牛蛙（Rana catesbeiana）皮肤抗菌肽的cDNA克隆及序列分析

为了解牛蛙皮肤抗菌肽的多样性及结构特点,根据GenBank数据库中蛙属抗菌肽基因信号肽序列设计简并引物,以RT-PCR技术扩增牛蛙皮肤抗菌肽基因,克隆得到cDNA全长序列并进行测序和序列分析。用生物信息学软件分析其cDNA序列特点,预测成熟肽的理化性质。结果得到48个完整的cDNA序列,分别编码24种抗菌肽前体,它们均由信号肽、前导肽和成熟肽3部分组成。对序列测定结果的预测分析表明,牛蛙皮肤抗菌肽前体核苷酸序列与已报道的其他蛙类抗菌肽具有较高的同源性,同源性达到80%以上,但成熟肽的序列变异很大,具有物种特异性,其中6个为新的抗菌肽序列。牛蛙皮肤抗菌肽成熟肽的二级结构主要以α-螺旋和β-折叠为主,均为疏水性短肽。     

养殖密度对黑斑侧褶蛙生长发育的影响

为提高黑斑侧褶蛙(Pelophylax nigromaculata)养殖效益,探究养殖密度对黑斑侧褶蛙生长发育及两性异形的影响,对3种养殖密度(140,80,55只/m~2)的黑斑侧褶蛙的生长发育进行了比较研究。结果表明:不同养殖密度对黑斑侧褶蛙形态特征的影响显著,85日龄时不同养殖密度蛙的体长、体质量、头宽、前肢长、后肢长出现极显著差异(P<0.01),胫宽和肥满度差异显著(P<0.05),中等养殖密度蛙的各形态学指标显著高于其他养殖密度蛙的形态学指标,中、高养殖密度蛙的肥满度显著高于低养殖密度蛙的肥满度。不同养殖密度的黑斑侧褶蛙的饵料系数差异不显著(P>0.05),特定生长率差异显著(P<0.05),摄食率和质量增加率差异极显著(P<0.01),中等养殖密度蛙的特定增长率、质量增加率较其他两组养殖密度蛙的特定增长率、质量增加率高,低养殖密度蛙的摄食率较其他两组密度蛙的摄食率高。中、高养殖密度黑斑侧褶蛙两性异形(体长、体质量)出现时间较低密度蛙的早,雌雄体长、体质量的差异极显著(P<0.01),雌性体长、体质量均显著大于雄性。以体长为协变量的协方差分析头宽、前肢长、胫宽、后肢长局部性状的两性差异均不显著(P>0.05)。     

广东省部分地区食用蛙类曼氏裂头蚴感染情况调查

为了解广东省食用蛙类曼氏裂头蚴感染情况,2013年—2015年,从广州、肇庆和韶关等地区农贸市场共采集虎纹蛙、黑斑侧褶蛙、泽陆蛙、沼蛙和棘胸蛙等5种常见食用蛙样本1 304只,并对这些蛙类样本的曼氏裂头蚴感染情况进行剖检。结果显示,曼氏裂头蚴感染个体148只,总感染率为11.35%,共发现裂头蚴553条;沼蛙、黑斑侧褶蛙、泽陆蛙、虎纹蛙和棘胸蛙的感染率分别为3.61%、13.68%、3.11%、25.59%和2.93%;个体平均感染强度分别为1.44、3.41、1.43、4.48、1.16条/只;肌肉、体腔和皮下组织三个部位的寄生率分别为89.69%、6.87%和3.44%。结果表明,广东省食用蛙类曼氏裂头蚴感染比较普遍,对蛙类消费人群的健康构成潜在威胁。     

鸽泛素结合酶蛋白(UBE2)基因的生物信息学分析

在鸽脑垂体全长cDNA文库构建成功和泛素(Ubiquitin,UB)和泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,UBE2)基因全长cDNA克隆成功的基础上,通过生物信息学方法对UBE2基因序列进行分析.预测UBE2基因编码蛋白的理化特性、功能域、二级结构及三级结构等.该序列的GenBank登录号为Eu914824.UBE2基因编码的蛋白为胞内蛋白,其二级结构预测结果中α螺旋约占26.39%、β延伸链约占18.75%、无规则卷曲约占54.86%.通过对UBE2基因的cDNA序列并对其进行的生物信息学分析,结果有望能为UBE2相关功能研究提供理论参考.     

新疆哈萨克绵羊MHC Ⅰ类分子基因的克隆与生物信息学分析

为了研究新疆哈萨克绵羊主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子基因序列的多态性,采用PCR和测序的方法分别克隆新疆哈萨克绵羊MHCⅠ类分子基因重链和轻链的c DNA全长,并进行生物信息学分析。结果表明:成功扩增出新疆哈萨克绵羊MHCⅠ类分子基因重链、轻链,大小分别为1 107 bp、357 bp;通过生物信息学软件预测蛋白质分子质量分别为90 ku和29.694 ku;等电点(p I)分别为5.00,5.23;重链富含G、C碱基,有两段跨膜螺旋,最大疏水指数为3.622,最小疏水指数为-2.922,预测整条肽链表现为亲水性,在1~84位碱基之间存在信号肽;轻链四种碱基含量基本一致,也有两段跨膜螺旋,在1~63位碱基之间存在信号肽。新疆哈萨克绵羊MHCⅠ类分子基因编码蛋白质的二级结构以无规则卷曲元件的含量最高,该蛋白质的三级结构由一条α链,另一条为β链通过非共价键组成,由α1、α2组成抗原结合槽;NCBI数据库中不同地区的哈萨克绵羊的MHCⅠ类分子基因的同源性在89.87%~99.91%之间,与数据库中牛的MHCⅠ类分子基因同源性达到了98.88%,轻链MHCⅠ类分子基因还与猪和人的同源性相对较高。     

牛源防御素类抗菌肽的生物信息学分析

为研究牛源防御素类抗菌肽的生物学功能,本研究利用Prot Param工具分析了抗菌肽的理化性质,利用SOPMA分析了抗菌肽的二级结构,利用NetOGlyc 4.0 Server分析了抗菌肽的糖基化,利用NetPhos 3.1 Server分析了抗菌肽的磷酸化,利用Target P 1.1 Server分析了抗菌肽的亚细胞内定位。结果表明,牛源防御素类抗菌肽为阳离子型抗菌肽,等电点在9.31~11.20之间;TAP、bBD-1、BNBD2、BNBD3、BNBD7、BNBD8和BNBD9为稳定性多肽,其他牛源防御素类抗菌肽为不稳定多肽;BNBD12和BNBD13为疏水性多肽,其他牛源防御素类抗菌肽为亲水性多肽;TAP、LAP、b BD-1、BNBD2、BNBD3、BNBD4、BNBD6、BNBD7、BNBD8和BNBD10由α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲构成,EBD、BNBD1、BNBD5、BNBD11、BNBD12和BNBD13由β折叠、β转角和无规则卷曲构成;没有糖基化位点,除了BNBD7不存在磷酸化位点外,其他16种防御素类抗菌肽存在丝氨酸和苏氨酸的磷酸化位点,但不存在酪氨酸的磷酸化位点。根据分析结果推测牛源防御素类抗菌肽可作用于细胞壁或细胞膜,从而导致细菌死亡。     

中国林蛙皮肤抗菌肽基因的cDNA克隆

抗菌蛋白蛙皮抗菌肽，是两栖类动物中存在的天然免疫物质，在蛙类中仍然保持着一定的活性。我们用提取中国林蛙皮肤总RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增得到DNA片段，并与GenBank上登陆的其他蛙类的皮肤抗菌肽序列进行比较，发现此序列是一个新的蛙皮肤抗菌肽序列。PCR产物与pMD18-T连接，得到阳性重组体pMD18-RTCD。将阳性重组体进行测序，分析蛙皮素的氨基酸序列，显示它属于蛙皮抗菌肽家族。此外，中国林蛙抗菌肽氨基酸序列包含C-末端残基，同时具有两栖类动物抗菌肽的特征。这些信息对将来研究两栖类动物的天然免疫的分子机制具有重要作用。为应用基因工程技术对我国林蛙抗菌肽基因进行克隆表达奠定了基础。     

蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的生物信息分析

文章旨在探究蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的生物学功能,利用在线生物信息学软件对蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的特性进行分析。结果显示,蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1由25氨基酸组成,为阳离子型多肽,二级结构中主要包含α-螺旋和少量β结构及无规则卷曲,理论等电点为9.99,净电荷为+2,具有较好的稳定性,呈疏水性,为细胞内表达,具有3个磷酸化位点。研究表明,对蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的预测分析可为天然抗菌肽改造以获得稳定安全的抗生素替代品提供信息学基础。     

牛血红蛋白源抗菌肽P3及其类似肽的生物信息学分析

为研究牛血红蛋白源抗菌肽P3及其类似肽（JH-0、JH-1、JH-2、JH-3）的生物学功能,本研究利用在线软件分析了抗菌肽P3及其类似肽的生物信息学特性,发现这5个抗菌肽均带正电荷,等电点均大于8.00,均为疏水蛋白,定位于细胞外,不含有跨膜区、信号肽序列和糖基化位点,P3和JH-2的二级结构为α-螺旋+β-折叠,JH-3为100%的α-螺旋,JH-0和JH-1为无规则卷曲结构,P3、JH-2和JH-3在第13位氨基酸即苏氨酸（Thr,T）有一个糖基化位点。根据分析结果推测抗菌肽P3及其类似肽可作用于细胞壁或细胞膜,从而使菌体死亡。     

扩展莫尼茨绦虫α-tubulin基因的克隆及序列分析

分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。利用构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测。获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因α-tubulin,全长1522bp,编码225个氨基酸,CDS预测属于Tubu-lin_FstZ超家族。编码蛋白的理论分子质量为25808.6KDa,等电点为9.15。获得了扩展莫尼茨绦虫α-tubulin的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础。     

牦牛低氧诱导因子-1α基因克隆及蛋白质结构分析

试验采用RT-PCR方法,以麦洼牦牛脾脏cDNA为模板扩增牦牛低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因,并运用生物信息学软件对其序列进行分析。结果发现,扩增得到的麦洼牦牛HIF-1α基因编码区长为2 472 bp,编码823个氨基酸;蛋白质预测结果显示,该蛋白质分子质量为92.13 ku,等电点5.09,为亲水性蛋白,二级结构以随机卷曲和α-螺旋为主,有69个磷酸化位点和4个N-糖基化位点;系统进化树显示,麦洼牦牛与牦牛、野牦牛、普通牛亲缘关系最近。本试验成功克隆麦洼牦牛HIF-1α基因并对其序列进行了分析,为进一步研究HIF-1α基因的功能提供参考。     

五指山小型猪PDCD10 cDNA的克隆及生物信息学分析

为了克隆五指山小型猪程序性死亡因子10(PDCD10)cDNA基因并进行生物信息学分析,试验以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR的方法,克隆得到PDCD10全长cDNA序列,运用生物信息学软件分析其核苷酸序列并预测其编码蛋白的理化性质及二级结构等。结果表明:经比对分析发现,五指山小型猪PDCD10基因的核苷酸序列及其氨基酸序列与人、小鼠、牛、鸡、非洲爪蟾、斑马鱼、黑腹果蝇等具有较高的相似性。生物信息学分析结果表明,该cDNA序列全长1 250 bp,在序列3’末端有终止信号AATAAA。含636 bp(184～819 nt)的开放阅读框,编码212个氨基酸。该蛋白理论等电点(PI)及分子质量分别为7.80和24 701.57 u。     

大片吸虫组织蛋白酶L全长序列的获取及其生物信息学分析

根据文库载体序列与原组织蛋白酶表达序列标签（EST）设计引物,以大片吸虫cDNA文库为模板,进行Touchdown PCR与梯度PCR相结合的扩增反应,扩增产物克隆人pMD18-T载体。经鉴定后测序,并采用生物信息学技术对序列进行开放阅读框（ORF）、编码氨基酸序列、蛋白质同源性比较、二级、三级结构等分析;结果所获序列全长990bp,编码330个氨基酸,分子量36771.2u,等电点5．44;具有较明显的螺旋、片层和无规卷曲等二级结构,α螺旋占17．3％,β折叠占27．0％,无规卷曲占55．8％;具有2个较明显的跨膜区和2个疏水区,未发现明显的信号肽和糖基化位点;氨基酸序列同源性比对显示其属于半胱氨酸家族;三级结构同源建模预测显示其与组织蛋白酶K（PDB number 2f7dA）有49％的一致性。     

五指山小型猪DAZAP2 cDNA的克隆及其生物信息学分析

为了克隆五指山小型猪DAZ相关蛋白2(DAZAP2)cDNA全长并进行生物信息学分析,试验以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法克隆得到DAZAP2全长cDNA序列,并运用生物信息学软件对其核苷酸序列进行分析,预测其编码蛋白的理化性质及二级结构等。结果表明:五指山小型猪DAZAP2基因的核苷酸序列及其氨基酸序列与人、苏门达腊猩猩、斑马鱼、非洲爪蟾、牛、褐家鼠等动物具有很高的相似性。DAZAP2 cDNA全长943 bp,5’非翻译区长69 bp,3’非翻译区长367 bp,含有1个完整的开放阅读框,编码168个氨基酸。该蛋白的分子质量为17 311 ku,等电点为7.48。     

杂合肽Melitten-cathelicidin_BF的生物信息学分析

[目的]为了深入研究杂合抗菌肽Melitten-cathelicidin_BF的理化性质,为抗菌肽开发利用提供新的思路。[方法]本研究将蜂毒肽（Melitten）和金环蛇抗菌肽（Cathelicidin_BF）进行融合构成新的多肽,利用在线生物分析软件进行了全面系统的生物信息学分析。[结果]杂合肽Melitten-cathelicidin_BF一级结构,含有56个氨基酸残基,包括14种氨基酸,分子量为6.47 kDa,理论等电点为12.20,为亲水性蛋白,有5个糖基化和2个磷酸化修饰位点。二级结构主要元件为α螺旋和无规则卷曲。[结论]该杂合肽无信号肽、无跨膜区,且该杂合肽为阳离子肽,该杂合肽为蛋白酶抑制剂类肽。     

Retinoic Acid Receptor α and Retinoic Acid Receptor γ in Lateolabrax japonicas : cDNA Cloning and Gene Expression Analysis

本文旨在研究鲈鱼视黄酸受体α(RARα)和视黄酸受体γ(RARγ)的结构及其基因的组织表达特点.采用反转录PCR和cDNA末端快速克隆(RACE)技术,从鲈鱼肝脏中克隆得到RARα和RARγ全长cDNA序列.检测鲈鱼肝脏、肌肉、心脏、眼、肠、肾脏、脂肪、脾脏、鳃和大脑10个组织中RARα和RARγ基因的表达情况.结果表明:1)鲈鱼RARα cDNA全长2 094 bp,5 ′端和3 ′端的非翻译区分别为124和608 bp,开放阅读框为1 362 bp,推测编码453个氨基酸,分子质量为50.64 ku,理论等电点为8.20.2)RARγcDNA全长1 671 bp,其中包括36 bp的5′端非翻译区、129 bp的3′端的非翻译区和1 506 bp的开放阅读框,共编码501个氨基酸,分子质量为56.20 ku,理论等电点为4.96.3)鲈鱼RARα和RARγ都具有典型的核受体结构,两者氨基酸序列同源性高达63.1％.鲈鱼的RARα和RARγ与红鳍东方鲀有较高的同源性,分别为96.9％和95.2％.4)RARα和RARγ基因在所有检测组织中均有表达,其中RARα基因在心脏和大脑中表达较少,在眼、鳃和肠中表达较高,而RARγ基因仅在鳃和脾脏中有较高表达.总之,本试验成功克隆了鲈鱼RARα和RARγ的全长cDNA;鲈鱼RARα和RARγ有着典型的核受体结构,在各组织中广泛分布.     

棘腹蛙TNFα基因的克隆与序列分析

为了解棘腹蛙TNFα基因的相关信息,对棘腹蛙的TNFα基因进行了克隆和序列分析。克隆了全长为936 bp、ORF长度为675 bp的TNFα-Pb基因;对该基因的蛋白质结构分析显示,TNFα-Pb的信号肽由44个氨基酸组成,随后由2个α螺旋,和10个β折叠形成小分子蛋白;系统进化分析发现,TNFα-Pb与两栖类聚为一枝,与高等哺乳动物存在功能分化的可能。本研究为了解棘腹蛙的生物反应调节机制奠定了一定基础。     

黑斑蛙胰岛素样生长因子-2原核表达载体构建

胰岛素样生长因子-2(IGF-2)是介导生长激素发挥生物学功能的重要因子,在动物机体的生长发育中具有重要作用。为对黑斑蛙IGF-2基因进行原核表达,本研究针对转录组数据中的黑斑蛙IGF-2序列,设计引物扩增IGF-2的完整基因,获得了全长为944 bp、ORF长为651 bp的序列;随后在黑斑蛙IGF-2的ORF两端添加限制性内切酶位点后亚克隆到p ET-32a(+)质粒中,构建了黑斑蛙IGF-2的原核表达载体。为获得黑斑蛙IGF-2的表达产物并探究其生物学作用奠定了基础。     

鸡抗菌肽NK-lysin的生物信息学分析

为了解鸡内源性抗菌肽NK-lysin的基本信息,试验选择鸡NK-lysin的氨基酸序列通过软件对NK-lysin的生物信息学进行了分析。结果表明:NK-lysin的等电点为5.87,分子质量为15 231.3 u,为稳定蛋白和亲水蛋白,定位于细胞质内,有1个跨膜区和1个信号肽,没有糖基化位点,但有2个磷酸化位点,二级结构由α螺旋、延伸链、β折叠和无规则卷曲组成,存在多个抗原表位。说明鸡抗菌肽NK-lysin可作用于细胞膜或某些生物分子,使菌体死亡。     

基于线粒体DNA Cyt b研究城市化对上海金线侧褶蛙遗传结构的影响

城市化在全球范围内快速扩张,已经成为影响物种进化的重要力量。两栖动物的迁移能力较弱,城市化导致两栖类被完全或部分的隔离,丢失更多的遗传多样性。本研究对上海市的金线侧褶蛙(Pelophylax plancyi)的mtDNA Cyt b部分序列进行分析,共扩增出235条序列,获得61个单倍型。研究表明城市区域遗传多样性较低,上海市的金线侧褶蛙分化程度处于中低的水平(Max F_ST=0.296;Min F_ST=0.004),各种群之间遗传分化有限。黄浦江及其支流可能作为水上扩散通道,有助于基因交流,各城市公园之间的遗传分化差异并不显著;而长江阻碍了种群之间的交流,城市公园和郊区,以及岛屿种群之间的遗传分化显著。此外,单倍型网络和系统发育分析表明,上海的金线侧褶蛙并没有对应城市化程度形成相应的单系。