的滴度为 0 75× 10 6pfu·mL-1,克隆重组百分率为 96 77% ,扩增后文库的滴度为 0 5×10 10 pfu·mL-1。     

东北梅花鹿鹿茸尖端组织全长cDNA文库的构建

为克隆出与鹿茸生长发育相关基因的全长序列,采用SMART技术构建了东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库.用SV Total RNA Isolation System试剂盒提取总RNA,以逆转录酶PowerScriptTM 反转录合成第一链cDNA,然后通过LD-PCR合成并扩增ds cDNA.扩增产物经纯化、SfiⅠ酶切、过CHROMA SPIN-400柱去除小片段后,连接到SfiⅠ消化过的pDNR-LIB质粒载体中,最后用电转化法将重组质粒转化到E. coli DH5α内得到原始文库.经测定,构建的原始文库约含有2.56×10~6个重组子,插入片段多在0.5～2kb之间,平均插入片段长度约1.1kb,重组效率接近100%.结果表明,东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库已构建成功.     

天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建

以天山雪莲(Saussurea involucrataKar.et Kir)幼嫩叶片为研究材料,利用CreatorTMSMARTTMcD-NA Library Construction技术构建了天山雪莲叶片全长cDNA文库,原始文库滴度达3.93×105cfu/mL,文库插入片段多在1 000 bp左右。随机挑取10个克隆进行测序,通过生物信息学初步分析表明,100%为全长cDNA,大部分可以在GenBank中找到同源序列。天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建为雪莲基因资源保存和植物抗寒机理的研究奠定了基础。     

T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库的构建

为筛选遗传背景清晰、裂解性能优良、宿主识别谱广泛的噬菌体用于抗菌产品开发,满足畜禽减抗、无抗养殖需求,通过易错PCR技术定向改变T7噬菌体尾丝蛋白羧基末端基因序列,并构建T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库,为筛选识别不同宿主的T7噬菌体奠定基础。提取T7噬菌体基因组,用SfiⅠ进行单酶切,回收SfiⅠ位点左侧基因组。常规PCR扩增尾丝蛋白羧基末端基因序列(TF-ct,约350 bp)以及gene17至T7基因组右侧末端基因序列(约4 000 bp)。以回收的TF-ct片段为模板,进行易错PCR扩增,将随机突变的TF-ct基因片段连接T载体,构建质粒文库。从质粒文库中用SfiⅠ/SphⅠ双酶切出TF-ct片段,并与SfiⅠ位点左侧基因组片段、gp17右侧基因组片段进行连接,利用包装蛋白拯救出T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库。结果易错PCR成功扩增TF-ct基因片段,并连接T载体构建质粒文库;同时随机突变的基因正确插入T7噬菌体基因组相应位置,成功拯救出尾丝蛋白定向进化T7噬菌体文库。从噬菌体文库中随机挑选15个克隆进行序列分析,目的基因的突变率在1.23%～2.16%;尾丝蛋白loop区域的氨...     

鲤脑组织cDNA文库的构建及鉴定

用Gubler—Hoffman法构建了耐低温鲤Cyprinuscarpio脑组织全长cDNA文库,经测定库容量为5．7×10^5cfu／mL,文库的重组率接近95％,平均插入片段长度为1500bp,符合文库保存和筛选实验的要求。同时,根据鲤与低温相关的消减eDNA文库中低温下特异表达基因的片段序列,设计了PCR引物,并在此eDNA文库中进行PCR检测和序列测定。使用BLAST软件将测序的10个cDNA序列同GenBank等数据库进行比对,结果显示,8个阳性克隆有相关同源性,2个克隆为功能未知的基因,全长率接近75％。     

牛促卵泡激素基因克隆筛选和序列分析

从牛垂体中分离出总mRNA,经逆转录酶及大肠杆菌DNA聚合酶合成双链cDNA,经T4DNA聚合酶切成平末端后与Sma I酶切的pUC19连接,转化JM83,构建了脑垂体mRNA的cDNA文库.用标记的牛促卵泡激素基因的寡核苷酸片段进行杂交,从文库中筛选到几个阳性克隆,其中一个含有全长的牛促卵泡激素基因编码序列.利用PCR扩增技术从cDNA中扩增出了387bp的牛促卵泡激素基因,序列分析表明,10号克隆中的牛促卵泡激素基因含有起始密码ATG及终止密码TAA,所编码的氨基酸序列与天然牛促卵泡激寡素的氨基酸序列相同.     

PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库的构建及鉴定

[目的]构建PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库,为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础.[方法]分离纯化PK15细胞mRNA,先后合成第一链和第二链cDNA,经平末端修饰后,定向导入EcoRⅠ和Hind Ⅲ接头,再由EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切消化,与噬菌体载体臂相连,然后用噬菌体包装抽提物进行体外包装,形成初级cDNA T7噬菌体展示文库,并通过滴度测定和PCR鉴定文库质量.[结果]经噬斑试验鉴定,初级文库滴度为2.0×105 PFU/mL,扩增后滴度达6.0× 1010 PFU/mL.PCR鉴定结果显示,文库的重组率为95.83%,且插入片段主要分布于500~2000 bp,其中500~750 bp的占21.73%,750~100 bp的占21.73%,1000~2000 bp的占39.13%.随机挑选20个克隆进行测序,发现均为猪源序列.[结论]构建的PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库具备较高库容量和重组率,质量良好,符合后续文库筛选的要求,可用于研究猪源病毒蛋白与PK15细胞的相互作用.     

紫杉醇合成途径中紫杉烯合成酶cDNA的克隆

从南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）愈伤组织提取总RNA，根据已发表的中国红豆杉紫杉烯合成酶cDNA序列设计两对引物，通过RT-PCR技术扩增出该酶5’端长度为1201bp和3’端长度为1388bp的两个cDNA片段，将其克隆到pGEM-T Vector上并转化到E. coli DH5α中， 5’端片段经XbaⅠ和BglⅡ双酶切鉴定，3’端片段经BglⅡ和SacⅠ双酶切鉴定后，对阳性克隆进行序列测定，证实确为紫杉烯合成酶基因。将这两个cDNA片段拼接到一起，得到全长2589 bp的紫杉烯合成酶基因，编码862个aa，与中国红豆杉紫杉烯合成酶基因具有98%的同源性。两片段与双元载体pCAMBIA1300以T4 DNA连接酶连接并转化到E. coli DH5α中，经XbaⅠ和SacⅠ双酶切鉴定，证实紫杉烯合成酶cDNA全长连接成功并插入到pCAMBIA1300中，为下一步的转基因工作做好了准备。     

索式桃花水母全长cDNA文库的构建

[目的]构建索式桃花水母的全长cDNA文库,为桃花水母的生长、发育、衰老过程功能基因的进一步筛选、克隆和表达奠定基础。[方法]利用RNAiso试剂盒提取桃花水母的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,经SfⅠi酶切消化后,将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,并对cDNA文库进行质量评价。[结果]经鉴定,原始文库的滴度为7.9×10^5cfu/ml,库容量约为1.0×10^6cfu。随机挑取28个克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.5～2.5kb,平均大小在1.0kb左右,重组率达94%,表明获得了高质量的桃花水母cDNA文库。[结论]该试验成功构建了桃花水母cDNA文库,其cDNA原始文库的库容,根据真核生物能够满足建库的要求,同时文库的cD-NA插入片段序列是完整的,从而证实构建的文库质量较好,可以用于桃花水母目的基因的筛选。     

干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库构建及EST序列分析

[目的]构建甘蔗根系全长cDNA文库,并进行测序,为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础.[方法]在干旱胁迫条件下,以新台糖22号甘蔗根系为材料,采用SMART技术构建cDNA文库,并进行EST序列分析.[结果]文库构建质量鉴定结果显示,文库库容量为1.0×106 PFU/mL,重组率约95%,文库插入片段长度在500~2000 bp,平均长度约1102.1 bp.挑选526个阳性克隆进行单向测序后,共获得523个ESTs序列,去除载体、接头序列以及长度低于100 bp的序列后,进行聚类分析并组装,共得到468个Uni-ESTs,其中congtig 29个,singlets 439个,分别占总数的6.5%和93.5%.通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对,发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列,占94.87%;获得24个未知蛋白功能基因,占5.13%.[结论]构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库,获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs,并获得一批新的未知蛋白功能基因.     

策略构建小黑杨茎形成层全长cDNA文库

为了研究小黑杨木材形成过程中的关键基因,以2年生小黑杨茎形成层组织为试验材料提取RNA,采用SMART (RNA 转录过程中的5′末端转换机制) 技术合成cDNA第一链,通过LD-PCR合成双链cDNA。利用SfiⅠ限制性酶酶切后将其连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,构建全长cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.18×106 pfu/mL,扩增后的文库滴度为5.46×109 pfu/mL,重组率为96%。插入片段长度在0.5～2.0 kb之间,平均长度为1.12 kb,表明构建的小黑杨茎形成层cDNA文库较为理想。      

PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库的构建及鉴定

【目的】构建PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库,为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础。【方法】分离纯化PK15细胞mRNA,先后合成第一链和第二链cDNA,经平末端修饰后,定向导入EcoR Ⅰ和HindⅢ接头,再由EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消化,与噬菌体载体臂相连,然后用噬菌体包装抽提物进行体外包装,形成初级cDNAT7噬菌体展示文库,并通过滴度测定和PCR鉴定文库质量。【结果】经噬斑试验鉴定,初级文库滴度为2．0×10^5PFU／mL,扩增后滴度达6．0×10^10PFU／mL。PCR鉴定结果显示,文库的重组率为95．83％,且插入片段主要分布于500-2000bp,其中500～750bp的占21．73％,750～100bp的占21．73％,1000-2000bp的占39．13％。随机挑选20个克隆进行测序,发现均为猪源序列。【结论】构建的PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库具备较高库容量和重组率,质量良好,符合后续文库筛选的要求,可用于研究猪源病毒蛋白与PK15细胞的相互作用。     

一种构建全长cDNA文库的方法

建立了一种以LD-PCR为基础的cDNA文库的快速构建方法.以人胎盘组织为材料获得总RNA,利用引物F1、R2在逆转录酶M-MLV的作用下合成cDNA第1链,进而利用引物F3、R4在DNA聚合酶的作用下通过LD-PCR方法合成cDNA第2链;双链cDNA经SfiⅠ酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同酶切的JG45质粒载体后构建成cDNA文库,并对文库的容量、重组率以及多样性进行了分析.结果表明,通过该方法构建的cDNA文库容量约为7.01×105 个/μgds-cDNA,重组率为96%;对随机提取的100个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得80个不同的cDNA序列,且未见重复序列.该法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的基因分析.     

新疆雪莲组织培养体系的优化

以新疆雪莲无菌苗的根、茎、叶为外植体,对各种不同激素配比条件下新疆雪莲的再生体系进行了探讨,结果表明:培养基MS+6-BA 0.1 mg/L + NAA 2.0 mg/L对愈伤组织诱导效果较好;而再生芽的诱导培养基为MS+6-BA 0.4 mg/L + NAA 0.05 mg/L+水解乳蛋白500 mg/L;生根培养基为1/4MS + NAA 0.3 mg/L.     

抗黑胫病烟草品种K326 cDNA文库的构建*

 以优质高抗黑胫病的烟草品种K326为材料,在苗期接种黑胫病菌丝,3d后取叶片用Trizol试剂提取总RNA,经电泳检测28S,18S条带清晰,无DNA污染。以总RNA为模板,采用SMART技术合成双链cDNA,其产物主要集中在0.5～3kb之间,最大片段超过3kb。合成的双链cDNA经SfiⅠ（A/B）酶酶切后,用CHROMA SPIN-400层析柱分离分级cDNA,将大于0.5kb的cDNA片段混合,载入λTriplEx2载体,构建成云南第一个烟草cDNA文库。该文库的大小为1.2×10⁷pfu。扩增文库的滴度达到1.2×10⁹pfu/mL。文库的重组率大于94%。取阳性克隆转化为质粒,通过PCR反应检测,重组体确有DNA插入, 其片断大小在0.5～1kb之间。     

晚疫病诱导的番茄叶片cDNA文库构建及序列分析

以番茄抗病品系(CLN2037E)为研究材料,应用SMART技术构建晚疫病诱导的番茄叶片cDNA表达文库,并进行生物信息学分析。成功构建的cDNA文库的克隆数为2.3×109,重组率为96%,通过PCR检测,插入片段范围在0.1~2.0 kb之间。从文库中随机挑取110个克隆进行测序,最终得到107条差异表达ESTs序列。GenBank提交的序列号为GT742146-GT742150;GT865998-GT866099。利用BLAST进行同源性分析:75条ESTs与其他物种同源性较高,视为已知基因,功能涉及能量代谢的占42.7%、细胞内生命活动与信号传导的占10.7%、基因转录和翻译的占9.3%以及与抗性相关的占25.3%;另有32条ESTs无同源序列或同源性较低,预测是一些未知功能基因的占30%。本项研究应用SMART技术成功构建了高质量、信息丰富的晚疫病诱导的番茄叶片cDNA文库,为进一步筛选抗病相关候选基因奠定了基础。